徐鋼+孫娜+趙敏杰+鞠成國+賈天柱

[摘要]該研究比較了生狗脊、酒狗脊、鹽狗脊、燙狗脊和蒸狗脊的水煎液HPLC圖譜，在此基礎(chǔ)上，以砂燙骨碎補(bǔ)水煎液為陽性組，又比較了各組灌胃水煎液（質(zhì)量濃度為104.2 g·L^-1）4周后對維甲酸致骨質(zhì)疏松雄性大鼠血清抗酒石酸酸性磷酸酶s-TRAP水平和作用機(jī)制指標(biāo)血清護(hù)骨素OPG，血Ca和P，IL-6，TNF-α和IL-1水平及總評分的影響。結(jié)果表明，酒狗脊和砂燙狗脊效果較好，而蒸狗脊、鹽狗脊以及生狗脊作用次之。在炮制方法的選擇方面，加熱方式中干熱的砂燙法優(yōu)于濕熱的水蒸法，輔料中黃酒優(yōu)于食鹽。該結(jié)果為闡明狗脊炮制原理和抗骨質(zhì)疏松癥作用機(jī)制提供參考。

[關(guān)鍵詞]狗脊；炮制品；水煎液；維甲酸；骨質(zhì)疏松癥；破骨細(xì)胞

中藥狗脊為蚌殼蕨科植物金毛狗脊Cibotium barometz（L.）J.Sm.的干燥根莖，味苦、甘，性溫，歸肝、腎經(jīng)，各炮制品包括生狗脊（凈制、切制）、燙狗脊、酒狗脊、蒸狗脊、鹽狗脊等均具有增強(qiáng)“補(bǔ)肝腎，強(qiáng)腰膝”的功效，在臨床上常用來治療骨質(zhì)疏松癥^[1-3]。已有研究表明狗脊及其炮制品對去卵巢致骨質(zhì)疏松雌性大鼠及促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、抑制破骨細(xì)胞活性均具有一定作用^[2-6]，其中，從成骨細(xì)胞角度研究較多，而其影響破骨細(xì)胞作用方面研究甚少。本研究從維甲酸致雄性大鼠骨質(zhì)疏松角度以整體動物為平臺，以影響破骨細(xì)胞為研究目標(biāo)，以檢測血清抗酒石酸酸性磷酸酶s-TRAP和計(jì)算作用機(jī)制指標(biāo)總評分為評價標(biāo)準(zhǔn)，深入探討其影響破骨細(xì)胞的作用效果和機(jī)制，并對狗脊各炮制品進(jìn)行比較，弄清各自的作用差別，以供生產(chǎn)及臨床靈活地辨別選用，同時為狗脊炮制原理的闡明和抗骨質(zhì)疏松癥作用機(jī)制提供參考。

1 材料

Waters e2695-2998高效液相色譜儀（美國Waters公司）；KES-21AS20型電陶爐（深圳市康佳電器有限公司）；FA1004B型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；單道彩色移液器（Thermo公司）；Multiskan MK3酶標(biāo)儀（Thermo公司）；TGL-16C型臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SHA-C恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司）。

SD雄性大鼠，體重180～220 g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，生產(chǎn)合格證號SCXK（遼）2008-0002；維甲酸（上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司，批號R0023，純度≥98%）；生理鹽水（黑龍江科倫制藥有限公司）；大鼠血清抗酒石酸酸性磷酸酶s-TRAP、白介素IL-6、血清中微量元素鈣（Ca）和磷（P）、血清護(hù)骨素OPG、腫瘤壞死因子TNF-α和白介素IL-1等7種血清ELISA試劑盒（上?？婆d貿(mào)易有限公司，批號201210）；其他試劑為色譜純或分析純。

生狗脊飲片和骨碎補(bǔ)飲片購自安徽省亳州市安東藥業(yè)，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為蚌殼蕨類科植物金毛狗脊C. barometz（L.）J.Sm.的干燥根莖以及水龍骨科植物槲蕨Drynaria fortunei（Kze.）J.Sm.的干燥根莖；特制黃酒（即墨市古城春酒廠）；食鹽（大連市鹽業(yè)公司）；純凈水；凈河砂等。

2 方法

2.1 給藥樣品的制備

2.1.1 狗脊不同炮制品及燙骨碎補(bǔ)的制備^[7-8]砂燙品：參照2010年版《中國藥典》，按照優(yōu)化的參數(shù)，取大小均勻、凈制過的狗脊片90 g，置8倍量河砂的鍋中加熱至滑利狀態(tài)（180～190 ℃），保持砂溫，下藥，邊炒邊埋，炒 6～7 min，出鍋篩去砂，晾涼，備用。

蒸制品：取大小均勻、凈制過的狗脊片90 g，置適宜容器內(nèi)，加入清水40 mL到其中拌勻，蓋保鮮膜，密閉浸潤。之后放入蒸鍋內(nèi)，武火蒸制4 h，?；鸷髳炛? h，取出干燥。

酒制品：取大小均勻、凈制過的狗脊片90 g，置適宜容器內(nèi)，按100∶15比例加入黃酒，并用清水稀釋至40 mL后，加入到狗脊片中拌勻，蓋保鮮膜，密閉浸潤。之后放入蒸鍋內(nèi)，武火蒸制4 h，?；鸷髳炛? h，取出干燥。

鹽制品：取大小均勻、凈制過的狗脊片90 g，置適宜容器內(nèi)，按100∶2加入食鹽，并用清水稀釋至40 mL后，加入到狗脊片中拌勻，蓋保鮮膜，密閉浸潤。之后放入蒸鍋內(nèi)，武火蒸制2 h，稍焗，取出干燥。

燙骨碎補(bǔ)（陽性組）：參照2010年版《中國藥典》，按照優(yōu)化的參數(shù)，取大小均勻、凈制過的骨碎補(bǔ)飲片90 g，置8倍量河砂的鍋中加熱至滑利狀態(tài)（180 ℃左右），保持砂溫，下藥，邊炒邊埋，燙1～2 min（毛微焦時），出鍋篩去砂，晾涼，撞去毛，篩凈備用。

2.1.2 灌胃藥液的制備 取狗脊各炮制品及燙骨碎補(bǔ)飲片，加10倍量水浸泡60 min后煎煮2次，每次1 h，濾過。合并濾液，濃縮濾液至質(zhì)量濃度為104.2 g·L^-1，即為臨床建議成人用量最大量換算為大鼠的用量^[8-9]。

2.2 狗脊各炮制品灌胃藥液的HPLC分析

Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相甲醇-1%冰醋酸溶液（5∶95），檢測波長254 nm，流速1.0 mL·min^-1，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。狗脊各炮制品HPLC圖見圖1。

2.3 動物分組、造模與指標(biāo)檢測^[10-11]

大鼠64只，于室溫25 ℃，濕度30%～50%，12 h光照/黑暗循環(huán)環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。隨機(jī)分為8組：空白組、模型組、陽性組、生品組、酒制品組、蒸制品組、砂燙品組、鹽制品組。每天上午，每組大鼠按10 mL·kg^-1（ig）給藥或生理鹽水；下午，除了空白組外，其他各組大鼠用1%羧甲基纖維素鈉配成的維甲酸混懸液按70 mg·kg^-1（ig）灌胃，空白組大鼠以1%羧甲基纖維素鈉（ig）灌胃，連續(xù)2周后停用維甲酸，繼續(xù)給藥2周。大鼠末次給藥后1 h，10%乙醚麻醉，腹主動脈取血，5 000 r·min^-1離心10 min，取血清，-20 ℃冰箱中保存，待檢測。采用ELISA試劑盒檢測，嚴(yán)格按照試劑盒的說明進(jìn)行操作。endprint

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，結(jié)果用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 對維甲酸致骨質(zhì)疏松大鼠血清s-TRAP，OPG，Ca和P水平的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清s-TRAP水平顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，各組大鼠血清s-TRAP水平顯著降低（P<0.05）；與生品組比較，酒制品組和砂燙品組大鼠血清s-TRAP水平顯著降低（P<0.05），蒸制品組和鹽制品組無顯著性差異。

與空白組比較，模型組大鼠血清OPG水平顯著降低（P<0.05）；與模型組比較，各組大鼠血清OPG水平顯著升高（P<0.05）；與生品組比較，除蒸制品組無顯著性差異外，其余各炮制品組大鼠血清OPG水平顯著升高（P<0.05）。

與空白組比較，模型組大鼠血清微量元素Ca和P水平顯著降低（P<0.05）；與模型組比較，各組大鼠血清微量元素Ca和P水平顯著升高（P<0.05）；與生品組比較，蒸制品組和砂燙品組大鼠血清Ca水平顯著降低（P<0.05），鹽制品組顯著升高（P<0.05），酒制品組無顯著性差異；酒制品組、砂燙品組和鹽制品組大鼠血清P水平顯著升高（P<0.05），蒸制品組水平無顯著性差異，見表1。

3.2 對維甲酸致骨質(zhì)疏松大鼠血清IL-6，TNF-α和IL-1水平的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清IL-6，TNF-α和IL-1水平均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，各組大鼠血清IL-6，TNF-α和IL-1水平均顯著降低（P<0.05）。與生品組比較，酒制品組、蒸制品組和砂燙品組大鼠血清IL-6水平顯著降低（P<0.05），鹽制品組顯著升高（P<0.05）；酒制品組、蒸制品組和鹽制品組大鼠血清TNF-α水平顯著升高（P<0.05），砂燙品組無顯著性差異；蒸制品組和砂燙品組IL-1水平均顯著降低（P<0.05），酒制品組和鹽制品組無顯著性差異，見表2。

3.3 狗脊各炮制品作用機(jī)制指標(biāo)總評分

依據(jù)各組作用機(jī)制指標(biāo)的單因素方差分析結(jié)果，為各炮制品的作用進(jìn)行評分，評分規(guī)則為各組指標(biāo)水平最接近空白組者計(jì)5分，次之者計(jì)4分，接下來依次遞減1分，總評分高者為優(yōu)。評分結(jié)果見表3。總評分排序?yàn)樯盃C品（22分）>酒制品（19分）和鹽制品（19分）>蒸制品（16分）>生品（14分）。

4 討論

4.1 模型與指標(biāo)分析

維甲酸誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)疏松模型雖然在病因上與人類骨質(zhì)疏松不同，但在發(fā)病癥狀、組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)等方面與人類有較好的相似性，具有操作簡單、造模周期短、成功率高等優(yōu)點(diǎn)。維甲酸誘導(dǎo)形成的骨質(zhì)疏松模型的發(fā)生機(jī)制為激活破骨細(xì)胞，促進(jìn)骨吸收。血清抗酒石酸酸性磷酸酶s-TRAP主要反映破骨細(xì)胞的活性和數(shù)量，是反映破骨細(xì)胞活性和骨吸收狀態(tài)的敏感指標(biāo)^[10]，實(shí)驗(yàn)中模型組s-TRAP顯著增加，說明造模成功；狗脊各炮制品均可顯著逆轉(zhuǎn)這種變化，其與陽性組砂燙骨碎補(bǔ)作用亦接近，但均不及空白組。說明各炮制品對破骨細(xì)胞均有一定程度的抑制作用，從而對抗骨的丟失，促進(jìn)了骨的形成。

中藥狗脊具有祛風(fēng)濕、抗炎的功效^[12-13]，故本研究從炎性因子的靶點(diǎn)作用方向選取了相應(yīng)檢測指標(biāo)，以深入探討其作用機(jī)制。IL-6表達(dá)水平在組織損傷時增高明顯，能通過抑制TNF-α，IL-1含量，來抑制成骨細(xì)胞成熟，增加骨吸收，是能夠?qū)е鹿橇繙p少的細(xì)胞因子^[14]，狗脊各炮制品中以砂燙品效果最佳。TNF-α及IL-1均為體內(nèi)具有抗炎作用等多種功能的細(xì)胞因子，二者可促進(jìn)骨吸收，抑制骨基質(zhì)膠原合成，狗脊各炮制品中生品對TNF-α影響最為突出，而蒸制品對IL-1水平影響最大。同時TNF-α和IL-1的升高可直接損傷腎血管-基底膜屏障，導(dǎo)致血管通透性增高，促使Ca和P代謝呈負(fù)平衡，從而影響骨形成，狗脊各炮制品中鹽制品和砂燙品分別為Ca和P水平的相應(yīng)最優(yōu)炮制品。此外，TNF-α尚能抑制OPG（骨保護(hù)蛋白，具有對抗骨丟失的作用）的mRNA的表達(dá)，可減少破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞的數(shù)量，IL-1還能直接誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成^[15]。同時，TNF-α和IL-1也直接參與對OPG的調(diào)節(jié)^[16]，OPG水平方面酒制品作用最為顯著。

4.2 狗脊各炮制品作用比較分析

本研究經(jīng)上述分析及實(shí)驗(yàn)結(jié)果構(gòu)建了IL-6→TNF-α和IL-1→Ca和P，OPG的一整條影響骨形成的信號通路，但也只是從炎性因子角度考慮的一條通路，并不完善，狗脊的不同炮制品對維甲酸致雄鼠骨質(zhì)疏松癥的作用效果體現(xiàn)在其中的各個環(huán)節(jié)，作用強(qiáng)弱不等，若按照s-TRAP水平的影響則各炮制品作用順序?yàn)榫浦破?砂燙品>蒸制品>生品>鹽制品；若按照作用機(jī)制指標(biāo)總評分則順序?yàn)樯盃C品>酒制品和鹽制品>蒸制品>生品，可以歸納為酒狗脊和砂燙狗脊效果較好，而蒸狗脊、鹽狗脊以及生狗脊作用次之。前兩者分別為狗脊最早及明代前沿用炮制品和現(xiàn)今應(yīng)用較為廣泛的品種，而后三者則存在于古今炮制品演變過程中^[17]，生品須炮制，炮制后作用增強(qiáng)，至于炮制方法的選擇，本研究結(jié)果表明，加熱方式中干熱的砂燙法優(yōu)于濕熱的水蒸法，輔料中黃酒優(yōu)于食鹽。

前期實(shí)驗(yàn)中對狗脊各水煎液樣品進(jìn)行HPLC-DAD分析，選取254，280，365 nm 3個波長，其中254，365 nm為常用波長，280 nm為狗脊中指標(biāo)性成分原兒茶酸和原兒茶醛的檢測波長^[18]，經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)254 nm波長下峰的數(shù)量較多，且原兒茶酸和原兒茶醛的色譜峰亦有體現(xiàn)，綜合考慮，選取此波長作為狗脊各灌胃樣品的分析波長。結(jié)合藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)此圖譜對于綜合評分法匹配較好，對于s-TRAP指標(biāo)水平并沒有很好地匹配，而s-TRAP這一指標(biāo)是體現(xiàn)影響破骨細(xì)胞活性的整體指標(biāo)。作者認(rèn)為此圖譜反應(yīng)的更多的是小分子酚酸類化合物的信息，此類化合物具有一定的抗炎作用^[19-21]；然而影響破骨細(xì)胞的通路和環(huán)節(jié)不單單是炎性因子靶點(diǎn)，水煎液中糖類等組分變化情況并未在圖譜中體現(xiàn)，其亦有可能是通過其他通路途徑影響s-TRAP水平的物質(zhì)基礎(chǔ)。不難看出，狗脊各炮制品水煎液指紋圖譜還有待深入研究，以更加全面地反應(yīng)其藥效和作用機(jī)制的物質(zhì)基礎(chǔ)信息。endprint

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Study on decoction′s effect of different processed rhizomes of

Cibotium barometz on retinoic acid induced male rats osteoporosis

XU Gang 2， 3， SUN Na 2， 3， ZHAO Min-jie 2， 3， JU Cheng-guo 2， 3， JIA Tian-zhu 2， 3*

（1.School of Pharmacy Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China；

2.Chinese Materia Medica Processing Engineering Center of Liaoning Province， Dalian 116600， China；

3.The Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China）

[Abstract] This study compared the decoction′s HPLC figures of the different processed rhizomes of Cibotium barometz including the raw， the sand-baked， the wined， the steamed and the salted， on the basis of which， with the sand-baked Drynaria fortunei decoction as the positive control group， comparingall groups′decoction， concentration of which was 104.2 g·L^-1， for 4 weeks， by their effects （s-TRAP and total scores of OPG， Ca， P， IL-6， TNF-α and IL-1） on retinoic acid induced male rats osteoporosis. The experiment results showed the sand-baked and the wined were better than the steamed， the salted and the raw；in the processing methods′ selection， the sand-baked was a better heating method than the steamed and the rice wine was the better excipient than the salt. It provided a reference to explain the processing principle of rhizomes of C. barometz and work mechanism of anti-osteoporosis.

[Key words] Cibotium barometz； processed products； decoction； retinoic acid； osteoporosis； osteoclast

doi：10.4268/cjcmm20140611endprint