趙艷，肖汀，祝琳琳

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，衛(wèi)生部免疫皮膚病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽110001）

趨化因子CXCL12及其受體CXCR4在大皰性類天皰瘡皮損中的表達(dá)

趙艷，肖汀，祝琳琳

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，衛(wèi)生部免疫皮膚病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽110001）

目的研究趨化因子CXCL12及其受體CXCR4在大皰性類天皰瘡（BP）皮損中的表達(dá)。方法采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)及圖像觀察分析41例BP皮損和49例正常對(duì)照石蠟切片中CXCL12和CXCR4的表達(dá)，并根據(jù)細(xì)胞質(zhì)中不同程度的染色判定陽性等級(jí)。結(jié)果CXCL12和CXCR4在BP皮損表皮均有較強(qiáng)的陽性表達(dá)（陽性率分別為96.1%和94.1%），而在正常皮膚中不表達(dá)或弱陽性表達(dá)（陽性率分別為40.8%和73.4%），CXCL12和CXCR4表達(dá)陽性率的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.04）。結(jié)論CXCL12和CXCR4在BP皮損中呈陽性表達(dá)，提示二者可能在BP的發(fā)病機(jī)制中起一定的作用。

CXCL12；CXCR4；大皰性類天皰瘡

大皰性類天皰瘡（bullous pemphigoid，BP）是一種以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤和血清IgE升高為特征的獲得性自身免疫性大皰性皮膚病，好發(fā)于老年人。其皮損中有大量的Th2淋巴細(xì)胞浸潤［1］。白介素（interleukin，IL）-4、IL-4、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）等多種細(xì)胞因子參與了BP皮損部位T淋巴細(xì)胞的聚集［2］。Clissi等［3］發(fā)現(xiàn)，CXCL12不僅對(duì)Th2細(xì)胞起趨化作用，還可以選擇性趨化Th1細(xì)胞。目前，CXCL12及其受體CXCR4在BP皮損中的表達(dá)尚未見相關(guān)研究。為此，我們檢測(cè)了41例BP患者皮損中CXCL12及其受體CXCR4的表達(dá)，以探究其在BP發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 病例與標(biāo)本

41例BP患者均來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，經(jīng)臨床、組織病理、直接和間接免疫熒光檢查確診為BP（BP皮損組）。其中女20例，男31例。年齡47～87歲，平均（70.63±11.02）歲。取材部位：軀干22例，四肢24例，頭頸4例。正常對(duì)照皮膚49例（正常對(duì)照組），系我院整形外科非皮膚疾病的患者。其中女27例，男22例。年齡11～76歲，平均（42.84±18.91）歲。

1.2 試劑

小鼠抗人CXCL12單克隆抗體、小鼠抗人CXCR4單克隆抗體購自美國R&D Systems，過氧化物酶標(biāo)記的SP染色試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組化染色：常規(guī)活檢取材，石蠟包埋、制片，免疫組化染色采用SP法，按照SP試劑盒說明操作。細(xì)胞質(zhì)不同程度、基本均勻的棕色顆粒為陽性，陰性反應(yīng)為無著色或與背景顏色一致，根據(jù)陽性的著色強(qiáng)度分為淺棕褐色（+）、棕褐色（++）、深棕褐色（+++），所有強(qiáng)度分級(jí)均由同一實(shí)驗(yàn)者操作。

1.3.2 平均光密度的測(cè)定：應(yīng)用OLYMPUS U-TV0.4XC-3顯微鏡（日本Olympus公司），在40倍光鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)視野，然后應(yīng)用Image-pro Plus 6專業(yè)圖像分析軟件，測(cè)其平均光密度，進(jìn)行CXCL12和CXCR4平均光密度的定量分析，以及各自對(duì)照組的定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)和Mann-Whitney檢驗(yàn)，P＜0.04為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CXCL12的表達(dá)

在BP皮損中CXCL12主要表達(dá)于表皮棘層及顆粒層，皰頂部染色陽性細(xì)胞顯著增多（圖1A）。而正常人表皮中不表達(dá)或很少表達(dá)CXCL12，真皮內(nèi)不表達(dá)CXCL12（圖1B）。BP皮損組和正常對(duì)照組相比，CXCL12表達(dá)陽性率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 18.30，P=0.011）。見表1。

圖1 CXCL12在BP皮損及正常皮膚中的表達(dá)SP×400Fig.1 Expression of CXCL12 in BP lesions and normal skin SP×400

表1 CXCL12和CXCR4在BP皮損和正常對(duì)照皮膚中的表達(dá)Tab.1 Expressions of CXCL12 and CXCR4 in BP lesions and normal skin

2.2 CXCR4的表達(dá)

在BP皮損中表皮基底層、棘層、顆粒層內(nèi)CXCR4呈陽性表達(dá)（圖2A）。而在正常人表皮顆粒層、棘層、基底層內(nèi)CXCR4的表達(dá)呈散在分布，在真皮內(nèi)不表達(dá)（圖2B）。BP皮損組和正常對(duì)照組相比，CXCR4表達(dá)陽性率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.22，P=0.001）。見表1。

圖2 CXCR4在BP皮損及正常皮膚中的表達(dá)SP×400Fig.2 Expression of CXCR4 in BP lesions and normal skin SP× 400

2.3 CXCL12和CXCR4陽性細(xì)胞平均光密度值比較

在BP皮損組織中，CXCL12陽性細(xì)胞平均光密度值（0.007 02）與正常對(duì)照組（0.000 06）相比，CXCR4陽性細(xì)胞平均光密度值（0.000 06）與正常對(duì)照組（0.004 44）相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Mann-Whitney檢驗(yàn)，均P＜0.04）。

2.4 影響CXCL12和CXCR4陽性表達(dá)的可能因素

由于BP好發(fā)于老年人，為探究年齡、性別、取材部位是否對(duì)CXCL12、CXCR4的陽性表達(dá)結(jié)果有影響，按年齡分為48～64歲組、64～80歲組、80歲以上組3組，按性別分男、女2組，按取材部位分頭面頸、軀干、四肢3組，與CXCL12、CXCR4表達(dá)陽性率進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析，P值均＞0.04，證明CXCL12、CXCR4的陽性表達(dá)率與年齡、性別和取材部位均無相關(guān)性。

3 討論

BP是循環(huán)自身抗體導(dǎo)致的自身免疫性疾病。BP抗體所相對(duì)的半橋?？乖饕?種：BP230和BP180。表皮下水皰的形成主要是抗BP180抗體通過補(bǔ)體激活，大量的炎性細(xì)胞浸潤及蛋白酶釋放，破壞半橋粒和細(xì)胞外基質(zhì)成分，在基底層的透明板內(nèi)發(fā)生真表皮的分離［4］。BP患者皮損皰液及皰下真皮內(nèi)有大量嗜酸性粒細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞浸潤［1］。Teraki等［4］報(bào)道，皮膚歸巢Th2細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4和IL-13參與大皰的形成。

趨化因子是能吸引白細(xì)胞發(fā)生定向運(yùn)動(dòng)的小分子蛋白質(zhì)，包括CXC、CC、C和CX3C四個(gè)亞族。CXCL12屬于CXC趨化因子一族，是T淋巴細(xì)胞的高效趨化因子，之前的研究顯示CXCL12在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，如肝癌等，它能以旁分泌的形式保護(hù)腫瘤細(xì)胞并促進(jìn)其生長，而且能通過作用于內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)腫瘤血管的生成［6］。CXCL12在人的皮膚中主要是由樹突細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)［7，8］。有研究表明，CXCL12能夠促進(jìn)Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-10的表達(dá)［9］；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中，CXCL12的刺激會(huì)導(dǎo)致TNF-α和IL-1的產(chǎn)生［10］，而在BP患者皰液中TNF-α與病情密切相關(guān)，TNF-α是水皰形成的一種重要炎性介質(zhì)［11］。CXCL12是CXCR4的唯一配體，CXCR4表達(dá)于活化的T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞［6］。通過CXCR4可調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、趨化、存活、增殖［11，12］。CXCL12/CXCR4通路能夠促進(jìn)樹突細(xì)胞的成熟，并參與表皮樹突細(xì)胞及朗格漢斯細(xì)胞向真皮遷移，從而啟動(dòng)相應(yīng)的免疫應(yīng)答［13～14］。

本研究發(fā)現(xiàn)，在BP皮損中CXCL12主要表達(dá)在棘層及顆粒層，而在正常人皮膚中不表達(dá)或很少表達(dá)。CXCR4在BP皮損中表皮基底層、棘層、顆粒層的表達(dá)較強(qiáng)。二者在皰頂部染色的陽性細(xì)胞顯著增多。我們推測(cè)，CXCL12由角質(zhì)形成細(xì)胞分泌后，逐漸向基底層彌散，并在皰頂部位聚集，同時(shí)趨化表達(dá)CXCR4的T淋巴細(xì)胞，引起T淋巴細(xì)胞浸潤。

本研究發(fā)現(xiàn)CXCL12和CXCR4在BP皮損中呈陽性表達(dá)，提示二者可能在BP發(fā)病機(jī)制中起一定作用。

［1］Gunther C，Carballido-Perrig N，Kopp T，et al.CCL18 is expressed in patients with bullous pemphigoid and parallels disease course［J］.Br J Dermatol，2009，160（4）：747-744.

［2］王艷華，徐曉巍.大皰性類天皰瘡與細(xì)胞因子關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2012，18（20）：3374-3376.

［3］Clissi B，D'Ambrosio D，Geginat J，et al.Chemokines fail to up-regulate beta 1 integrin-dependent adhesion in human Th2 T lymphocytes［J］.J Immunol，2000，164（6）：3292-3300.

［4］Jordon RE，Kawana S，F(xiàn)ritz KA.Immunopathologic mechanisms in pemphigus and bullous pemphigoid［J］.J Invest Dermatol，1984，84（1 Suppl）：72s-78s.

［5］Teraki Y，Hotta T，Shiohara T.Skin-homing interleukin-4 and-13-producing cells contribute to bullous pemphigoid：remission of diseae is associated with increased frenquency of interleukin-10-producing cells［J］.J Invest Dermatol，2001，117（4）：1097-1102.

［6］王勃，李少林，張俊，等.CXCR4在不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及意義［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，41（2）：131-134.

［7］Cristillo AD，Highbarger HC，Dewar RL，et al.Up-regulation of HIV coreceptor CXCR4 expression in human T lymphocytes is mediated in part by a cAMP-responsive element［J］.FASEB J，2002，16（3）：344-364.

［8］Avniel S，Arik Z，Maly A，et al.Involvement of the CXCL12/CXCR4 pathway in the recovery of skin following burns［J］.J Invest Dermatol，2006，126（2）：468-476.

［9］Piao HL，Tao Y，Zhu R，et al.The CXCL12/CXCR4 axis is involved in the maintenance of Th2 bias at the maternal/fetal interface in early human pregnancy［J］.C Mol Immunol，2012，9（4）：423-430.

［10］Han Y，He T，Huang DR，et al.TNF-alpha mediates SDF-1 alphainduced NF-kappa B activation and cytotoxic effects in primary astrocytes［J］.J Clin Invest，2001，108（3）：424-434.

［11］Wang B，Amerio P，Sauder DN.Role of cytokines in epidermal Langerhans cell migration［J］.J Leukoc Biol，1999，66（1）：33-39.

［12］Domanska UM，Kruizinga RC，Nagengast WB，et al.A review on CXCR4/CXCL12 axis in oncology：no place to hide［J］.Eur J cancer，2013，49（1）：219-230.

［13］Kabashima K，Sugita K，Shiraishi N，et al.CXCR4 engagement promotes dendritic cell survival and maturation［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，361（4）：1012-1016.

［14］Kabashima K，Shiraishi N，Sugita K，et al.CXCL12-CXCR4 engagement is required for migration of cutaneous dendritic cells［J］. Am J Pathol，2007，171（4）：1249-1247.

［15］Ouwehand K，Santegoets SJ，Bruynzeel DP，et al.CXCL12 is essential for migration of activated Langerhans cells from epidermis to dermis［J］.Eur J Immunol，2008，38（11）：3040-3049.

（編輯 陳姜）

Expressionsof CXCL12 and CXCR4 in Skin LesionsofPatientswith Bullous Pemphigoid

ZHAOYan，XIAOTing，ZHULin-lin
（DepartmentofDermatology，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Key Laboratory ofImmunodermatology，Ministry ofHealth，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo study the expressions of chemokine CXCL12 and its receptor CXCR4 in the skin lesions of bullous pemphigoid.MethodsThe expressions of CXCL12 and CXCR4 were detected in the skin lesions of 41 patients with bullous pemphigoid and 49 normal controls by immunohistochemical staining and image analysis.ResultsCXCL12 and CXCR4 were strongly expressed in the lesional epidermis of bullous pemphigoid group（96.1%and 94.1%positive，respectively），but weakly or negatively expressed in normal control group（40.8%and 73.4%positive，respectively）.The differencesbetween the two groupswere significant（P＜0.04）.ConclusionThe increased expression ofCXCL12 and CXCR4 in the lesions ofbullous pemphigoid indicatesthatthey mightplay an importantrole in the pathogenesis ofbullouspemphigoid.

CXCL12；CXCR4；bullous pemphigoid

R748.66

A

0248-4646（2014）04-0297-03

教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃（NCET-10-0904）；遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃（LR201041）

趙艷（1987-），女，碩士研究生.

肖汀，E-mail：cmuxt@126.com

2013-12-31

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：