朱雷，盛偉偉，董明，王科偉，于東洋

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普通外科教研室，胃腸外科，沈陽110001）

Notch1在胰腺癌中的表達(dá)及臨床病理學(xué)意義

朱雷，盛偉偉，董明，王科偉，于東洋

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普通外科教研室，胃腸外科，沈陽110001）

目的探討胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）中Notch1蛋白和mRNA表達(dá)水平及臨床病理學(xué)意義。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測47對配對的PDAC及癌旁組織石蠟標(biāo)本Notch1蛋白表達(dá)水平，觀察其與PDAC患者臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系；再以實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（QRT-PCR）檢測3株不同分化程度的胰腺癌細(xì)胞系（PANC-1、BxPC-3和CANPAN-2）中mRNA表達(dá)。結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示：Notch1在癌組織中表達(dá)高于配對的癌旁組織（t=2.449，P=0.020）。Notch1的表達(dá)與腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān)（χ2= 7.144，P=0.028）。單因素及多因素分析發(fā)現(xiàn)Notch1是影響胰腺癌患者預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立因素（P值分別為0.014、0.026）。QRTPCR結(jié)果顯示：mRNA水平隨細(xì)胞分化程度增高而逐漸減弱。結(jié)論在PDAC中Notch1表達(dá)明顯上調(diào)，并與腫瘤分化程度相關(guān)。Notch1可以作為評估PDAC患者預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立指標(biāo)。

胰腺導(dǎo)管腺癌；Notch信號(hào)通路；Notch1

胰腺癌作為預(yù)后最差的惡性腫瘤之一，其惡性程度高、迅速播散和轉(zhuǎn)移、放化療耐受，從而造成預(yù)后不良，4年生存率一直低于4%，病死率占所有惡性腫瘤的第4位［1］。近年研究發(fā)現(xiàn)，包括Notch在內(nèi)的多種信號(hào)通路在胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用［2，3］。Notch信號(hào)通路是一種普遍存在于從果蠅到哺乳動(dòng)物等眾多生命體中具有高度保守性的關(guān)鍵信號(hào)通路，根據(jù)其受體可分為Notch1、2、3、4。Notch1基因編碼是Notch家族中的一員，通過調(diào)控細(xì)胞周期命運(yùn)，在細(xì)胞發(fā)展進(jìn)程中扮演了重要角色。Notch1作為Ⅰ型跨膜蛋白的一種，具有細(xì)胞表面受體和核轉(zhuǎn)錄調(diào)控的雙重功能［4］，且Notch1受體也是最常被檢測到的Notch受體家族成員，在腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和凋亡過程中起著重要的調(diào)控作用［4］。在人類許多腫瘤中均檢出Notch1受體表達(dá)量的異常（例如膠質(zhì)瘤、甲狀腺髓樣癌、乳腺癌、肺癌、食管癌、子宮頸癌、原發(fā)性黑色素瘤和血液系統(tǒng)腫瘤等），高水平的Notch1受體及其配體往往被認(rèn)為是惡性腫瘤的標(biāo)識(shí)或預(yù)后不良的表現(xiàn)［6］。但在胰腺癌研究中鮮有針對Notch1的研究結(jié)果報(bào)道。本研究采用免疫組織化學(xué)和QRT-PCR方法，檢測在不同分化程度的胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adeno-carcinoma，PDAC）中Notch1的表達(dá)水平，探討其表達(dá)的臨床病理學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象及主要材料

收集2004年1月至2011年12月中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院具有完整臨床資料的PDAC手術(shù)切除標(biāo)本（47例）及對應(yīng)癌旁組織（對照組）。47例患者術(shù)后病理證實(shí)為原發(fā)性管狀腺癌。胰腺癌細(xì)胞系，PANC-1（低分化）、BxPC-3（中分化）和CAPAN-2（高分化）均購自中科院上海細(xì)胞庫，含10%胎牛血清1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)（HyClone，美國）。Notch1兔抗人單克隆抗體購自Abcam公司。SP法免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色液購自福州邁新公司。RNA分離試劑盒Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（DRR037S）、SYBR GreenⅡ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR試劑盒等均購自日本TaKaRa公司。

1.2 免疫組織化學(xué)SP法檢測

單純退燒只是緩解發(fā)燒這一癥狀，不能治療引起發(fā)燒的感染本身，也就是我們常說的“治標(biāo)不治本”，要想徹底治愈疾病得針對造成感染的病原體本身。比如普通感冒，反復(fù)發(fā)燒3～4天很常見，吃退燒藥就能退燒，幾小時(shí)后體溫又再次升高，這是正常現(xiàn)象。

總生存期是從手術(shù)日到患者因PDAC復(fù)發(fā)死亡之間的時(shí)間。死于其他疾病或在隨訪期內(nèi)生存病例作為截尾事件處理。除去失訪的4例，可用于生存分析隨訪病例為42例。Kaplan-Meier單因素生存分析顯示Notch1低表達(dá)PDAC患者較高表達(dá)者預(yù)后好（P=0.014，圖2）；單因素生存分析中所有參數(shù)均納入多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示Notch1表達(dá)水平可以作為PDAC預(yù)后的獨(dú)立的預(yù)測因素（P=0.026），相對危險(xiǎn)系數(shù)為2.414（94%CI 1.294～4.014）。

Notch1在癌組織中表達(dá)高于配對的癌旁組織（t=2.449，P=0.020）；在PDAC中，Notch1有32例（46.1%）呈高表達(dá)；在癌旁組織中有16例（28.1%）呈高表達(dá)。Notch1蛋白主要表達(dá)于導(dǎo)管細(xì)胞，少量表達(dá)于胰島細(xì)胞及胰腺正常腺泡細(xì)胞（圖1A）；Notch1主要在胞質(zhì)表達(dá)（圖1A～1D）。

選取3株胰腺癌細(xì)胞系：CANPAN-2（高分化）；BxPC-3（中分化）；PANC-1（低分化）。采用RNA分離試劑盒Trizol提取并純化細(xì)胞株總RNA，所有RNA樣本濃度均稀釋至1 μg/μL，根據(jù)TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。熒光實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系24 μL（TaKaRa 2×SYBRR Premix ExTaqTM12.4 μL，100 nmol/L上下游引物各1 μL，Cdna 2 μL，H2O 8.4 μL），反應(yīng)條件：94℃4 min變性；94℃4 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)，所有反應(yīng)均設(shè)立復(fù)孔，并以DEPC水代替模板cDNA作為陰性對照。引物均由TaKaRa公司設(shè)計(jì)，上海生工合成。Notch1上游引物；4′-CGAGGTCAACACAGACGAGTG-3′，下游引物：4′-GCACAGATGCCCAGTGAAG-3′；GAPDH上游引物4′-CATGAGAAGTATGACAACAG CCT-3′；下游引物4′-AGTCCTFCCACGATACCAAA GT-3′。

1.4 結(jié)果判定

參考Sung等［7］的免疫組化評分方法：每張切片400倍顯微鏡下隨機(jī)選取4個(gè)視野：（1）陽性細(xì)胞數(shù)：計(jì)算4個(gè)視野的陽性細(xì)胞的平均百分?jǐn)?shù)，分為4級(jí)：陽性細(xì)胞數(shù)1%～24%為1分；24%～49%為2分；40%～74%為3分；≥74%為4分。（2）染色強(qiáng)度：無著色0分；淺黃色1分；黃或深黃色2分；棕或棕褐色3分，上述兩項(xiàng)相乘為分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：≥4分定義為高表達(dá)。QRT-PCR分析結(jié)果得到細(xì)胞株標(biāo)本中Notch1和GAPDH的閾值循環(huán)數(shù)（CT）值與其相對應(yīng)的GAPDH的CT值相減，得到校正CT值。分別以CANPAN-2、BxPC-3、PANC-1細(xì)胞株為對照，與其余兩種細(xì)胞株進(jìn)行比較，比較公式：2-ΔΔCt=2-［（ΔCt目標(biāo)細(xì)胞株目的基因-ΔCt內(nèi)參基因）-（ΔCt對照細(xì)胞株目的基因-ΔCt內(nèi)參基因）］。

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。配對的癌與癌旁組織蛋白及3種不同PDAC細(xì)胞株mRNA表達(dá)評分后采用配對t檢驗(yàn)。Notch1蛋白表達(dá)水平與患者臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)。Kaplan-Meier單因素分析計(jì)算累積生存率。Log-Rank進(jìn)行生存時(shí)間差異檢驗(yàn)；Cox多因素分析評估影響預(yù)后的獨(dú)立因素。P＜0.04為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

通過χ2檢驗(yàn)，Notch1蛋白表達(dá)與PDAC分化程度相關(guān)（χ2=7.144，P=0.028），見表1。隨腫瘤分化程度降低Notch1表達(dá)逐漸增強(qiáng)（圖1 B、1C、1D）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Notch1在PDAC和癌旁組織中表達(dá)

2.2 Notch1蛋白表達(dá)與PDAC患者臨床病理學(xué)參數(shù)關(guān)系

1.3 QRT-PCR檢測

在以往的語文學(xué)習(xí)中，學(xué)生的學(xué)習(xí)狀態(tài)可以被稱為“點(diǎn)狀”的學(xué)習(xí)，缺乏系統(tǒng)性。而項(xiàng)目學(xué)習(xí)則凸顯了整合學(xué)習(xí)的特征，即以嘗試解決真實(shí)問題為項(xiàng)目主體，將語文學(xué)習(xí)和學(xué)生個(gè)人的體驗(yàn)相結(jié)合，從而幫助學(xué)生構(gòu)筑獨(dú)具特色的知識(shí)體系。教師在開展項(xiàng)目學(xué)習(xí)時(shí)，要根據(jù)學(xué)生的實(shí)際興趣、學(xué)情等來確定項(xiàng)目學(xué)習(xí)的主題，然后分成幾個(gè)小組，讓學(xué)生通過自主合作探究的學(xué)習(xí)方式，完成項(xiàng)目任務(wù)。

酵母菌不服氣道：“哼，你們?nèi)祟愐幌蛞悦踩∪?，但可別以‘小’取‘菌’。雖然我們是單細(xì)胞的生物，但我們是個(gè)大家族，已知的種類就有1 000多種。雖然我們個(gè)小，但是繁殖速度快，條件允許時(shí)，大概每兩個(gè)小時(shí)就能繁殖一代。所以你們?nèi)祟? d，我們酵母菌都好幾代同堂了，并且我們有好多好多的兄弟姐妹。我們也不像細(xì)菌那樣，連個(gè)細(xì)胞核都沒有，有真正的細(xì)胞核喲，可是真核生物?！?/p>

2.3 Notch1蛋白表達(dá)與胰腺癌患者術(shù)后生存關(guān)系

街道級(jí)交通指數(shù)的計(jì)算基于街道內(nèi)每個(gè)路段的平均運(yùn)行速度，來源于浮動(dòng)車數(shù)據(jù)系統(tǒng)[4]. 區(qū)域平均TTI可由各路段的行駛里程(VMT)作權(quán)重對路段TTI進(jìn)行加權(quán)求得，進(jìn)一步把區(qū)域TTI折算成0～10的指數(shù)，計(jì)算公式如式(1)(2)：

所有組織標(biāo)本均經(jīng)4%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，以二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化。3%過氧化氫室溫14 min去除內(nèi)源性過氧化酶。磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后，置于pH 6.0的枸櫞酸緩沖液121℃高壓熱抗原修復(fù)4 min，自然冷卻。血清室溫封閉20 min后滴加一抗，4℃孵育過夜。次日依次滴加二抗及霉菌抗生物素蛋白。過氧化物酶37℃14 min，PBS清洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化后常規(guī)脫水、透明，封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。

表1 PDAC組織中Notch1的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Tab.1 The relationship between Notch1 expression in PDAC tissues and clinicopathological characteristics

圖1 Notch1在正常胰腺及癌組織中的表達(dá)×200Fig.1 Expression of Notch1 in PDAC tissues and in pancreatic tissues×200

2.4 QRT-PCR結(jié)果分析

Notch1蛋白在不同分化程度的胰腺癌細(xì)胞系中mRNA表達(dá)隨腫瘤分化程度降低而逐步增強(qiáng)，且與免疫組化分析結(jié)果趨勢一致。即Notch1的mRNA在PANC-1的表達(dá)高于BxPC-3（t=2.943，P=0.010）；在BxPC-3的表達(dá)高于CANPAN-2（t=2.489，P= 0.023）。

圖2 PDAC患者Notch1表達(dá)的KM生存曲線Fig.2 Kaplan-Meier survival curves of expression of Notch1 in patients with PDAC

3 討論

一些研究發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路在消化系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移過程中均有作用，對于惡性腫瘤的生物學(xué)行為影響顯著［8，9］。我們通過免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織比較，Notch1在PDAC中表達(dá)明顯上調(diào)，且通過研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)Notch1的PDAC患者預(yù)后差，這就提示了Notch1的表達(dá)程度在PDAC的發(fā)生與發(fā)展過程中具有重要作用，可以作為評估PDAC患者預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立指標(biāo)。

頸源性頭痛在以往曾被稱為“神經(jīng)性頭痛”、“神經(jīng)血管性頭痛”,“腦供血不足”“焦慮癥、抑郁癥”“肌緊張性頭痛“枕大神經(jīng)痛”,“耳神經(jīng)痛”,“頸椎病”等。輾轉(zhuǎn)就診于“神經(jīng)內(nèi)科”、“精神科”,“疼痛科”、“中醫(yī)針灸科”,“骨科”。以往認(rèn)為此種頭痛是頭部的神經(jīng)和血管在致病因素的作用下產(chǎn)生頭痛,因而治療方法主要是口服非甾體抗炎藥物,頭部針灸、理療、按摩,頭部痛點(diǎn)注射[1]。但有相當(dāng)數(shù)量的患者的病情并不好轉(zhuǎn)或療效不持久。形成“病人頭痛,醫(yī)生也頭痛”的局面。這一臨床現(xiàn)狀推動(dòng)著對此類頭痛發(fā)病機(jī)制的深入研究。由于此類患者大部分首先就診于神經(jīng)內(nèi)科多見,故目前主張?jiān)摬w屬神經(jīng)內(nèi)科。

此外，Parr等［10］發(fā)現(xiàn)Numb的表達(dá)與乳腺癌的分化有關(guān)，正常組織中的Numb表達(dá)比乳腺癌中高，而Notch1幾乎不表達(dá)。因此推測Notch1在乳腺癌中起癌基因的作用。還有研究表明，Numb通過影響胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展［11］，而Numb對Notch的表達(dá)同樣具有明確的抑制作用［12］，這都提示Notch1對于PDAC的生物行為存在著調(diào)控作用，進(jìn)而影響惡性腫瘤的分化。我們的研究同樣發(fā)現(xiàn)，在PDAC組織標(biāo)本及胰腺癌細(xì)胞系中，隨著腫瘤分化程度增高，Notch1蛋白的表達(dá)隨之降低。

好在日前生態(tài)環(huán)境部發(fā)布了《關(guān)于生態(tài)環(huán)境領(lǐng)域進(jìn)一步深化“放管服”改革，推動(dòng)經(jīng)濟(jì)高質(zhì)量發(fā)展的知道意見》。《意見》明確提出，各地要出臺(tái)細(xì)化防止“一刀切”的有效措施，及時(shí)向社會(huì)發(fā)布公告。相關(guān)負(fù)責(zé)人也表示，按照《意見》要求，生態(tài)環(huán)境部將全面落實(shí)“雙隨機(jī)、一公開”制度，實(shí)現(xiàn)對不同生態(tài)環(huán)境水平監(jiān)管對象的差別化管理，對超標(biāo)企業(yè)加大查處力度，對長期穩(wěn)定達(dá)標(biāo)排放的合法企業(yè)減少監(jiān)管頻次。這對于環(huán)保達(dá)標(biāo)的大中型企業(yè)算是好消息。但總的來說，短期內(nèi)開工率穩(wěn)中趨降。

然而，本實(shí)驗(yàn)沒有通過體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證Notch1對胰腺癌生物學(xué)功能的影響。但近年來一些研究發(fā)現(xiàn)，阻斷Notch信號(hào)通路可以一定程度上抑制胰腺癌早期階段上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化［13］，且對于Notch1信號(hào)通路的調(diào)控與結(jié)腸癌等消化系統(tǒng)腫瘤的化療敏感性存在密切聯(lián)系［14］。而特異性抑制腫瘤細(xì)胞Notch1活性藥物能否應(yīng)用于PDAC的臨床治療，目前尚未有研究證明，但通過現(xiàn)有的研究可以預(yù)見，隨著研究的進(jìn)一步深入，Notch1將很有可能成為未來PDAC臨床治療及判斷預(yù)后的新指標(biāo)。

［1］Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics，2009［J］.CA Cancer J Clin，2009，49（4）：224-249.

［2］Habbe N，Shi G，Meguid RA，et al.Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia（mPanIN）by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice［J］.Proc Natl Acad Sci U SA，2008，104（48）：18913-18918.

［3］Mullendore ME，Koorstra JB，Li YM，et al.Ligand-dependent Notch signaling is involved in tumor initiation and tumor maintenance in pancreatic cancer［J］.Clin Cancer Res，2009，14（7）：2291-2301.

［4］Rajith B，George Priya Doss C.Path to facilitate the prediction of functional amino acid substitutions in red blood cell disorders-a computational approach［J］.PLoS One，2011，6（9）：e24607.

［5］Garg P，Jeppsson S，Dalmasso G，et al.Notch1 regulates the effects of matrix metalloproteinase-9 on colitis-associated cancer in mice［J］.Gastroenterology，2011，141（4）：1381-1392.

［6］Reedijk M，Odorcic S，Chang L，et al.High-level coexpression of JAG1 and NOTCH1 is observed in human breast cancer and is associated with poor overall survival［J］.Cancer Res，2004，64（18）：8430-8437.

［7］Sung CO，Han SY，Kim SH.Low expression of claudin-4 is associated with poor prognosis in esophageal squamous cell carcinoma［J］. Ann Surg Oncol，2011，18（1）：273-281.

［8］Fre S，Huyghe M，Mourikis P，et al.Notch signals control the fate of immature progenitor cells in the intestine［J］.Nature，2004，434（7044）：964-968.

［9］van Es JH，van Gijn ME，Riccio O，et al.Notch/gamma-secretase inhibition turns proliferative cells in intestinal crypts and adenomas into goblet cells［J］.Nature，2004，434（7044）：949-963.

［10］Parr C，Watkins G，Jiang WG.The possible correlation of Notch-1 and Notch-2 with clinical outcome and tumour clinicopathological parameters in human breast cancer［J］.Int J Mol Med，2004，14（4）：779-786.

［11］Sheng W，Dong M，Zhou J，et al.Cooperation among Numb，MDM2 and p43 in the development and progression of pancreatic cancer［J］.Cell Tissue Res，2013，344（2）：421-432.

［12］Couturier L，Mazouni K，Schweisguth F.Inhibition of Notch recycling by Numb：relevance and mechanism（s）［J］.Cell Cycle，2013，12（11）：1647-1648.

［13］De La OP，Emerson LL，Goodman JL，et al.Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2008，104（48）：18907-18912.

［14］Meng RD，Shelton CC，Li YM，et al.gamma-secretase inhibitors abrogate oxaliplatin-induced activation of the Notch-1 signaling pathway in colon cancer cells resulting in enhanced chemosensitivity［J］.Cancer Res，2009，69（2）：473-482.

（編輯 武玉欣）

ClinicopathologicalSignificance ofthe Expression ofNotch1 in Human Pancreatic Cancer

ZHULei，SHENGWei-wei，DONGMing，WANGKe-wei，YU Dong-yang
（UnitofGastrointestinalSurgery，DepartmentofGeneralSurgery，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo explore the clinicopathologicalsignificance ofthe expression ofnotch1 protein and mRNA levelsin pancreatic ductaladenocarcinoma（PDAC）.MethodsThe expression of notch1 protein in 47 pairs of paraffinembedded PDAC specimens and adjacent non-cancerous pancreatic tissues were detected by immunohistochemistry.The relationship between the protein expression and clinicopathological characters was analyzed.Quantitative real-time polymerase chain reaction（QRT-PGR）were used to examine the mRNA expression ofnotch1 in 3 differentdifferentiated pancreatic cancercells（PANC-1，BxPC-3＆CAPAN-2）.ResultsThe expression ofNotch1 protein was higherin PDAC compared with that in paired non-cancerous pancreatic tissues（t=2.449，P=0.020）.The expression of notch1 protein had a negative correlation with tumor differentiation（χ2=7.144，P=0.028）.Univariate and multivariate analysis with clinicopathological characters revealed that the notch1 expression was an independent prognostic indicator for PDAC patients（P1=0.014；P2=0.026）.Moreover，the mRNA expression of notch1 was gradually reduced with the increase ofdifferentiation degree ofpancreatic cancercellshowed by QRT-PCR results.ConclusionNotch1 is up-regulated in PDAC.Itis correlated with tumordifferentiation.Notch1 expression isan independentprognostic indicatorfor PDAC patients.

pancreatic ductal adenocarcinoma；Notch signal pathway；Notch1

R734.9

A

0248-4646（2014）04-0320-04

遼寧省科學(xué)事業(yè)公益研究基金（2013001008）；遼寧省教育廳特聘教授專項(xiàng)基金［遼財(cái)指教（2012）412］

朱雷（1984-），男，助教，碩士.

董明，E-mail：cmudongming@sohu.com

2014-01-24

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：