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(1 塔里木大學生命科學學院， 新疆 阿拉爾 843300 ) (2 東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院， 黑龍江 哈爾濱 150030)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是豆科牧草，因營養(yǎng)價值極其豐富且產(chǎn)量高被譽為“牧草之王”，是營養(yǎng)價值極佳的優(yōu)質(zhì)牧草，可提高牛羊的產(chǎn)奶量和肉的品質(zhì)。同時也是改善土壤條件、保持水土和開發(fā)利用鹽堿地資源的重要作物[1]。苜蓿具有一定的耐鹽堿特性，可在輕度鹽堿地栽培，但在中度鹽堿地或重度鹽堿地不能正常生長導致生物量大大降低[2]。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶(phosphoenolpyruvatecarboxylasekinase,PPCK) 是一種典型的蛋白激酶，參與植物對脅迫的反應[3]，受轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)合成的調(diào)控，在堿脅迫誘導后上調(diào)表達，并且能夠維持細胞內(nèi)pH的穩(wěn)定。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvatecarboxylase,PEPC)能夠被其特異性磷酸化，在植物中PEPC參與光合作用的固氮、生物合成前體的供應、氮同化過程中對pH的調(diào)控及信號級聯(lián)反應[2]。在C4植物葉片中PPCK水平與本森-卡爾文循環(huán)的活性及光合作用電子傳遞鏈的流量緊密聯(lián)系[3-7]。

為培育、篩選出耐堿轉(zhuǎn)基因苜蓿，本研究采用農(nóng)桿菌介導法將實驗室前期構建的野大豆堿脅迫轉(zhuǎn)錄譜中篩選獲得的堿脅迫應答關鍵的2個基因(GsPPCK1,GsPPCK3)，轉(zhuǎn)化苜蓿新品種龍牧806(M.sativa cv.LongmuNO.806)，來培育耐鹽堿苜蓿新品種。龍牧806是黑龍江農(nóng)科院草業(yè)所以肇東苜蓿與扁蓿豆遠緣雜交種 F3代群體為原始材料，采用系統(tǒng)選育方法，通過多次單株選擇選育出的優(yōu)良品種[8]，是適合東北地區(qū)種植的優(yōu)質(zhì)、抗寒、抗病、生物產(chǎn)量高的優(yōu)良品種。對獲得的轉(zhuǎn)GsPPCK1和GsPPCK3基因株系進行了較系統(tǒng)的分子生物學檢測和耐堿性分析，最終獲得了耐堿能力較強的轉(zhuǎn)基因株系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大腸桿菌DH5α和根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacteriumtumefaciems)EHA105由東北農(nóng)業(yè)大學植物生物工程研究室保存。轉(zhuǎn)化受體為紫花苜蓿龍牧806種子，由黑龍江農(nóng)業(yè)科學院草業(yè)所提供。

1.2 植物表達載體的構建

1.2.1 質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶消化反應：

1.2.1.1 加入2 μL (10×)相應的限制酶消化緩沖液，再加入0. 2～1. 0 ug的質(zhì)粒DNA。

1.2.1.2 加入1～2單位的限制性內(nèi)切酶，加去離子水至總體積為20 μL 。

1.2.1.3 輕彈外壁以混勻，并短暫快速離心，使液體沉下。

1.2.1.4 將混和反應置于37 ℃水浴中，反應3小時左右。

1.2.1.5 電泳觀察酶切結果。

1.2.2 目的片段的電泳回收：

采用北京鼎國回收試劑盒，方法如下：

1.2.2.1 樣品經(jīng)瓊脂凝膠電泳后，將含目的DNA片段的凝膠切出，放入1. 5 mL Ep管中。

1.2.2.2 加入3倍體積的溶液A和150 μL 溶液B，60 ℃，5～10 min，使膠完全溶解。

1.2.2.3 將上述溶液轉(zhuǎn)到離心過濾柱中，室溫放置20 min。

1.2.2.4 10 000 r/min，離心1 min，除掉上清。

1.2.2.5 加入500 μL 溶液C，混勻后10 000 r/min，離心1 min。(重復一次)

1.2.2.6 除凈上清，加入TE混勻，55 ℃水浴放置5 min。

1.2.2.7 10 000 r/min，離心1 min，回收上清液，為DNA溶液。

1.2.2.8 電泳觀察回收結果。

1.2.3 連接反應

1.2.3.1 將T4DNA連接酶緩沖液1 μL 加入一滅菌的Ep管中。

1.2.3.2 加入適量載體DNA和外源DNA片段，使摩爾比為1：1，70 ℃水浴10 min。

1.2.3.3 室溫下加入T4DNA連接酶1 μL ，輕彈外壁以搖勻，并短暫快速離心，使液體沉下。

1.2.3.4 22 ℃反應3小時以上。

1.3 轉(zhuǎn)基因苜蓿的獲得

1.3.1 篩選壓力的確定

以非轉(zhuǎn)基因的無菌苗子葉節(jié)為材料，固沙草Glufosinate為篩選劑[9]，初次濃度梯度為設置為0、0 . 5、1、1 . 5、2 mg/L 5個梯度，基本培養(yǎng)基為MS+1mg/L 6-BA，確定出龍牧806苜蓿的篩選壓力。再次濃度梯度設置為0、0 . 3、0 . 4、0 . 5、0 . 6、0 . 7、0 . 8 mg/L 7個梯度確定出龍牧806苜蓿最終篩選壓力。

1.3.2 農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化及抗性植株再生

將鑒定好的植物表達載體采用凍融法[11-13]轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。

無菌苗培養(yǎng)：苜蓿種子滅菌后播種在萌發(fā)培養(yǎng)基(1/2MS+ 15g/L 蔗糖+0. 8%瓊脂，pH5. 8)上，生物培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)7 d。

子葉節(jié)預培養(yǎng)：剪下子葉節(jié)轉(zhuǎn)入預培養(yǎng)培養(yǎng)基(1.0mg/L 6-BA+MS+30g/L蔗糖+0. 85%瓊脂，pH5. 8)中培養(yǎng)2 d。

農(nóng)桿菌浸染：將子葉浸泡在OD600為0. 4～0. 6的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液中浸染15 min，期間輕輕晃動三角瓶2～3次，取出后用無菌濾紙適度吸去過量菌液，接種在共培養(yǎng)培養(yǎng)基(100 uM/L乙酰丁香酮+1. 0 mg/L 6-BA+MS+30 g/L蔗糖+0. 85%瓊脂，pH5. 2)上，進行黑暗培養(yǎng)72 h ，轉(zhuǎn)入除菌篩選培養(yǎng)基(1. 0 mg/L 6-BA+MS+30 g/L蔗糖+0. 8 mg/L固沙草+100 mg/L阿莫西林+0. 85%瓊脂，pH5. 8)篩選10天。

不定芽誘導與伸長：將分化出的抗性芽轉(zhuǎn)入含有相同篩選壓力的不定芽誘導與伸長除菌培養(yǎng)基(0. 5mg/L 6-BA+MS+30 g/L蔗糖+0. 8 mg/L固沙草+100 mg/L阿莫西林+0. 85%瓊脂，pH5. 8)中培養(yǎng)10 d。

不定根誘導：待不定芽長至2～3 cm高時，盡量選擇分支多的不定芽，將根部的愈傷組織剪掉，置于1 mg/ml的IBA中浸泡2-3分鐘，插入生根培養(yǎng)基(1/2MS+15g/L蔗糖+50 mg/L阿莫西林0. 85%瓊脂，pH5. 8)中，兩周左右長出不定根。

馴化移栽：待不定根長到2～3 cm長時，進行馴化移栽。將小苗用鑷子小心取出，用自來水緩慢沖洗干凈根部培養(yǎng)基，放于1/2MS的營養(yǎng)液中，馴化適應1～3天，移栽于土：草炭：蛭石=1：1：1的營養(yǎng)缽中，扣塑料杯保濕。培養(yǎng)條件為26 ℃、散射光、濕度80%，16 h/d弱光培養(yǎng)。培養(yǎng)至有新葉長出后，可逐漸去除保濕塑料杯，移栽至大花盆中，保證充足的光照和適度水分。

1.4 分子生物學檢測

1.4.1 PCR檢測

引物設計：以35s-bar序列設計引物，上游35S-bar-S為5’-CCTGTGCCTCCAGGGAC-3’) ，下游引物35S-bar-AS為5’-GCGGTCTGCACCATCGTC-3’。對EHA105(pCEPPCK1, pCEPPCK3)侵染后獲得的抗性植株PCR檢測：取馴化移栽的轉(zhuǎn)基因苜蓿幼嫩葉片，采用EasyPureTM Plant Genomic DNA Kit提取DNA，以非轉(zhuǎn)基因幼嫩葉片為陰性對照，進行PCR檢測。反應體系為10 μL ：2×Easytaq 5 μL ， ddH2O 3. 4 μL ， P1(10 umol/L)0. 3 μL ， P2(10 umol/L)0. 3 μL ， 模板DNA1 μL 。PCR反應條件：94 ℃預變性10 min，94 ℃變性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)延伸10 min， 4 ℃終止反應。對PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳和紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察。

1.4.2 PCR陽性株系的Real-time PCR檢測

轉(zhuǎn)基因苜蓿總RNA的提取，取PCR呈陽性的轉(zhuǎn)基因植株幼嫩葉片采用RNA prep pure Plant Kit提取RNA，以非轉(zhuǎn)基因幼嫩葉片為陰性對照，cDNA第一鏈的合成采用SMART cDNA synthesis kit，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，對兩個基因分別設置了特異引物：

GsPPCK1-RS (5’-CCACCGCACTTCAAACAA-3’)

GsPPCK1-RAS(5’-ACCGCTCATGCTACTCCC-3’)

GsPPCK3-RS(5’-CCCTCCTTTCACCTCACC-3’)

GsPPCK3-RAS(5’-GAACCGAAGTCCGCCAGT-3’)

進行Real-time PCR檢測，確定轉(zhuǎn)基因植株與野生型苜蓿中基因的表達量差異。

1.5 轉(zhuǎn)基因苜蓿株系的擴繁與NaHCO3脅迫處理

轉(zhuǎn)基因苜蓿株系的擴繁：實驗于2013年7月中旬至9月在東北農(nóng)業(yè)大學香坊農(nóng)場28號溫室內(nèi)進行。選取生長狀態(tài)良好的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因野生型苜蓿的枝條，剪成帶2～3個腋芽的莖段浸泡于生根粉溶液中，2 h后插入底部打孔的盛有普通土：草炭土：蛭石=1:1:1的塑料大盆內(nèi)定期噴灌，10 d左右長出不定根，3周后挑選根系發(fā)達長勢健壯的扦插苗移出，移栽于裝有混合基質(zhì)珍珠巖:蛭石=1:1的營養(yǎng)缽中，每缽1株苗，每30株單株置于一大托盤，每盤澆3L 1/2Hoagland營養(yǎng)液，每2 d補加0. 5 L營養(yǎng)液。

轉(zhuǎn)基因苜蓿株系的NaHCO3脅迫處理：待其在營養(yǎng)缽中生長1個月后，挑選長勢健壯一致的植株進行脅迫處理，將轉(zhuǎn)基因材料和野生型材料各分成3組，每組10株，設3次重復。NaHCO3處理設置4個濃度，分別為0 mmol/L，100 mmol/L，200 mmol/L，250 mmol/L，1/2Hoagland營養(yǎng)液持續(xù)脅迫培養(yǎng)，每一托盤加入3 L，每2 d補加0. 5 L。待表型明顯時進行生理指標的測定。

1.6 轉(zhuǎn)基因苜蓿株系的生理生化指標的測定

NaHCO3脅迫處理9 d后，測定與耐堿相關的7項指標，包括質(zhì)膜透性、葉綠素含量、丙二醛含量、脯氨酸含量、檸檬酸含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性。每項指標隨機測定3個單株，3次重復，計算其平均值。各指標的測定方法分別為，電導儀法測定質(zhì)膜透性，硫代巴比妥酸法測定丙二醛含量，80%丙酮研磨提取比色法測定葉綠素(Chl)含量，氮藍四唑NBT光化還原法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性，磺基水楊酸提取法測定脯氨酸含量[14-15]，分光光度計法測定檸檬酸含量[16]和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶[17](PEPC)活性。

2 結果與分析

2.1 植物表達載體構建

植物表達載體pCEPPCK1的構建過程見圖1。用SnaB I和EcoR I分步進行不完全酶切中間表達載體pAEOM-PPCK1，回收后與經(jīng)同樣的酶消化的載體卡盒pBEOM連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。對轉(zhuǎn)化子進行SnaB I和EcoR I雙酶切鑒定，結果得到的大小為806 bp的特異性條帶如圖2，酶切結果正確。

植物表達載體pCEPPCK3的構建過程見圖3。用Hind III和Sac I雙酶切中間表達載體pAEOM-PPCK3回收后與經(jīng)同樣的酶消化的載體卡盒pBEOM連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α；對轉(zhuǎn)化子進行Hind III和Sac I雙酶切鑒定結果得到的大小為901 bp 的特異性條帶如圖4所示，酶切結果正確。

2.2 農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化及抗性植株再生

對鑒定正確GsPPCK1，GsPPCK3通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化龍牧806所得的抗性植株統(tǒng)計結果見表1。

2.2.1 固沙草Glufosinate篩選壓力的確定

在初次實驗中，對非轉(zhuǎn)基因材料利用所設置的5個濃度梯度，3次重復實驗，結果表明：Glufosinate濃度為1 mg/L以上時，不定芽分化率為零，說明已完全抑制不定芽的分化，結果見表2。

為確定出更加準確的篩選壓力，進一步縮小了濃度梯度，設置了7個濃度梯度(見表3)，對非轉(zhuǎn)基因材料進行3次重復處理Glufosinate濃度為0.8 mg/L時，不定芽分化率為零，以此濃度作為不定芽的分化篩選濃度。

圖1 植物表達載體pCEPPCK1的構建

圖3 植物表達載體pCEPPCK3的構建

圖4 植物表達載體pCEPPCK3酶切鑒定

表1 抗性植株轉(zhuǎn)化效率

表2 Glufosinate篩選壓力確定

表3 Glufosinate篩選壓力確定

2.3 抗性植株PCR檢測和Real-time-PCR檢測

對上述轉(zhuǎn)GsPPCK1和GsPPCK3各獲得抗性植株45、53株進行了PCR檢測和Real-time-PCR檢測。

2.3.1 抗性植株的PCR檢測

用bar基因序列設計引物， 以質(zhì)粒DNA為陽性對照，以水和非轉(zhuǎn)化植株為陰性對照對GsPPCK1和GsPPCK3各獲得抗性植株45、53株進行PCR檢測，擴增出約450bp的目的條帶(結果如圖5、6)。GsPPCK1和GsPPCK3基因PCR陽性率分別為37. 8%、35. 8%，表明基因GsPPCK1和GsPPCK3已經(jīng)整合到龍牧806苜蓿中。

圖5 轉(zhuǎn)GsPPCK1抗性植株的PCR鑒定

圖6 轉(zhuǎn)GsPPCK3抗性植株的PCR鑒定

2.3.2 PCR陽性植株的Real-time-PCR檢測

對PCR陽性植株進行Real-time-PCR分析，以野生型龍牧806紫花苜蓿為對照，檢測基因GsPPCK1和GsPPCK3的表達情況，在PCR陽性植株中GsPPCK1，GsPPCK3基因中各有兩株超量表達 (圖7所示)。

圖7 轉(zhuǎn)GsPPCK1、GsPPCK3基因抗性植株的Real-time PCR檢測

圖8 堿脅迫9d轉(zhuǎn)基因苜蓿與野生型苜蓿生長表型

2.4 轉(zhuǎn)基因株系的耐堿性分析

2.4.1 堿脅迫下轉(zhuǎn)基因苜蓿的生長情況

以上述NaHCO34個濃度處理9d后，未處理時轉(zhuǎn)基因苜蓿與野生型苜蓿的長勢基本一致(圖8A)；100 mmol/L NaHCO3脅迫處理的轉(zhuǎn)基因苜蓿仍能正常生長，表型明顯好于野生型，而野生型生長發(fā)育輕微受抑制，葉片逐漸變黃(見圖8B)。在200 mmol/L NaHCO3處理下，大部分野生型苜蓿葉片變黃、委焉，生長嚴重受阻。而轉(zhuǎn)基因苜蓿生長受到輕微抑制，但基本不影響其的正常生長，耐堿性明顯好于野生型(圖8C)。在250 mmol/L NaHCO3處理下，大部分野生型苜蓿已經(jīng)死亡，存活率僅為12. 7%，轉(zhuǎn)基因苜蓿生長也受到抑制，轉(zhuǎn)GsPPCK1基因苜蓿和GsPPCK3基因苜蓿的存活率分別是63. 5%和 67. 2%，明顯好于野生型(圖8D)。

2.4.2 堿脅迫下苜蓿葉綠素(Chl)含量的測定

經(jīng)100 mmol/L NaHCO3脅迫處理后，野生型和轉(zhuǎn)基因各株系的葉綠素含量隨脅迫濃度的增大均呈逐漸下降趨勢，但轉(zhuǎn)GsPPCK1和GsPPCK3苜蓿4個株系的葉綠素含量顯著高于野生型(圖9A、圖9B)且差異達到了極顯著水平(P<0. 01)，表明轉(zhuǎn)基因苜蓿耐堿能力高于非轉(zhuǎn)基因苜蓿。

圖9 不同NaHCO3濃度處理下轉(zhuǎn)基因苜蓿葉綠素含量的變化

2.4.3 堿脅迫下苜蓿的電導率及丙二醛含量的測定

轉(zhuǎn)基因苜蓿的電導率：在非鹽分脅迫條件下各株系細胞內(nèi)電解質(zhì)相對滲出率較低，在100 mmol/L NaHCO3處理下質(zhì)膜透性增大，野生型和轉(zhuǎn)GsPPCK1苜蓿(圖10A)、GsPPCK3苜蓿(圖10B)的相對電導率均呈現(xiàn)出增加的動態(tài)變化趨勢。4個轉(zhuǎn)基因株系的相對電導率低于野生型，差異極顯著(P<0. 01)。在200和250 mmol/L NaHCO3脅迫處理下，相對電導率均增加，但4個轉(zhuǎn)基因株系顯著低于野生型，差異極顯著。表明4個轉(zhuǎn)基因苜蓿株系具有較強的耐堿性。

轉(zhuǎn)基因苜蓿的丙二醛含量：在NaHCO3的堿脅迫下，隨著濃度增高，野生型與轉(zhuǎn)基因各株系的MDA含量均升高，但轉(zhuǎn)GsPPCK1苜蓿(圖11A)和GsPPCK3苜蓿(圖11B)的4個株系的MDA含量低于野生型，差異極顯著(P<0. 01)。說明4個轉(zhuǎn)基因株系與非轉(zhuǎn)基因苜蓿的膜脂過氧化程度較低遭受的傷害較輕。

圖10 不同NaHCO3濃度處理下轉(zhuǎn)基因苜蓿相對電導率的變化

圖11 不同NaHCO3濃度處理下轉(zhuǎn)基因苜蓿丙二醛含量的變化

2.4.3 堿脅迫下苜蓿的檸檬酸及脯氨酸(Pro)含量的測定

轉(zhuǎn)基因苜蓿的檸檬酸含量測定：在100 mmol/L NaHCO3的堿脅迫下，野生型和轉(zhuǎn)基因各株系的檸檬酸含量均升高，但轉(zhuǎn)GsPPCK1和GsPPCK3基因苜蓿和轉(zhuǎn)基因苜蓿中檸檬酸含量顯著高于野生型。隨著NaHCO3濃度增高，轉(zhuǎn)基因株系檸檬酸含量顯著高于野生型，達到極顯著水平(P<0. 01)(圖12A、B)。說明轉(zhuǎn)基因苜蓿在堿脅迫下積累有機酸能力強于非轉(zhuǎn)基因株系。

圖12 不同NaHCO3濃度處理下轉(zhuǎn)基因苜蓿檸檬酸含量的變化

圖13 不同NaHCO3濃度處理下轉(zhuǎn)基因苜蓿脯氨酸含量的變化

轉(zhuǎn)基因苜蓿脯氨酸(Pro)含量測定：在100 mmol/L NaHCO3處理下野生型WT和轉(zhuǎn)基因苜蓿間的脯氨酸含量均明顯增加，隨著脅迫處理濃度的增加，野生型苜蓿脯氨酸含量上升緩慢，而轉(zhuǎn)基因GsPPCK1苜蓿(圖13A)和轉(zhuǎn)GsPPCK3苜蓿(圖13B)中脯氨酸含量顯著高于野生型(P<0. 01)，說明轉(zhuǎn)基因苜蓿在堿處理下，脯氨酸積累能力強于非轉(zhuǎn)基因苜蓿。

2.4.4 堿脅迫下苜蓿的過氧化物歧化酶(SOD)及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEP羧化酶)活性的測定

SOD活性變化：在未處理條件下，野生型與轉(zhuǎn)基因苜蓿中的SOD活性差異不顯著 (P>0. 05)。隨著脅迫處理濃度的增加，轉(zhuǎn)基因GsPPCK1苜蓿(圖14A)和轉(zhuǎn)GsPPCK3苜蓿(圖14B)中SOD活性顯著高于野生型(P<0. 01)說明GsPPCK1，GsPPCK3基因的表達能夠在堿脅迫下提高轉(zhuǎn)基因苜蓿的SOD活性，進一步降低了堿脅迫對植株造成的氧化傷害。

圖14 不同NaHCO3濃度處理下轉(zhuǎn)基因苜蓿SOD酶活性的變化

圖15 不同NaHCO3濃度處理下轉(zhuǎn)基因苜蓿PEP羧化酶活性的變化

PEP羧化酶活性的變化：在未處理時PEP羧化酶活性差異不顯著(P>0. 05)。隨著脅迫處理濃度的增加，野生型苜蓿PEP羧化酶活性上升緩慢，而轉(zhuǎn)基因GsPPCK1苜蓿(圖15A)和轉(zhuǎn)GsPPCK3苜蓿(圖15B)中PEP羧化酶活性顯著高于野生型(P<0. 01)，說明堿脅迫能夠激活GsPPCK1、GsPPCK3基因的表達，在堿脅迫下提高轉(zhuǎn)基因苜蓿的PEP羧化酶活性從而增強了轉(zhuǎn)基因苜蓿的耐堿性。

3 討論

3.1 抗逆基因供體材料的選擇

非生物脅迫是影響農(nóng)作物產(chǎn)量的重要因素，對于培育出耐性強的作物已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的研究熱點之一，通過傳統(tǒng)育種的方法提高作物耐脅迫能力的效果非常有限。近十年來，對于植物逆境應答的分子基礎研究已經(jīng)取得了一定的進展，但是大量研究都著重于擬南芥，小麥，水稻等模式植物，非模式植物并未廣泛涉及。野大豆是栽培大豆的野生種，在長期的自然選擇過程中，野大豆受到低溫、鹽堿及干旱等惡劣環(huán)境的威脅，野大豆具備了極強的耐鹽堿和耐寒能力，還有豐富的耐逆基因資源。目前對研究其抗逆分子機理，克隆出耐逆相關基因[18]，對于作物的抗逆分子育種研究具有十分重要的現(xiàn)實意義。

3.2 目的基因的選擇

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶(PPCK)的作用：PPCK是一種典型的蛋白激酶，它不但在在光合作用中起重要作用，而且在非生物脅迫下發(fā)揮重要作用，胞質(zhì)pH過高時，能夠結合CO2產(chǎn)生草酰乙酸，從而降低胞質(zhì)pH。本研究選用堿脅迫應答相關的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶(phosphoenolpyruvate carboxylase kinase，PPCK)類的2個關鍵基因——GsPPCK1和GsPPCK3轉(zhuǎn)化苜蓿，均獲得了顯著耐鹽堿的轉(zhuǎn)基因苜蓿，也證明了該類基因在轉(zhuǎn)基因苜蓿中發(fā)揮了重要作用。

3.3 轉(zhuǎn)基因植株耐堿性相關生理指標檢測的選擇

堿脅迫對植物的危害主要體現(xiàn)在以下幾個方面：膜系統(tǒng)損傷、高pH值傷害、離子毒害等，因此針對以上幾個方面，選擇與其相關的生理指標來評價，更能說明轉(zhuǎn)基因材料的耐堿能力。本實驗選取的生理指標如下：葉綠素與光合作用相關，PPCK是光合作用中的關鍵酶，葉綠素含量間接體現(xiàn)出植物的光合能力；相對電導率反映堿脅迫對細胞膜損害情況；丙二醛是膜脂氧化的主要產(chǎn)物之一，反映了脅迫下植物質(zhì)膜破壞程度的大?。怀趸锲缁改軌虼呋蹶庪x子自由基轉(zhuǎn)變?yōu)镺2-和H2O2，能有效保護生物免受活性氧的傷害，從而穩(wěn)定生物膜的結構；脯氨酸在脅迫下的積累保證液泡、細胞質(zhì)及胞外環(huán)境中的滲透平衡：檸檬酸含量的多少反映了植物對pH調(diào)節(jié)的程度；PEPC是一種廣泛存在的代謝相關酶，在胞質(zhì)pH過高時，能夠調(diào)節(jié)胞質(zhì)pH，使植物在逆境中正常生長，其活性直接反映出植物的耐逆能力；因此本研究對轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因株系進行了這些指標的檢測。

本研究結果表明：在NaHCO3脅迫下，轉(zhuǎn)基因苜蓿的7項耐堿性指標，均優(yōu)于野生型，表明GsPPCK1，GsPPCK3基因在紫花苜蓿龍牧806中超量表達，明顯提高了轉(zhuǎn)基因苜蓿的耐堿性。本研究對于苜蓿耐鹽堿轉(zhuǎn)基因分子育種技術體系的建立及其產(chǎn)業(yè)化應用，開發(fā)利用鹽堿地資源、增加耕地面積，將起到積極作用。

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