任芳，王丹波

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽110004）

RASSF2基因甲基化與卵巢透明細胞癌的相關(guān)性

任芳，王丹波

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽110004）

目的探討RASSF2基因異常甲基化與卵巢透明細胞癌的相關(guān)性。方法分別通過甲基化特異性PCR技術(shù)及免疫組化技術(shù)檢測48例卵巢透明細胞癌組織中RASSF2基因的甲基化及蛋白表達情況。結(jié)果透明細胞癌組織中RASSF2基因的甲基化發(fā)生率（45.83%，22/48）及蛋白表達缺失發(fā)生率（47.92%，23/48）均顯著高于正常卵巢組織及癌旁異位內(nèi)膜組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。RASSF2基因甲基化與其蛋白表達缺失具有相關(guān)性。結(jié)論RASSF2基因異常甲基化所導(dǎo)致的蛋白表達缺失可能在卵巢透明細胞癌的發(fā)病機制中具有重要作用。

卵巢透明細胞癌；RASSF2；甲基化

卵巢透明細胞癌是卵巢上皮性癌的一種，占全部卵巢上皮性癌的5%～11%。由于卵巢透明細胞癌術(shù)后殘留腫瘤對化療藥物反應(yīng)性低，與其他類型卵巢上皮癌相比，卵巢透明細胞癌患者預(yù)后較差。因此，系統(tǒng)研究透明細胞癌的發(fā)病機制，實現(xiàn)對卵巢透明細胞癌的早期診斷和治療，甚至實現(xiàn)對其發(fā)病高危人群進行篩查，將會明顯改善其預(yù)后。然而目前卵巢透明細胞癌的發(fā)病機制尚不清楚?；騿幼訁^(qū)域的甲基化是導(dǎo)致基因表達沉默的一種重要表觀遺傳機制。研究表明，基因的異常甲基化是腫瘤發(fā)生過程的早期事件。同時在多種腫瘤中，DNA異常甲基化模式具有腫瘤特異性，以基因異常甲基化作為生物標記，不僅可以用于對疾病進行早期診斷及預(yù)后評估，還可用于對高危人群的檢測和評估。RASSF2基因是新近發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，該基因的異常甲基化在多種腫瘤的發(fā)生過程中具有重要的作用，而該基因異常甲基化與卵巢透明細胞癌的相關(guān)性尚未見文獻報道。本研究旨在通過檢測RASSF2基因在卵巢透明細胞癌組織中的甲基化及蛋白表達情況，探索RASSF2基因表觀失活與卵巢透明細胞癌的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 標本來源及組織獲取

收集2008年1月至2012年1月于中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科因卵巢透明細胞癌行手術(shù)治療患者的石蠟包埋標本48例作為實驗組，其中Ⅰ期28例，Ⅱ期12例，Ⅲ期8例，患者平均年齡為（50.38±7.63）歲。選取其中單側(cè)透明細胞癌病例對側(cè)正常卵巢組織20例作為對照組。石蠟組織連續(xù)切片10 μm，獲取對應(yīng)透明細胞癌組織及正常卵巢組織。同時所有入組卵巢透明細胞癌病例經(jīng)婦科病理專家根據(jù)Sampson［1］及Scott［2］提出的子宮內(nèi)膜異位癥（內(nèi)異癥）惡變診斷標準進一步閱片，確認其中12例符合卵巢內(nèi)異癥惡變診斷標準，為卵巢內(nèi)異癥惡變病例，另36例為原發(fā)卵巢透明細胞癌病例。在切割顯微鏡下用刀片或針頭對靶組織進行顯微切割。收集12例內(nèi)異癥惡變來源的透明細胞癌石蠟標本所對應(yīng)的癌旁異位內(nèi)膜組織8例（另4例因異位內(nèi)膜組織數(shù)量少，未行后續(xù)檢測）。以上組織的采集均得到患者本人或家屬知情授權(quán)及中國醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會的同意。

1.2 甲基化特異性PCR檢測組織中RASSF2基因的甲基化情況

按試劑盒說明采用德國QIAGEN公司試劑盒提取各組織基因組DNA。獲取的各組織基因組DNA經(jīng)亞硫酸氫鈉在55℃孵育16 h后經(jīng)美國Promega公司W(wǎng)izard Clean-up系統(tǒng)純化。經(jīng)NaOH終止修飾后，修飾后的基因組DNA重懸于雙蒸水中。在修飾過程中以經(jīng)過足量美國NEB公司SssⅠ甲基轉(zhuǎn)移酶處理的正常人外周血淋巴細胞基因組DNA作為陽性對照，以PBS代替SssⅠ甲基轉(zhuǎn)移酶處理作為陰性對照。修飾后DNA經(jīng)RASSF2甲基化及非甲基化特異性引物進行擴增，引物序列：RASSF2MF：5′-GTTCGTCGTCGTTTTTTAGGCG-3′，RASSF2MR：5′-AAAAACCAACGACCCCCGCG-3′（148 bp），RASSF2UF：5′-AGTTTGTTGTTGTTTTTTAGGTGG-3′，RASSF2UR：5′-AAAAAACCAACAACCCCCACA-3′（154 bp），擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后，紫外燈下觀察結(jié)果。

1.3 免疫組化技術(shù)檢測組織中RASSF2蛋白表達情況

通過免疫組化SP法結(jié)合DAB顯色檢測各組織中RASSF2蛋白表達，具體步驟參照文獻［3］。一抗RASSF2山羊抗人多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）以1∶100稀釋，以PBS替代一抗作為陰性對照及試劑盒附帶陽性對照作為陽性對照。RASSF2蛋白正常表達于細胞質(zhì)，免疫組織化學(xué)結(jié)果判定由2人在雙盲的情況下進行光學(xué)顯微鏡觀察，按陽性細胞百分比及陽性細胞染色強度評分，HIS=a×b。a代表陽性細胞的百分比對應(yīng)的評分：a=0，無陽性細胞顯色；a=1，陽性細胞顯色數(shù)＜10%；a=2，陽性細胞顯色數(shù)10%～50%；a=3，陽性細胞顯色數(shù)＞50%。b代表陽性細胞染色強度：b=0，不顯色；b=1，淺黃色；b=2，棕黃色；b=3，深黃色。判定標準：HIS 0～3分為陰性；HIS 4～9分為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS13.0軟件，采用χ2檢驗及Fisher確切概率法比較各組RASSF2基因甲基化差異及RASSF2基因甲基化與其蛋白表達缺失的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組織中基因RASSF2異常甲基化情況

通過甲基化特異性PCR技術(shù)檢測各個組織中RASSF2基因的甲基化情況（圖1），結(jié)果表明，12例內(nèi)異癥惡變相關(guān)卵巢透明細胞癌組織中RASSF2基因甲基化發(fā)生率為58.33%（7/12），36例非病理證實惡變來源的卵巢透明細胞癌組織中RASSF2基因甲基化發(fā)生率為41.67%（15/36），8例癌旁異位內(nèi)膜組織中僅有1例檢測到該基因的異常高甲基化，正常卵巢組織中均未檢測到該基因的異常甲基化。2種起源卵巢透明細胞癌組織中RASSF2基因甲基化發(fā)生率均顯著高于正常卵巢組織及異位內(nèi)膜組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；2種來源卵巢透明細胞癌組織比較RASSF2基因甲基化發(fā)生率無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

圖1 卵巢透明細胞癌中RASSF2甲基化特異性PCR結(jié)果Fig.1 Methylation?specific PCR of RASSF2in the tissue of ovarian clear cell cancer

2.2 各組織中RASSF2蛋白表達情況

通過免疫組化技術(shù)檢測各個組織中RASSF2蛋白表達情況（圖2），RASSF2蛋白主要表達于細胞質(zhì)。48例卵巢透明細胞癌組織中RASSF2蛋白表達缺失發(fā)生率為47.92%（23/48），而20例正常卵巢組織中均檢測到RASSF2蛋白正常表達，8例癌旁異位內(nèi)膜組織中有1例檢測到該蛋白表達缺失。該結(jié)果表明，卵巢透明細胞癌組織中RASSF2蛋白表達缺失率顯著高于正常卵巢組織及癌旁異位內(nèi)膜組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。同時，獲取的全部76例組織（卵巢透明細胞癌48例，異位內(nèi)膜8例，正常卵巢組織20例）中，發(fā)生RASSF2基因甲基化組織23例，其中有22例檢測到RASSF2蛋白表達缺失。RASSF2基因非甲基化組織53例，其中僅有2例檢測到RASSF2蛋白表達缺失，RASSF2基因的異常甲基化與該基因蛋白表達缺失具有相關(guān)性（P＜0.05）。

圖2 卵巢透明細胞癌組織中免疫組化染色檢測RASSF2蛋白表達情況S?P法×200Fig.2 RASSF2 protein expression in the tissue of clear cell ovarian carcinoma by immunohistochemistry S?P×200

3 討論

卵巢透明細胞癌于1973年被世界衛(wèi)生組織正式作為一個獨立的亞型歸類為卵巢上皮性腫瘤。由于卵巢透明細胞癌增殖能力較低、對化療藥物易產(chǎn)生耐藥性等原因，與其他上皮性癌相比預(yù)后不良。既往觀點認為卵巢透明細胞癌的來源有兩種，一種是來源于卵巢內(nèi)異癥惡變，另一種認為其主要來源于苗勒氏管。而近年來關(guān)于卵巢癌發(fā)生機制的“二元發(fā)病模型”學(xué)說［4］值得關(guān)注，“二元發(fā)病模型”的核心為卵巢癌外起源學(xué)說，該學(xué)說認為卵巢癌來自于卵巢外的種植，即漿液性腺癌來自輸卵管傘端黏膜上皮的病變，子宮內(nèi)膜樣和透明細胞腫瘤來自異位的子宮內(nèi)膜，黏液性和移行細胞腫瘤則有可能來自卵巢旁Wathard細胞巢，這一假說已經(jīng)得到一些基礎(chǔ)研究證實。由此，卵巢透明細胞癌系內(nèi)異癥起源已被多數(shù)學(xué)者所接受［5］。

本研究入選的48例卵巢透明細胞癌病例中，有12例根據(jù)病理所見確診為卵巢內(nèi)異癥惡變相關(guān)性卵巢透明細胞癌，其余36例未得到惡變診斷的病理證實，該結(jié)果似乎與卵巢癌外起源學(xué)說相悖，分析該現(xiàn)象的原因可能為內(nèi)異癥惡變有著嚴格的病理診斷標準，由于惡變后生長旺盛的腫瘤組織破壞了起源組織，同時由于內(nèi)異癥具有病理變化多態(tài)性的特點，以致找不到內(nèi)異癥惡變的組織學(xué)依據(jù)；另外，病理取材的局限性（病理取材只有大體標本的2%或1%），漏診了同時存在的內(nèi)異癥，而未能病理證實全部卵巢透明細胞癌為內(nèi)異癥惡變來源。本研究分別檢測2種不同來源卵巢透明細胞癌組織中RASSF2基因甲基化情況后發(fā)現(xiàn)，內(nèi)異癥惡變相關(guān)性卵巢透明細胞癌組織中，RASSF2基因甲基化發(fā)生率與非病理證實惡變的卵巢透明細胞癌組織中該基因的甲基化發(fā)生率無統(tǒng)計學(xué)差異，該結(jié)果也進一步支持2組卵巢透明細胞癌可能同為卵巢內(nèi)異癥惡變來源這一觀點。

RASSF2基因是Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族成員，該基因編碼的蛋白含有Ras作用域，能夠能通過該Ras作用域以GTP依賴的方式與K-Ras作用，是Ras基因的負效應(yīng)子，作為一種抑癌基因在Ras信號傳導(dǎo)通路上起到重要的樞紐作用［6］。RASSF2在人體內(nèi)廣泛表達，在多種原發(fā)性惡性腫瘤及腫瘤細胞系中發(fā)現(xiàn)了由于異常甲基化所導(dǎo)致的RASSF2基因的表達下調(diào)［7，8］。本研究表明，卵巢透明細胞癌組織中RASSF2基因的甲基化發(fā)生率顯著升高，蛋白表達明顯下降，表明RASSF2基因異常甲基化所導(dǎo)致的蛋白表達缺失可能在卵巢透明細胞癌的發(fā)病機制中具有重要作用。

Akino等［9］研究發(fā)現(xiàn)，RASSF2基因的表觀的失活能夠增強K-Ras基因介導(dǎo)的致癌性轉(zhuǎn)化。同時，在胃癌相關(guān)研究也中發(fā)現(xiàn)，RASSF2基因下調(diào)可能通過直接或間接激活Ras基因通路而抑制細胞凋亡、促進炎性反應(yīng)及促進血管生成，進而在腫瘤形成過程中發(fā)揮重要作用［10］。Otsuka等［11］認為，Ras基因的異常激活導(dǎo)致其表達上調(diào)在卵巢內(nèi)異癥惡變?yōu)槁殉餐该骷毎┑倪^程中發(fā)揮重要作用，而RASSF2基因作為Ras信號傳導(dǎo)通路的負性調(diào)控子［12，13］，是否通過其異常甲基化調(diào)控Ras信號傳導(dǎo)通路而在卵巢透明細胞癌的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用尚待進一步證實，這也將是本研究后續(xù)需要進行研究的課題內(nèi)容之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，卵巢透明細胞癌中RASSF2基因的異常甲基化發(fā)生率及其所導(dǎo)致的蛋白表達缺失率顯著增加，提示RASSF2基因異常甲基化所導(dǎo)致的蛋白表達失活可能與卵巢透明細胞癌的發(fā)生相關(guān)，后續(xù)有待于進一步深入研究其在卵巢透明細胞癌發(fā)生過程中的作用機制。

［1］Sampson JA.Endometrial carcinoma of the ovary，arising in endometrial tissue in that organ［J］.Arch Surg，1925，10：1-72.

［2］Scott RB.Malignant changes in endometriosis［J］.Obstet Gynecol，1953，2（3）：283-289.

［3］王勁歐，呂慶杰，姜衛(wèi)國，等.B7-H4在卵巢癌的表達及意義［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2009，38（4）：299-301.

［4］孔北華.重視卵巢癌的二元論模型與卵巢外起源新說［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2011，46（10）：721-724.

［5］Veras E，Mao TL，Ayhan A，et al.Cystic and adenofibromatous clear cell carcinomas of the ovary：distinctive tumors that differ in their pathogenesis and behavior：a clinicopathologic analysis of 122 cases［J］.Am J Surg Pathol，2009，33（6）：844-853.

［6］Vos MD，Ellis CA，Elam C，et al.RASSF2 is a novel K-Ras-specific effector and potential tumor suppressor［J］.J Biol Chem，2003，278（30）：28045-28051.

［7］Schagdarsurengin U，Richter AM，Hornung J，et al.Frequent epigenetic inactivation of RASSF2 in thyroid cancer and functional consequences［J］.Mol Cancer，2010，9：264.

［8］Guerrero-Setas D1，Pérez-Janices N，Blanco-Fernandez L，et al. RASSF2 hypermethylation is present and related to shorter survival in squamous cervical cancer［J］.Mod Pathol，2013，26（8）：1111-1122.

［9］Akino K，Toyota M，Suzuki H，et al.The Ras effector RASSF2 is a novel tumor-suppressor gene in human colorectal cancer［J］.Gastroenterology，2005，129（1）：156-169.

［10］Maruyama R，Akino K，Toyota M，et al.Cytoplasmic RASSF2A is a proapoptotic mediator whose expression is epigenetically silenced in gastric cancer［J］.Carcinogenesis，2008，29（7）：1312-1318.

［11］Otsuka J，Okuda T，Sekizawa A，et al.K-ras mutation may promote carcinogenesis of endometriosis leading to ovarian clear cell carcinoma［J］.Med Electron Microsc，2004，37（3）：188-192.

［12］Donninger H，Hesson L，Vos M，et al.The Ras effector RASSF2 controls the PAR-4 tumor suppressor［J］.Mol Cell Biol，2010，30（11）：2608-2620.

［13］Park HW，Kang HC，Kim IJ，et al.Correlation between hypermethylation of the RASSF2A promoter and K-ras/BRAF mutations in microsatellite-stable colorectal cancers［J］.Int J Cancer，2007，120（1）：7-12.

（編輯 陳姜）

Investigation on the Correlation between Hypermethylation of RASSF2and Clear CellOvarian Carcinoma

RENFang，WANGDan-bo
（DepartmentofObstetricsand Gynecology，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the correlation between hypermethylation ofRASSF2and ovarian clear cell carcinoma.MethodsMethylation-specific PCR and immunohistochemistry were performed in 48 ovarian clear cell carcinoma samples to detect the methylation status and protein expression ofRASSF2，respectively.ResultsIn the ovarian clear cell carcinoma tissue，methylation frequency（45.83%，22/48）and absence of protein expression ofRASSF2（47.92%，23/48）was higherthan thatin both normalovarian tissue and ectopic endometria adjacentto the cancerous region，respectively（P＜0.05）.Absence of protein expression ofRASSF2was significantly correlated with the hypermethylation of the gene.Con?clusionEpigenetic inactivation ofRASSF2by promoterhypermethylation may be associated with the pathogenesis ofclearcellovarian carcinoma.

ovarian clear cell cancer；RASSF2；hypermethylation

R711.75

A

0258-4646（2014）11-0969-04

國家自然科學(xué)基金（81070467，30471816）；沈陽市科學(xué)技術(shù)計劃（F14-231-55）

任芳（1981-），女，主治醫(yī)師，博士.

王丹波，E-mail：wangdb@sj-hospital.org

2014-08-29

網(wǎng)絡(luò)出版時間：