邵瓊琰王 平任金平張小燕黎軍英戎念杭

皮膚光老化動(dòng)物模型的建立和超微結(jié)構(gòu)觀察

邵瓊琰1王 平2?任金平1張小燕1黎軍英3戎念杭3

目的: 構(gòu)建光敏劑結(jié)合UVA誘導(dǎo)的小鼠皮膚光老化模型。方法: ICR小鼠分為3組:模型組外用1%甲氧沙林溶液(8－MOP)后進(jìn)行UVA照射、單純UVA照射組和空白對(duì)照組。照射后觀察皮膚外觀表現(xiàn)、病理學(xué)變化和超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，確定各組誘導(dǎo)皮膚光老化進(jìn)程的累積照射劑量和時(shí)間。結(jié)果: 單純UVA照射組在第45天，UVA劑量約720 J/cm2時(shí)，肉眼觀察皮膚外觀、組織病理方面和超微結(jié)構(gòu)都呈現(xiàn)比較典型的光老化表現(xiàn)；模型組(8－MOP/UVA)小鼠在第3天，UVA累積劑量約47 J/ cm2時(shí)，透射電鏡下可見角質(zhì)形成細(xì)胞和基底層黑素細(xì)胞的顯著凋亡(核固縮)；第5天，UVA累積劑量約78 J/cm2時(shí)，病理示:真皮層部分彈性纖維變性；隨著照射劑量的增加，第6天UVA累積劑量達(dá)95 J/cm2時(shí)，出現(xiàn)典型的光老化表現(xiàn)，透射電鏡下可清晰觀察到彈性纖維和膠原蛋白束的病理改變。結(jié)論: 8－MOP/UVA可以快速誘導(dǎo)小鼠皮膚光老化模型的建立。

皮膚光老化； 動(dòng)物模型； 超微結(jié)構(gòu)

皮膚光老化是紫外線(尤其是長波紫外線)長期照射引起的慢性光損傷。1皮膚光老化不僅導(dǎo)致皮膚屏障破壞引起皮膚抵抗力降低，還可致色素沉著、皺紋明顯等皮膚損容，特別是很多皮膚惡性腫瘤，如鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌或黑素瘤均與慢性光損傷有關(guān)。2動(dòng)物模型是研究皮膚光老化的一種重要的客觀工具。但造模方法沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，很多方法周期較長、且判斷標(biāo)準(zhǔn)不一。因此，快速、客觀達(dá)到具有典型皮膚光老化臨床組織學(xué)改變的造模方法，對(duì)研究光老化具有實(shí)際意義。3本研究應(yīng)用1%甲氧沙林溶液外用后重復(fù)長波紫外線(8－MOP/UVA)照射，觀察不同劑量下臨床病理學(xué)表現(xiàn)及超微結(jié)構(gòu)變化，確定建立光老化動(dòng)物模型的最佳照射劑量與時(shí)間點(diǎn)，為皮膚光老化研究提供一種快速、客觀的動(dòng)物模型標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠(清潔級(jí)，購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，7～8周齡，合格證:SCXK(滬) 2008－0016，雌鼠36只，體質(zhì)重20±5 g。

1.2 主要儀器和試劑 紫外線光療儀(Sigma公司)，長波紫外線輻照度監(jiān)視計(jì)(Sigma公司)，熒光顯微鏡(OLYMPUSBX51，日本奧林巴斯公司)，數(shù)碼攝像系統(tǒng)(DP72，日本奧林巴斯公司)，甲氧沙林溶液(1%的8－MOP溶液，重慶華邦制藥有限公司)，環(huán)境透射電子顯微鏡(H－9500，Hitachi)

1.3 分組及處理 將ICR小鼠隨機(jī)分為3組:模型組(8－MOP/UVA)、單純UVA照射組和空白對(duì)照組，各12只。每只小鼠用電動(dòng)剃發(fā)刀將背部毛剃干凈，面積2 cm×2 cm?？瞻讓?duì)照組不做特殊處理。模型組:將1%甲氧沙林溶液涂抹于小鼠背部皮膚暴露部位，1～2 h后，將裝有實(shí)驗(yàn)小鼠的透明盒子放在紫外線光療儀燈具正下方2 cm處，給予26 mW/cm2的UVA照射，每次10 min左右，總計(jì)6天(經(jīng)用UVA輻射度監(jiān)視器測得能量為1.1 mW/cm2，累積強(qiáng)度95 J/ cm2)。單純UVA組小鼠裸露的背部不做特殊處理，直接用紫外線光療儀照射，其余步驟同模型組，第6天和第45天輻射累積強(qiáng)度分別達(dá)95 J/cm2和720 J/ cm2左右時(shí)結(jié)束造模。

1.4 組織病理 造模結(jié)束后各組取皮膚組織做常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡觀察皮膚表皮和真皮的組織結(jié)構(gòu)。

1.5 透射電鏡掃描 選取樣本戊二醛和鋨酸雙固定，常規(guī)制作透射電鏡樣本。

2 結(jié)果

2.1 正常對(duì)照組 臨床觀察小鼠皮膚色澤正常、光滑、富有彈性(圖1a)，HE染色(圖1b)示小鼠表皮組織結(jié)構(gòu)完整，表皮細(xì)胞排列整齊，有明顯的表皮突和真皮乳頭；真皮層可見波浪狀纖維組織，分布均勻，疏密有致。透射電鏡下(圖1c)可見密集的彈性纖維，形狀細(xì)長均勻、線形分布，排列方向一致，被包裹在密集的膠原蛋白網(wǎng)中；整個(gè)真皮層可見膠原蛋白束，它們排列密集，橫截面直徑均勻。

2.2 單純UVA照射組 第6天UVA劑量約95 J/ cm2時(shí)，臨床無明顯變化(圖2a)，皮膚色澤、質(zhì)地正常。HE染色和透射電鏡示皮膚結(jié)構(gòu)基本正常，偶見彈性纖維斷裂(圖2b黑色箭頭)，表皮和真皮交界處的結(jié)構(gòu)完整(圖2c黑色箭頭)，真皮層彈性纖維疏密有秩(圖2c)。第45天UVA劑量約720 J/cm2時(shí)，臨床病理和超微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出比較典型的光老化表現(xiàn)，粗細(xì)不等的皺紋(圖2d)，膠原纖維模型變性，并可見無定型物質(zhì)，彈性纖維變性(圖2e黑色箭頭)，表皮層和真皮層交界處的結(jié)構(gòu)完全破壞(圖2f黑色箭頭)，彈性纖維排列紊亂、斷裂、破碎(圖2f黃色箭頭)。

2.3 模型組 第3天UVA劑量約47 J/cm2時(shí)，臨床僅表現(xiàn)局部色素沉著(圖3a)。組織病理HE染色可見彈性組織變性開始于真皮網(wǎng)狀層和乳頭層交界處4(圖3b黑色箭頭)，出現(xiàn)破碎、斷裂、扭曲等現(xiàn)象。透射電鏡下可見表皮基底層黑素細(xì)胞輕度核異質(zhì)(圖3c黃色箭頭)、黑素細(xì)胞核濃縮(圖3c黑色箭頭)現(xiàn)象；真皮層彈性纖維和膠原蛋白束未見明顯改變。

第5天UVA劑量約78 J/cm2時(shí)，小鼠背部照射區(qū)域的皮膚出現(xiàn)進(jìn)行性彈性喪失、干燥、細(xì)小皺紋(圖3d黑色箭頭)。組織病理HE染色示表皮和真皮層明顯增厚，表皮結(jié)構(gòu)基本完整，真皮乳頭突出不明顯，彈性纖維變性、破壞，不規(guī)則增厚、雜亂無章(圖3c)。透射電鏡下可見表皮基底層黑素細(xì)胞中度核異質(zhì)(圖3f黃色箭頭)，部分彈性纖維扭曲、排列紊亂，散亂分布在膠原蛋白網(wǎng)中，部分膠原蛋白束分離、散亂、大小不一(圖3f黑色箭頭)；表皮層和真皮層交界處的結(jié)構(gòu)基本完整。

圖1 空白對(duì)照組

圖2 單純UVA照射組

隨著劑量進(jìn)一步增加，第6天達(dá)到95 J/cm2時(shí)小鼠背部照射區(qū)域的皮膚出現(xiàn)粗大的橫向皺紋(圖3g)。組織病理HE染色(圖3h)示表皮萎縮，波浪形狀異常，甚至平行；真皮層的彈性纖維發(fā)生大范圍破壞和變性，部分出現(xiàn)均質(zhì)化，排列紊亂，分布不均勻或稀疏，并伴有炎性細(xì)胞浸潤。透射電鏡可見明顯的彈性纖維散亂，它們從膠原蛋白束中分離出來，分布不規(guī)則，周邊被一些無定型的物質(zhì)包裹，可能是一些黏多糖物質(zhì)；大量破碎的膠原纖維，散亂腫脹，輪廓不清呈團(tuán)塊狀，部分呈均質(zhì)化改變，分布在彈性基質(zhì)中(圖3i黑色箭頭)；表皮和真皮層交界處的結(jié)構(gòu)異常，黑素細(xì)胞出現(xiàn)顯著的核異質(zhì)(圖3i黃色箭頭)。

3 討論

皮膚光老化的臨床跡象為光暴露部位斑駁的色素沉著，皮膚松弛、出現(xiàn)粗細(xì)不等的皺紋，呈皮革樣，色澤灰黃等外觀，5產(chǎn)生的原因是環(huán)境對(duì)皮膚日積月累的破壞作用，其中紫外線輻射是主要因素。紫外線根據(jù)波長和能量的不同分為長波紫外線(UVA，320～400 nm)、中波紫外線(UVB，290～320 nm)和短波紫外線(200～290 nm)，照射到地球表面主要是UVA和UVB，兩者對(duì)生物體影響是不同的。6UVB大多在表皮吸收，主要影響表皮細(xì)胞，即角質(zhì)形成細(xì)胞；與UVB相比較，UVA可以更深入地滲透皮膚，同時(shí)影響到表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞，引起機(jī)體的免疫抑制、光老化、眼部損害和皮膚癌等。7－9

國內(nèi)外皮膚光老化試驗(yàn)研究動(dòng)物模型的造模方法以及檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷某晒εc否仍沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。目前文獻(xiàn)上報(bào)道一般是用大鼠、小鼠或者豚鼠作為動(dòng)物模型，我們選ICR小鼠建模的原因?yàn)?，其價(jià)格低廉，適用性廣，而且通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄔ炷：?，可以出現(xiàn)典型的光老化特征。建模方法較常用的是UVA聯(lián)合UVB造模，這種方法可能更加客觀，但造模時(shí)間較長，一般需要8～12周，10，11或者單純使用高劑量UVA，至少6周。12與單純使用高劑量UVA相比，8－MOP/UVA除了時(shí)間的優(yōu)勢以外，在臨床表現(xiàn)方面，皮膚照射損害相對(duì)較小，皺紋卻更加明顯。有文獻(xiàn)報(bào)道8－MOP/ UVA作用可引起體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞迅速出現(xiàn)細(xì)胞衰老的改變，13通過8－MOP/UVA可以快速誘導(dǎo)小鼠皮膚光老化模型的建立。在初步研究中使用數(shù)量有限的小鼠，通過光老化組織學(xué)方面的驗(yàn)證，以實(shí)現(xiàn)合理的具有成本效益的實(shí)驗(yàn)評(píng)估。

圖3 模型組

組織病理學(xué)是評(píng)估皮膚光老化比較經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)方法，但在早期不典型的臨床表現(xiàn)中，電鏡下超微結(jié)構(gòu)能夠更加客觀反映紫外線照射皮膚產(chǎn)生的漸進(jìn)性光老化組織病理變化。14我們觀察到在早期階段表皮增厚，可能是一種皮膚對(duì)外界抵抗性的自我保護(hù)反應(yīng)，而晚期表皮則出現(xiàn)萎縮；真皮層彈性纖維一般是從網(wǎng)狀層和乳頭層交界處開始變性，隨著照射劑量的增加，彈性纖維從小范圍到大面積變性。電鏡下觀察到黑素體在角質(zhì)細(xì)胞中分布不規(guī)則，黑色素增加，出現(xiàn)黑素細(xì)胞核異質(zhì)現(xiàn)象；15，16真皮與表皮結(jié)合處的結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)像手指樣突起的異常結(jié)構(gòu)。17以上這些觀察結(jié)果與其他作者的報(bào)道類似，且都強(qiáng)調(diào)并認(rèn)為真皮彈性組織變性是動(dòng)物經(jīng)過紫外線反復(fù)照射建立皮膚光老化模型最為顯著的組織學(xué)特征。14，18

目前臨床皮膚光老化的發(fā)病機(jī)制尚不明確，我們通過8－MOP/UVA更加經(jīng)濟(jì)、快速的建立動(dòng)物光老化模型對(duì)研究光老化機(jī)制和治療光老化有著重要的意義。

1 Battie C，Verschoore M.Cutaneous solar ultraviolet exposure and clinical aspects of photodamage.Indian JDermatol Venereol Leprol，2012，78(Suppl 1):S9－S14.

2 BurnettME，Hu JY，Wang SQ.Sunscreens:obtaining adequate photoprotection.Dermatol Ther，2012，25(3):244－251.

3 Liang H，Li J，Zhang L.Establishment ofmus skin photo－damagemodel by 8－MOP plus UVA irradiation.JHuazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2007，27(6):742－744.

4 Berneburg M，Plettenberg H，Krutmann J.Photoaging of human skin.Photodermatol Photoimmunol Photomed，2000，16(6):239－244.

5劉瑋.皮膚光老化.臨床皮膚科雜志，2003，7:424－426.

6 Tuchinda C，Srivannaboon S，Lim HW.Photoprotection by window glass，automobile glass，and sunglasses.JAm Acad Dermatol，2006，54(5):845－854.

7Markova A，Weinstock MA.Risk of skin cancer associated with the use of UV nail lamp.J Invest Dermatol，2013，133(4):1097－1099.

8 Bens G.Sunscreens.Adv Exp Med Biol，2008，624:137－161.

9 Yam JC，Kwok AK.Ultraviolet light and ocular diseases.Int Ophthalmol，2014，34(2):383－400.

10郭魯義，李春雨，張寧，等.實(shí)用光老化動(dòng)物模型建立方法的探討.中國美容醫(yī)學(xué)，2008，2:235－237.

11楊汝斌，萬屏，劉玲，等.SD大鼠皮膚光老化動(dòng)物模型建立方法的探索.中國皮膚性病學(xué)雜志，2011，3:199－202.

12楊斌，刁慶春，鐘白玉，等.番茄紅素對(duì)長波紫外線照射大鼠皮膚中丙二醛形成和基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的抑制作用.中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志，2006，6:358－361.

13 Borlon C，Debacq－Chainiaux F，Hinrichs C，et al.The gene expression profile of psoralen plus UVA－induced premature senescence in skin fibroblasts resembles a combined DNA－damage and stress－induced cellular senescence response phenotype.Exp Gerontol，2007，42(9):911－923.

14Haftek M，Mac－Mary S，Le Bitoux MA，et al.Clinical，biometric and structural evaluation of the long－term effects of a topical treatmentwith ascorbic acid and madecassoside in photoaged human skin.Exp Dermatol，2008，17(11):946－952.

15 Feng Y，Zhao J，Gold MH.Skin rejuvenation in asian skin: the analysis of clinical effects and basic mechanisms of intense pulsed light.JDrugs Dermatol，2008，7(3):273－279.

16Hughes MC，Bredoux C，Salas F，et al.Comparison of histological measures of skin photoaging.Dermatology，2011，223 (2):140－151.

17 Amano S.Possible involvement of basementmembrane damage in skin photoaging.J Investig Dermatol Symp Proc，2009，14 (1):2－7.

18 Peres PS，Terra VA，Guarnier FA，et al.Photoaging and chronological aging profile:Understanding oxidation of the skin.JPhotochem Photobiol B，2011，103(2):93－97.

(收稿:2013－09－27 修回:2013－11－12)

An animalmodel for photoaging induced by photosensitizer p lus ultraviolet A irradiation:pathologic and ultrastructure study

SHAO Qiong-yan，WANG Ping，REN Jin-ping，et al.Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine，the Second Clinical Medical College，310053

Objective:To construct amice photoagingmodel induced by photosensitizer combined with ultraviolet A(UVA).Methods:The ICRmice were divided into three groups:In group one themice were treated with topical 1%methoxypsoralen(8－MOP)solution plus repeated UVA exposure，(8－MOP/UVA)；In group two，only repeated UVA irradiation was used and group threewas blank control group.After irradiation，by observing the clinical，pathological and ultrastructural features in different stage，photoaging processwere correlated with cumulative radiation dose and time.Results:In group two when the UVA dosewas about720 J/cm2at the day 45，the clinicalmanifestations，pathology and ultrastructure showed typicalmanifestation of photoaging.In group one(8－MOP/UVA group)at the time of the day 3，with UVA dose about47 J/cm2，although no clinical changeswere found，mild broken and twisted elastic fibers at the superficial dermisand also numerous apoptotic keratinocytes and melanocytes were seen under both lightmicroscope and transmission electron microscope(TEM).Clinical changes occurred at day 5 with accumulated UVA dose about 78 J/cm2，presented with dull skin，fine lines，mottled pigmentation，accompanied by obvious degeneration of elastic fibers in the dermis.On day 6 with UVA dose about95 J/cm2，typical clinical feature of photoaging with coarse transverse wrinkles，and pathologically large proportion ofelastic fibers degenerated were presented，especially under TEM.Conclusion:An animalmodel for photoaging can be quickly induced by 8－MOP/UVA.

skin photoaging；animalmodel；ultrastructure

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào):Y208112)

杭州市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)專科專病項(xiàng)目(編號(hào):20100733Q08)

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床學(xué)院，杭州，310053

2杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科，浙江，310009

3浙江大學(xué)電鏡中心生物分中心，310012

?通信作者