劉 瑤王逸飛張春敏?張春紅魏 國孫 靜劉園園

5－ALA－PDT對人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞的抑制作用

劉 瑤1王逸飛2張春敏1?張春紅1魏 國1孫 靜3劉園園1

目的: 確定5－ALA－PDT對人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞的抑制作用。方法: 用5－ALA與A431細(xì)胞共同孵育，經(jīng)630 nm紅光照射后，采用MTT法檢測細(xì)胞生長的抑制率，確定培育時(shí)間、5－ALA濃度及光照劑量對皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果: 當(dāng)光照劑量為80 J/cm2和5－ALA濃度為3.2mmol/L，5－ALA與A431細(xì)胞共同孵育120 min時(shí)，抑制率最大。結(jié)論: 5－ALA－PDT對體外培養(yǎng)的A431細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用。

5－ALA； 鱗狀細(xì)胞癌

皮膚鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)是起源于表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的一種惡性腫瘤，具有病因復(fù)雜、臨床誤診率高、惡性程度大及侵襲性和破壞性強(qiáng)等特點(diǎn)。1目前皮膚鱗癌的治療方法有手術(shù)切除、放射治療、外用藥物治療及光動力治療等。光動力療法(Photodynamic therapy，PDT)又被稱為光輻射療法(Photoratiation Therapy，PRT)或光化學(xué)療法(Photochemotherapy)，是一種正在研究中的、治療某些體表良惡性病變的有效方法，它是由光能激發(fā)光敏劑后引起的一種光化學(xué)反應(yīng)，可選擇性地破壞生物組織，部分成果已經(jīng)應(yīng)用于臨床。2

5－氨基酮戊酸－PDT(5－ALA－PDT)治療SCC的資料并不多。本研究采取MTT法檢測5－ALA－PDT對體外培養(yǎng)的A431細(xì)胞的殺傷作用，目的是為臨床應(yīng)用5－ALA－PDT治療皮膚鱗狀細(xì)胞癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來源 人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞購自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)液(Hyclon公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)，胰蛋白酶(Hyclon公司)，MTT(sciencell公司)，DMSO(北京索萊寶科技有限公司)。

1.1.3 主要儀器 倒置光學(xué)顯微鏡(日本奧林帕斯CK40)，超凈工作臺(蘇州蘇凈集團(tuán)安泰公司)，二氧化碳孵箱(新加坡ESCO)，紫外分光光度計(jì)(英國Biochrom)，光動力儀器(桂林興達(dá)光電醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在37℃、含5%CO2及飽和濕度的孵箱中，用含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞及人皮膚鱗癌A431細(xì)胞，每2天更換培養(yǎng)液1次。實(shí)驗(yàn)選用對數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.2.2 MTT檢測 (1)取對數(shù)生長期的A431細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基配成濃度為4×105/mL細(xì)胞懸液；(2)接種在96孔培養(yǎng)板，每孔200μL，每組設(shè)9個(gè)復(fù)孔，分為空白組(調(diào)零)、實(shí)驗(yàn)組(6組)和陰性對照組(不加藥物的細(xì)胞)，在37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞完全貼壁后進(jìn)行PDT處理；(3)棄去上清液，用PBS洗3次，然后每孔加入20μL含MTT的無血清培養(yǎng)基，37℃再培養(yǎng)4 h；(4)棄上清液，每孔加150μL DMSO震蕩溶解10 min，使紫色結(jié)晶完全溶解，在酶聯(lián)免疫檢測分析儀570 nm處測定各孔吸光度值OD值，重復(fù)3次，取3次結(jié)果的平均值。細(xì)胞生長抑制率＝[1－(實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值)]×100%；(5)光敏劑5－ALA用無血清的DMEM培養(yǎng)基配制成0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mmol/L濃度的工作液；(6)5－ALA本身對A431細(xì)胞的影響:同上法將細(xì)胞接種于96孔板，每組加入5－ALA濃度分別為0(對照組)、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mmol/L，不照光；(7)單獨(dú)光照劑量對A431細(xì)胞的影響:同上法將細(xì)胞接種于96孔板，不加入5－ALA，進(jìn)行照光，光照劑量分別為0 (對照組)、20、40、60、80、100、120 J/cm2；(8)培育時(shí)間對PDT效果的影響:同上法將細(xì)胞接種于96孔板，分別于照光前30 min、60 min、90 min、120min、150 min、180min加入5－ALA，使得每孔濃度為3.2mmol/ L，光照劑量為80 J/cm2；(9)5－ALA濃度對PDT效果的影響:同上法將細(xì)胞接種于96孔板，每組5－ALA濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mmol/L。置培養(yǎng)箱培育120 min后照光，光照劑量為80 J/cm2；(10)光照劑量對PDT效果的影響:同上法將細(xì)胞接種于96孔板，加入5－ALA濃度為3.2 mmol/L，孵育時(shí)間為120 min，光照劑量分別為20、40、60、80、100、120 J/cm2進(jìn)行照光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件處理，生存期及抑制率以ˉx±s表示，行單向方差分析(F檢驗(yàn))，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 單獨(dú)照光及單獨(dú)加藥對A431細(xì)胞并無抑制或促進(jìn)其生長作用。

2.2 光照劑量(80 J/cm2)和5－ALA濃度(3.2 mmol/ L)不變時(shí)，5－ALA處理A431細(xì)胞的時(shí)間在30～120 min內(nèi)，抑制率隨時(shí)間的增加而升高。在120～180 min內(nèi)升高趨勢不明顯(表1、圖1)。

2.3 光照劑量(80 J/cm2)和培養(yǎng)時(shí)間(120 min)不變時(shí)，5－ALA濃度在0.2～3.2 mmol/L范圍內(nèi)，隨著濃度的增高，抑制率升高明顯。在3.2 mmol/L和6.4 mmol/L兩個(gè)濃度時(shí)，細(xì)胞抑制率無明顯變化(表2、圖2)。

2.4 培養(yǎng)時(shí)間(120 min)和5－ALA濃度(3.2 mmol/ L)不變時(shí)，光照劑量在20～80 J/cm2范圍內(nèi)，抑制率逐漸升高。在80～120 J/cm2范圍內(nèi)，無明顯差異(表3、圖3)。

圖1 5－ALA與A431培育時(shí)間對A431細(xì)胞的抑制作用

圖2 不同濃度的5－ALA對A431細(xì)胞的抑制作用

圖3 不同光照劑量對A431細(xì)胞的抑制作用

表1 5－ALA與A431培育時(shí)間對A431細(xì)胞生長的抑制率

表2 不同濃度的5－ALA對A431細(xì)胞的抑制率

表3 不同光照劑量對A431細(xì)胞生長的抑制率

3 討論

SCC是表皮角質(zhì)形成細(xì)胞異常增生而形成的一種惡性腫瘤，多發(fā)生在皮膚與黏膜交界及皮膚暴露部位，如頰、鼻、額部、下唇、外生殖器、眼瞼下、外耳等。3SCC的發(fā)生與多因素有關(guān)，涉及感染、物理、遺傳、化學(xué)等多種因素。4－6

SCC治療方法很多，但手術(shù)治療仍是一線治療方法。7自1990年Kennedy將5－ALA－PDT試用于臨床后，其在皮膚科的領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，獲得滿意的效果。其安全、高效等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)使之成為國內(nèi)外研發(fā)和應(yīng)用的熱門領(lǐng)域之一。8，95－ALA－PDT具有良好的美容效果，特別是解剖部位特殊的腫瘤。8

有資料報(bào)道，10經(jīng)2次ALA－PDT后Bowen’s病(BD)、日光性角化病(AK)和基底細(xì)胞癌(BCC)的完全緩解率(CR)分別為88%、99%和95%，12個(gè)月后的CR分別為69%、72%和82%。最近，許多學(xué)者報(bào)道了關(guān)于ALA－PDT應(yīng)用于各種腫瘤細(xì)胞的療效，有學(xué)者為了研究ALA－PDT對于口腔鱗癌及喉癌的療效，分別對兩組患有口腔鱗癌的患者進(jìn)行了治療，其中一組單獨(dú)進(jìn)行ALA－PDT治療，經(jīng)過96個(gè)月隨訪發(fā)現(xiàn)，5年的治愈率達(dá)90%，另外一組利用ALA－PDT與5－氟尿嘧啶聯(lián)合治療，最長隨訪達(dá)211個(gè)月，5年治愈率達(dá)100%，且ALA－PDT療法可以保留正常組織用來說話和吞咽。11國外有學(xué)者報(bào)道300例患有頭頸部鱗癌的患者接受ALA－PDT治療后，成功治愈，5年復(fù)發(fā)率為85%。12國內(nèi)頡玉勝等13對30例皮膚鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)行了4～11次ALA－PDT治療，并與經(jīng)手術(shù)治療的30例患者進(jìn)行復(fù)發(fā)率的比較，治療效果雖無差異，但光動力組美容效果滿意。

我們用不同的方式干預(yù)A431細(xì)胞后，通過MTT檢測各組細(xì)胞抑制率，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)用藥和單獨(dú)照光對細(xì)胞生長基本無影響；在相同的光照劑量和培養(yǎng)時(shí)間下，隨著5－ALA濃度的遞增細(xì)胞抑制率呈上升趨勢，但在3.2～6.4 mmol/L這兩個(gè)濃度之間，細(xì)胞抑制率上升不明顯，抑制作用進(jìn)入平臺期，提示并非光敏劑濃度越高對A431細(xì)胞抑制作用越強(qiáng)；同時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間和5－ALA濃度相同時(shí)，光照劑量在80～120 J/cm2范圍內(nèi)，抑制作用亦進(jìn)入平臺期，細(xì)胞生長抑制率上升亦不明顯。以上結(jié)果表明ALA－PDT對體外培養(yǎng)的皮膚鱗癌細(xì)胞有明顯的殺傷力，同時(shí)提示為了在副反應(yīng)最小的條件下達(dá)到最好的殺傷效果，我們應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)腜DT參數(shù)。對于體外培養(yǎng)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞，在5－ALA濃度為3.2 mmol/L，光照劑量為80 J/cm2，培育時(shí)間為120 min時(shí)，5－ALA－PDT的抑制作用最強(qiáng)，這為臨床應(yīng)用5－ALA－PDT治療SCC提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

國內(nèi)外研究可以說明ALA－PDT對腫瘤有一定的療效，同時(shí)我們的研究結(jié)果說明ALA－PDT對體外培養(yǎng)的皮膚鱗癌細(xì)胞有明顯的抑制生長的作用，而且目前臨床上已經(jīng)廣泛應(yīng)用ALA－PDT來治療多種皮膚疾病和皮膚癌，但對皮膚SCC的療效存在爭議，相關(guān)資料顯示，ALA－PDT對于SCC的治療，效果并不理想，復(fù)發(fā)率高達(dá)50%以上。14，15Bexfield用ALAPDT治療貓的皮膚淺表性鱗狀細(xì)胞癌一次后治愈率為85%，F(xiàn)erreira用ALA－PDT治療12例貓的皮膚鱗狀細(xì)胞癌，卻有7例侵襲性鱗狀細(xì)胞癌治療1～2次后無反應(yīng)。我們在臨床治療中也發(fā)現(xiàn)ALA－PDT對于部分SCC的療效不夠理想，何種原因?qū)е翧LA－PDT對不同皮膚疾病治療作用不同，是否ALA－PDT對不同分化程度或不同期別SCC作用不同尚不清楚，分析原因可能除與激光的穿透深度、光敏劑的劑量、滲透深度有關(guān)外，主要是ALA－PDT對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力起著關(guān)鍵性作用，這將是我們下一步研究的重點(diǎn)。

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(收稿:2014－01－08 修回:2014－03－06)

The inhibitory effects of 5－ALA－PDT on human skin squamous cell carcinoma A431 cells in vitro

LIU Yao，WANGYi-fei，ZHANGChun-min，etal.The Second Hospital ofShandong University，Jinan，250033

Objective:To determine the inhibitory effects of 5－ALA－PDT on human skin squamous cell carcinoma(SSC)A431 cells in vitro.Methods:After 5－ALA were co－incubated with SCC A431 cells and were irradiated with a 630 nm red light，the inhibitory effectwasmeasured by MTT assay.The effects of coincubation time，concentration of 5－ALA and light doses on the inhibitory rates were determined.Results: The inhibition rate reached themaximum value when 80 J/cm2light dose，3.2 mmol/L 5－ALA and 120 m in co－incubation time were used.Conclusion:5－ALA－PDT can significantly inhibit human SSC A431 cells.

5－ALA；squamous cell carcinoma

山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(編號:2009GG10002026)

1山東大學(xué)第二醫(yī)院皮膚科，濟(jì)南，250033

2山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南，250012

3山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南，250355

?通信作者