陳弟詩，任玉鵬，張 斌，李 麗，聶艷如，周莉媛

（1.西南民族大學生命科學與技術(shù)學院，四川成都610041；2.四川動物疫病預防控制中心，四川成都610041）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的以不同年齡段豬只的劇烈腹瀉、嘔吐和脫水等為特征的高度接觸性傳染病。哺乳仔豬發(fā)病率和病死率可達50%以上，是僵豬形成和育肥豬掉膘的主要原因之一［1］。PED在世界范圍內(nèi)流行極為廣泛，如韓國、泰國、越南、日本等均有本病發(fā)生的報道［2-4］；Chen Q 等［5］對2013年美國部分暴發(fā)腹瀉病養(yǎng)殖場的豬只小腸上皮細胞做病原分離鑒定，獲得2株PEDV分離株，表明該病在美國被發(fā)現(xiàn)，并導致嚴重經(jīng)濟損失。劉孝珍等［6］對采自我國北京、上海、黑龍江、山東、河南、浙江、廣東、廣西、福建、新疆等10?。ㄊ小^(qū)）的豬腹瀉樣本進行了RT-PCR檢測，PEDV在腹瀉豬樣本中普遍存在；2010年-2011年，中國南部10省豬場均暴發(fā)該病，導致豬死亡總數(shù)超過100萬頭［7］。由此可見，PEDV已經(jīng)成為制約養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要病因之一。

PEDV纖突蛋白基因（S protein gene）是免疫優(yōu)勢基因，推導的氨基酸序列疏水性區(qū)域密集，具有多個糖基化位點和抗原指數(shù)較高區(qū)域，在以其為候選基因的疫苗與診斷技術(shù)研究中表現(xiàn)出良好特異的免疫原性［8］。遺傳進化分析結(jié)果顯示，S基因N′端存在較高變異性，不同分離株S基因序列中核苷酸插入、突變和刪減常導致氨基酸序列變化，對肽鏈疏水性和糖基化位點產(chǎn)生影響，進而改變病毒原始抗原特性。此外，S蛋白在病毒與宿主細胞膜融合入侵和誘導中和抗體產(chǎn)生的過程中發(fā)揮重要作用［9］。本文就目前PEDV S基因及編碼蛋白功能相關研究進展做一綜述。

1 PEDV的基因組結(jié)構(gòu)

PEDV 1995年被第五屆國際病毒命名委員會正式列為冠狀病毒科成員，具有冠狀病毒典型形態(tài)特征。通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)糞便中的病毒粒子具花瓣狀纖突，長約14nm～20nm，病毒粒子平均直徑約95nm ～190nm［10］。PEDV 基 因 組 全 長 為27 000bp～30 000bp，除末端非編碼區(qū)序列和3′端poly（A）序列外，主要包括6個開放閱讀框（open reading frame，ORF），其中 ORF1ab參與病毒RNA合成；PEDV具感染性的基因組RNA釋放入細胞質(zhì)后，病毒ORF1ab翻譯成多聚前體蛋白，經(jīng)木瓜樣蛋白酶（PLP）和主要蛋白酶（Mpro）剪切和轉(zhuǎn)譯處理后，參與基因組復制。E基因編碼小膜蛋白，主要參與病毒的組裝和出芽過程［11］；ORF3基因編碼一種離子通道蛋白與病毒致病性相關，研究發(fā)現(xiàn)當ORF3基因被siRNA沉默時，PEDV對細胞感染性相應降低［12］；M基因包含681個核苷酸，可編碼226個氨基酸多肽的囊膜蛋白，能介導機體產(chǎn)生IFN-α；N基因全長1 700bp，編碼病毒核衣殼蛋白；S基因編碼病毒纖突蛋白，在病毒對宿主吸附和入侵過程中起重要作用；該基因是病毒主要免疫原性基因，在誘導機體中和抗體產(chǎn)生過程中發(fā)揮重要作用；此外，遺傳進化分析顯示不同毒株S基因核苷酸序列均存在差異，N末端序列存在高度變異性，可能導致病毒抗原性改變［13］。

2 PEDV S基因及其編碼蛋白的功能

2.1 PEDV S基因

PEDV S基因位于基因組ORF1ab和ORF3之間，全長4 152bp，編碼1 383個氨基酸組成的分子質(zhì)量約180ku～220ku的多肽。其起始密碼子AUG后有一段與S蛋白膜易位相關的疏水性多肽鏈。在基因上游8個堿基處有一段“GUAAAC”序列，在亞基因mRNA（sgmRNA）轉(zhuǎn)錄起始過程中發(fā)揮重要作用［14］；S基因變異 性較大，Lee D K 等［15］對7株韓國PEDV毒株的S基因進行序列分析發(fā)現(xiàn)，相比參考株序列存在15bp堿基插入和9bp缺失，且變異均發(fā)生在N末端區(qū)域；此外，用不同毒株S基因N端序列做系統(tǒng)進化分析與全基因序列結(jié)果具一致性，這提示S基因N端1 100bp多樣性可用于流行毒株的分子流行病學調(diào)查和疫苗候選株篩選。Chen J等［16］對除西藏和青海外的中國29?。ㄊ?、區(qū)）577份腹瀉樣品進行分子流行病學調(diào)查分析，證實33個分離株都不同程度在S基因N末端1 aa～370aa存在基因的刪減或插入，導致各毒株糖基化位點數(shù)量和抗原性存在差異；通過遺傳進化分析將PEDV毒株分為2個大群G1、G2，而G1大群又分為3個亞群G1-1、G1-2、G1-3；其中13個近期流行株與CH/S、LZC、LJB/03、JS-2004-2和 DX株等5個經(jīng)典中國株歸于G1-1群，與CV777減毒株推導氨基酸序列同源性在96.0%～99.9%；其余20個分離株則歸于G2大群，與CV777減毒株同源性為93.6%～95.4%；由此可見當前國內(nèi)外部分PEDV流行株存在遺傳變異。

2.2 S基因編碼蛋白

由PEDV S基因推導的氨基酸序列包含信號肽區(qū)（1aa～24aa）、胞外區(qū)、跨膜區(qū)（1 334aa～1 356aa）和胞內(nèi)區(qū)，存在29個潛在的糖基化位點；疏水性分析表明，S蛋白除C端第1 326aa～1 364aa位氨基酸疏水性較高外，其余區(qū)域也都存在不連續(xù)疏水位點［17］，這與S蛋白在病毒致病機制中扮演的角色相符。S蛋白外部結(jié)構(gòu)域有介導機體產(chǎn)生中和抗體的抗原表位和與宿主細胞表面大分子結(jié)合的受體結(jié)合域，羧基末端細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域主要由疏水氨基酸組成，對S蛋白起固定作用［12］。盡管不像其他冠狀病毒如MHV、BCV和IBV的S蛋白氨基酸序列存在天然蛋白水解位點將其分為兩個區(qū)，但對PEDV S基因分析表明，在752位～755位、781位～789位氨基酸處也分別具有GxCx基序和保守九肽序列［18］，故可人為地將PEDV S蛋白分為S1（1aa～735aa）區(qū)和S2（736aa～1 383aa）區(qū)。

S1區(qū)包含多個病毒主要中和表位和受體結(jié)合域，與病毒抗原性和吸附入侵密切相關［19］。如在不同PEDV毒株S1基因中均發(fā)現(xiàn)一段核心表位COE基因 （1 495bp～1 923bp）［20］，經(jīng)乳酸桿菌表達或從煙草中獲取的重組COE蛋白均與PEDV天然抗原具相同反應原性［21］；孫東波［15］用兔抗 PEDV 多克隆抗體對PEDV S1基因特異性肽庫進行生物淘汰，鑒定出3個B細胞抗原表位（248aa～280aa、442aa～499aa、499aa～638aa），并證實經(jīng)E.coli BL21（DE3）系統(tǒng)表達的3種融合蛋白，均能刺激小鼠機體產(chǎn)生中和抗體；為以S基因免疫原性區(qū)域作候選基因研發(fā)PEDV診斷試劑盒及新型疫苗奠定基礎。近年對PEDV宿主細胞受體的研究表明，PEDV可感染表達豬氨基肽酶N（pAPN）不同基因片段的MDCK細胞，間接證明pAPN為PEDV的細胞受體［22］；進一步研究發(fā)現(xiàn)S蛋白249aa～529aa存在一個潛在pAPN受體結(jié)合區(qū)MRR，且經(jīng)Bac-to-Bac桿狀病毒表達的MRR重組蛋白可與PEDV多克隆抗體產(chǎn)生反應，這為闡明病毒pAPN受體結(jié)合位點，揭示吸附入侵機制提供可能［15］。

S2區(qū)作為S蛋白穿膜部分，序列相對穩(wěn)定，在病毒與宿主細胞膜融合的信號轉(zhuǎn)導過程中發(fā)揮重要作用，其融合活性也決定著病毒的組織嗜性和對細胞的侵染能力［23］。對冠狀病毒科成員SARS病毒研究發(fā)現(xiàn)，其S蛋白S2區(qū)內(nèi)存在一段七肽重復序列（HR），生物信息學分析表明2個HR結(jié)構(gòu)域（HRl與HR2）序列具高度保守性，它們相互作用形成的六螺旋束在病毒入侵細胞時導致病毒包膜和細胞膜發(fā)生重排，促使病毒膜融合的發(fā)生。此外，研究發(fā)現(xiàn)S2蛋白的一個半胱氨酸區(qū)域兩旁的保守殘基C822和C833是重要的活化膜融合位點［24］。這為PEDV S2區(qū)膜融合相關結(jié)構(gòu)域的探索和病毒膜融合機制研究提供了參考。

3 基于S基因的新型疫苗

20世紀90年代中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所開發(fā)的TGEV-PEDV二聯(lián)滅活苗和弱毒苗沿用至今，對國內(nèi)PED防控具有重要作用。但近年來PED發(fā)病率逐年上升，對PEDV分子流行病學調(diào)查顯示，部分PEDV野毒株毒力及免疫原性相關基因，ORF3基因［25］、S基因等［7］均出現(xiàn)堿基刪減、插入或突變，推測這是傳統(tǒng)商品化疫苗保護效力降低的可能原因，所以新型疫苗的開發(fā)具有重要意義。而PEDV S基因作為病毒主要免疫原性基因，已鑒定出具多個保守性中和抗原表位，因此是目前基因工程疫苗研制的主要候選基因之一。如Suo S等［26］以pVAX1為真核表達載體，分別構(gòu)建了表達S基因、S基因N末端序列和IL-18的重組質(zhì)粒，動物試驗表明，pVAX1-S1和pVAX1-IL18載體聯(lián)合免疫小鼠組血清特異性抗體水平顯著高于其他組，且小鼠血清具有病毒中和作用，這為以S基因開發(fā)核酸疫苗提供了新思路；Ge J W 等［27］用共表達COE基因與大腸埃希菌不耐熱腸毒素基因的重組乳酸菌免疫小鼠后77d，在小鼠糞便、陰道、鼻黏膜、小腸黏膜及血清中的抗PEDV IgA抗體均顯著升高，IgG抗體水平也明顯高于對照組。Bae J L等［28］將表達PEDV S基因部分中和抗原表位的重組載體轉(zhuǎn)化至煙草中構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因煙草植物，用其飼喂小鼠后，體液免疫水平明顯上升，采集血清進行空斑減少試驗，發(fā)現(xiàn)可明顯抑制PEDV感染。上述研究結(jié)果表明，以S基因為靶基因構(gòu)建的重組質(zhì)粒、活載體疫苗或轉(zhuǎn)基因植物，均能刺激試驗動物機體產(chǎn)生良好的體液和細胞免疫反應，且試驗動物血清具有病毒中和作用，這為PED新型疫苗的開發(fā)提供了重要的理論和數(shù)據(jù)支持。

4 基于S基因的診斷技術(shù)

目前，已知的導致豬腹瀉因素較多，諸如細菌、病毒、寄生蟲及營養(yǎng)性因素均可引起仔豬腹瀉癥狀，單純以臨床癥狀和病理剖解變化為依據(jù)判定病因非常困難，故建立PEDV快速診斷方法具有重要意義。在實驗室檢測技術(shù)中以分子生物學和免疫學技術(shù)為主流，主要針對病毒保守和具良好免疫原性的基因進行研究。而PEDV基因組中，以M、N基因保守性相對較高，目前在建立RT-PCR檢測法、熒光定量RT-PCR法、RT-LAMP法等主要用上述二基因作為靶基因［29-30］；S基因保守區(qū)域也可以作為檢測靶點；Kim S Y等［31］分別對TGEV和PEDV S基因設計特異性引物，建立了鑒別診斷這兩種病原的雙重RT-PCR法，在90份臨床樣本的檢測中表現(xiàn)出較高敏感性，且對輪狀病毒、牛腹瀉病毒及其他引起豬腹瀉的細菌性病原均不檢出，表明該法具有臨床應用價值；此外，由于S蛋白是病毒與宿主細胞吸附和受體識別的主要蛋白之一，具良好免疫原性和反應原性，因此在免疫學診斷技術(shù)的建立中應用較廣。如Knuchel M等［32］用S蛋白和N蛋白分別建立的ELISA方法進行比較探索，發(fā)現(xiàn)S-ELISA比N-ELISA法在免疫測定中更為有效；Cao L等［33］構(gòu)建了表達PEDV S1基因N末端序列的E.coli BL21（DE3）重組菌，通過雜交瘤細胞技術(shù)獲得一株表達S1蛋白單克隆抗體的Vero E6細胞，通過間接ELISA、Western blot及間接免疫熒光技術(shù)驗證了抗體的反應原性，為PEDV特異性免疫學診斷方法的建立奠定了基礎。

5 結(jié)語

當前對PEDV S基因研究主要集中于基因結(jié)構(gòu)分析及功能預測，遺傳進化分析和蛋白免疫原性分析等方面。大量試驗數(shù)據(jù)證實不同PEDV流行株S蛋白N端序列存在不同程度的變異，可能是導致病毒抗原性改變的原因，故有必要進一步對各地方流行株PEDV遺傳背景進行調(diào)查，為病原診斷和現(xiàn)地疫苗候選株篩選提供依據(jù)。已預測和鑒定的S基因多個保守性中和抗原表位，經(jīng)重組菌或重組病毒等多種形式獲得表達，在用小鼠作為動物模型的試驗中表現(xiàn)出良好的免疫原性，但也存在諸多問題，如重組菌或重組蛋白誘導體液和細胞免疫水平上升不夠顯著，與傳統(tǒng)疫苗相比保護效力不足，新型疫苗或診斷方法缺乏廣泛臨床驗證等。此外，雖已證實pAPN為PEDV細胞受體，但關于S基因受體結(jié)合域具體位點尚未探明，S蛋白與pAPN受體結(jié)合后如何進行一系列信號轉(zhuǎn)導促使細胞膜重排和融合等機制還需進一步研究來揭示。

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