張 玉，謝銀祿，張國慶

（1.青海省大通縣長寧鎮(zhèn)后子河獸醫(yī)站，青海大通810105；2.青海省海西州格爾木市畜牧獸醫(yī)站，青海格爾木816000；3.青海省大通種牛場，青海大通810100）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起豬的一種急性、發(fā)熱性、高度接觸傳染性疾?。?］，臨床癥狀類似于經(jīng)典豬瘟（Classical swine fever，CSF），主要特征表現(xiàn)為高熱、嘔吐、皮膚發(fā)紺、內(nèi)臟器官廣泛性出血、呼吸障礙、流產(chǎn)及神經(jīng)系統(tǒng)功能改變等［2-3］。ASF于1921年在非洲肯尼亞被首次發(fā)現(xiàn)，目前已流行至非洲、歐洲和美洲等數(shù)10個國家和地區(qū)，且仍有不斷蔓延的趨勢［4-6］。該病傳染性強、發(fā)病快、病程短、病死率高達100%，對養(yǎng)豬業(yè)危害極大，該病被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須及時通報的動物疫病，被我國農(nóng)業(yè)部列為一類動物疫?。?］。目前，該病的防控缺乏行之有效的疫苗和治療藥物，綜合防控面臨著巨大挑戰(zhàn)。在我國雖未發(fā)現(xiàn)該病，但其從西非至東非、歐洲、亞洲的傳播態(tài)勢已經(jīng)形成，對我國養(yǎng)豬業(yè)的潛在威脅日益增大，一旦侵入我國，將會給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來極大的危害，并對養(yǎng)豬相關產(chǎn)業(yè)造成巨大沖擊。只有建立快速、準確、靈敏和特異的ASFV檢測方法，才能更好地進行檢疫，嚴防該病傳入我國，故加強該病快速診斷技術的研究貯備工作具有重大的現(xiàn)實意義。論文就非洲豬瘟病毒各種實驗室檢測技術優(yōu)缺點進行全面論述，旨在為我國開展非洲豬瘟的監(jiān)測提供技術參考。

1 PCR及多重PCR方法

PCR方法操作簡單、檢測快速、靈敏度高、特異性強，是實驗室常用的分子生物學診斷技術，也是目前ASFV較常用的實驗室診斷方法。多重PCR方法是在同一個PCR反應體系中加入多對特異性檢測引物，同時對多個靶基因進行快速擴增，其可以實現(xiàn)ASFV與其他病原體的快速鑒別診斷。

Aguero M等［8］和曾少靈等［9］均先后建立了ASFV的PCR檢測方法，均具有良好的敏感性和特異性，可以檢測出極低含量的ASFV，為ASFV早期感染的快速診斷提供了有效的分子生物學檢測方法。楊霞等［10］利用PCR方法對河南省不同地市27個豬場所采集的疑似病料進行了ASFV的核酸檢測，陽性檢出為0，表明中國河南地區(qū)沒有ASFV的感染與流行。PCR方法操作簡單、檢測快速、敏感性高、特異性強，適合普通實驗室進行ASFV的檢測工作，對實現(xiàn)ASFV早期排查具有重要意義。

Aguero M等［11］和張倩等［12］分別建立了檢測ASFV和CSFV的雙重PCR方法，Aguero M等建立的方法從臨床樣品處理至檢測結(jié)束整個過程在5h內(nèi)即可完成，張倩等建立的方法檢測豬圓環(huán)病毒2型、豬細小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒均為陰性，對CSFV和ASFV的最低檢出量均可以達到100pg，對山東聊城地區(qū)58份樣品進行檢測，CSFV陽性15份，ASFV陽性0份。多重PCR方法可在同一個體系中同時對多個目的基因進行擴增，并且檢測所耗時間與常規(guī)PCR方法相當，同樣適合于普通實驗室，為ASFV和CSFV的臨床鑒別診斷和流行病學調(diào)查等研究提供了有效的技術支持。

2 熒光定量PCR及多重熒光定量PCR方法

實時熒光定量PCR（real-time quantitative-PCR，real-time qPCR）是融匯了PCR技術和光譜技術的一種核酸定量檢測技術，具有敏感性高、特異性強、重復性好、全封閉反應、定量準確等優(yōu)點，與常規(guī)RT-PCR檢測方法相比，解決了PCR假陽性和溴化乙錠對環(huán)境的污染問題，且可以實現(xiàn)定量檢測。多重熒光定量PCR方法是在同一個熒光定量PCR反應體系中加入多對特異性檢測引物，進而多種病原體的鑒別診斷。

Fernandez Pinero J等［13］利用通用探針庫建立了ASFV的實時熒光定量PCR檢測方法，實現(xiàn)了ASFV感染的定量檢測和鑒定。黃萍等［14］和郭少平等［15］分別針對ASFV p72基因和K205R基因設計特異性檢測引物和探針，均建立了ASFV實時熒光定量PCR檢測方法，其敏感性可達100個拷貝。實時熒光定量PCR檢測方法敏感性高、特異性強，可同時快速檢測大批量樣品，且整個反應在密閉條件下進行，相對不易產(chǎn)生分子污染，可作為ASFV的診斷、檢疫、食品安全檢驗和ASFV分子生物學研究的一種定量檢測方法。

Haines F J等［16］和陳靜靜等［17］分別建立了可以同時檢測CSFV和ASFV的熒光定量PCR鑒別檢測方法，檢測口蹄疫病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬水皰病病毒、豬圓環(huán)病毒2型均為陰性，靈敏度可以達到10拷貝的數(shù)量級，對2份已知CSFV陽性血清樣品和120份豬內(nèi)臟、豬鼻腔拭子及血清樣品進行檢測，陽性樣品的檢測結(jié)果均為陽性，未知樣品檢出CSFV 3份陽性，未檢出ASFV陽性。CSFV和ASFV雙重熒光定量PCR鑒別檢測方法，只需一步操作即可完成CSFV和ASFV的鑒別診斷，且敏感性比常規(guī)的CSFV和ASFV雙重PCR鑒別檢測方法要高，適用于ASFV和CSFV的臨床快速鑒別診斷和定量檢測。

3 環(huán)介導等溫擴增技術

環(huán)介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新興的核酸擴增技術，可以實現(xiàn)等溫條件下的核酸快速擴增，該方法操作簡單、靈敏、快速，且不需要特殊儀器設備，具有較高的臨床實用性。James H E等［18］和江彥增等［19］均建立了快速、高效檢測ASFV的LAMP方法，該方法在恒溫水浴鍋中進行，30min即可得到結(jié)果，靈敏度是常規(guī)PCR方法的100倍以上，非常適合在野外現(xiàn)場或缺乏試驗條件的邊遠地區(qū)檢測ASFV。楊吉飛等［20］利用建立的ASFV的LAMP方法對非洲豬瘟參考實驗室提供的ASFV 17個毒株的基因組以及國內(nèi)收集的50份豬的基因組、30份蜱的基因組進行檢測，結(jié)果顯示LAMP方法能夠成功擴增非洲豬瘟病毒17個毒株的基因組，而野外收集的豬和蜱的基因組檢測均為陰性。LAMP檢測方法不需要PCR中的變性、退火步驟即可進行靶序列的循環(huán)擴增，不但大大縮短了時間，且使反應能夠在恒溫條件下進行，無需特殊儀器設備，肉眼判讀，可以滿足基層快速診斷的需要，非常適合于基層獸醫(yī)實驗室和養(yǎng)殖場使用。

4 探針雜交技術

探針技術是用探針標記已知核酸序列，通過檢測標記探針信號而分析核酸含量，進而可用于特定基因序列的檢測。張鑫宇等［21］針對ASFV p72基因分別設計合成1條與保守區(qū)域互補的5′生物素標記及3′烷巰基修飾短鏈寡核苷酸探針，并將烷巰基修飾的探針吸附到納米金顆粒上，制備納米金標記探針，將PCR擴增產(chǎn)物與生物素探針及納米金標記探針進行雜交，雜交產(chǎn)物加入吸附鏈霉親和素的酶標板，利用親和原理，捕獲雜交產(chǎn)物，銀染增強法對納米金標記探針進行信號放大，進而建立了檢測ASFV p72基因的納米金探針雜交方法。該方法中納米金探針經(jīng)銀染放大后，在酶標板中形成肉眼可見的黑色沉淀，可有效檢測擴增出核酸濃度達到10fmol/L p72基因，可用于ASFV快速檢測。探針技術檢測靈敏度高，同時能有效排除PCR檢測過程中的非特異性結(jié)果，省去了瓊脂糖凝膠電泳步驟，操作簡便、檢測迅速，在酶標板中可以批量反應，為ASFV核酸檢測方法研究開辟了新的途徑，但該方法的建立難度較高，操作較繁瑣，對試驗人員技術水平要求較高。

5 ELISA方法

酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是繼免疫熒光和放射性同位素免疫技術之后發(fā)展起來的一種新型的免疫酶技術，具有檢測快速、操作簡單、無輻射、價格低廉等優(yōu)點，是當前動物疫病診斷與流行病學調(diào)查廣泛采用的免疫學診斷技術。Perez Filgueira D M等［22］以昆蟲細胞表達的p30重組蛋白為包被抗原，建立了檢測ASFV抗體的間接ELISA方法，通過對采自西班牙和不同非洲地區(qū)的672份豬血清樣品進行檢測表明，間接ELISA方法敏感性高，可檢測到ASFV早期感染的樣品，可用于ASFV特異性抗體的早期檢測。董志珍等［23］利用基因重組技術制備非洲豬瘟p54蛋白，將其免疫Balb/c小鼠，將免疫鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，采用有限稀釋法進行克隆，獲得一株能穩(wěn)定分泌抗ASFV單克隆抗體的雜交瘤細胞株，使用該單克隆抗體建立了檢測豬血清中ASFV抗體的競爭ELISA方法，該方法靈敏度高于間接免疫熒光方法，可用于豬血清的ASFV抗體檢測。曾少靈等［24］利用桿狀病毒表達載體成功表達了ASFV VP73蛋白，表達的重組蛋白具有良好的特異性與反應性，以此重組蛋白作為檢測抗原，建立了檢測ASFV血清抗體的間接ELISA方法。張倩等［25］采用瑞典SVANOVA非洲豬瘟間接ELISA抗體檢測試劑盒對遼寧綏靖、內(nèi)蒙古赤峰、大連東港共計92份豬血清進行了ASFV抗體的檢測，結(jié)果全部為陰性。ELISA方法高通量、快速、簡單、敏感、特異、無污染，非常適用于基層獸醫(yī)部門進行大批量樣品檢測和大規(guī)模流行病學調(diào)查。

6 小結(jié)

非洲豬瘟在我國尚未發(fā)現(xiàn)，是我國進出口貿(mào)易中監(jiān)測的重要疫病，必須保持高度警惕，防止該病入境。近年來，隨著國際貿(mào)易、現(xiàn)代物流的飛速發(fā)展、世界經(jīng)濟的全球化、自然生態(tài)環(huán)境的改變，ASFV從西非至東非、歐洲、亞洲傳播的態(tài)勢已經(jīng)形成，傳入我國的風險加劇，加強該病診斷技術的研究貯備工作具有重要意義。目前，針對ASFV的檢測技術主要有針對病毒核酸檢測技術和基于病毒抗原/抗體反應的免疫學技術。用免疫學方法檢測抗體可以了解ASFV感染、發(fā)生、發(fā)展的進程，但抗體只有在病毒感染至一定時期后才會出現(xiàn)，故ELISA等抗體檢測方法存在一定的局限性。PCR、熒光定量PCR、LAMP等分子生物學技術在豬感染ASFVV的早期即可檢測到病毒核酸，在ASFV的早期檢測中具有重要作用。其中PCR方法操作簡單、靈敏度高、重復性好，需要一定的儀器設備和試劑，適合一般實驗室使用。熒光定量PCR方法將PCR與熒光檢測結(jié)合起來，克服了常規(guī)PCR易污染、擴增后需電泳檢測等缺點，并可對病毒核酸進行準確定量，且檢測靈敏度比常規(guī)PCR方法更高，但熒光定量PCR方法對操作人員、儀器設備與試劑要求較高，一般實驗室很難具備試驗條件，難以普及應用。LAMP方法肉眼判讀、操作簡單、不需要特殊儀器設備，特別適合于基層獸醫(yī)實驗室和養(yǎng)殖場應用?？傊?，ASFV的實驗室檢測方法各有優(yōu)缺點，但對各種方法的檢測結(jié)果均要求準確、快速、敏感，以便采取及時、有效的防控措施。相信隨著分子生物學與免疫學技術的不斷發(fā)展，ASFV實驗室診斷方法必將會不斷完善，進一步為我國開展非洲豬瘟的監(jiān)測與綜合防控提供技術支持。

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