劉翠翠，魏小娟，張繼瑜，王 婧，周緒正，李 冰，李金善，牛建榮

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所獸藥重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730050）

志賀菌（Shigella）在19世紀(jì)末被確定為人類及靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)菌性痢疾的致病原。根據(jù)《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》，由志賀菌屬引起的傳染病列為乙類傳染病。衛(wèi)生部頒布的《人間傳染的病原微生物名錄》中志賀菌屬被列為第3類病原微生物。抗生素類藥物能對(duì)細(xì)菌性痢疾起到很好的治療效果，但是長(zhǎng)期使用甚至濫用會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，給臨床治療增加了難度。

研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌基因組中存在著一種新型的RNA，與常規(guī)的tRNA、rRNA和mRNA不同，有其特殊的性質(zhì)和功能，例如影響細(xì)菌的個(gè)體發(fā)育、翻譯激活與抑制細(xì)菌毒性、耐藥性等，一個(gè)單獨(dú)的小RNA就能調(diào)控大量的基因并對(duì)細(xì)胞生理產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響［1-2］。研究者利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)技術(shù)、全基因組分析技術(shù)和高通量RNA測(cè)序技術(shù)等，在志賀菌中大約發(fā)現(xiàn)了60多種調(diào)控小RNA，其中大部分與大腸埃希菌基因組中的小RNA是相似的，但是對(duì)其特性和功能的研究并不透徹。

1 細(xì)菌調(diào)控小RNA

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌基因組中存在著一種新型的RNA，分子大小約為50bp～400bp，大多數(shù)位于編碼基因的間區(qū)，開(kāi)始于一段能折疊成穩(wěn)定莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列，終止于不依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止子［3］，還有一小部分sRNA（目前確認(rèn)只有RyeB和SraC/RyeA）是從mRNA的頭部或尾部非翻譯區(qū)剪切下來(lái)的。這類RNA最初被稱作非編碼小RNA，但是最新研究發(fā)現(xiàn)某些sRNA也可以編碼一些小的蛋白質(zhì)，例如SgrS、RNA Ⅲ［4-5］等。因此，這種 RNA分子被稱作調(diào)控小 RNA［6］。

1.1 分類及功能

根據(jù)生物學(xué)功能及作用機(jī)制可將sRNA分為3類：①具有持家功能的小RNA；②與蛋白質(zhì)相互作用影響蛋白質(zhì)功能的小RNA；③與目標(biāo)mRNA配對(duì)結(jié)合調(diào)控基因表達(dá)的小RNA［7］。

根據(jù)其基因與靶標(biāo)的位置關(guān)系可分為2類，即正義編碼的小RNA和反義編碼的小RNA。其中正義編碼的小RNA基因與靶標(biāo)基因重疊，并且它們的轉(zhuǎn)錄體之間存在良好的堿基配對(duì)；而反義編碼的小RNA基因與靶標(biāo)基因是分離的，通常轉(zhuǎn)錄體之間不存在良好的堿基配對(duì)［8］。

調(diào)控小RNA在細(xì)菌中所起的作用很廣泛，它們涉及到的功能包括從結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)到催化作用，影響各種加工過(guò)程，如質(zhì)粒復(fù)制、細(xì)菌毒性、耐藥性、壓力反應(yīng)、發(fā)育控制、翻譯激活與抑制、RNA剪切和修飾、mRNA穩(wěn)定性及蛋白質(zhì)降解等［9］。

1.2 Hfq簡(jiǎn)介

Hfq是一種熱穩(wěn)定蛋白，由Hfq基因編碼，也被稱作HF-1，是細(xì)菌中最豐富的RNA結(jié)合蛋白之一。其大小在各個(gè)菌種中有所不同，如大腸埃希菌中的Hfq蛋白是由102個(gè)氨基酸組成，而金黃色葡萄球菌中的Hfq蛋白長(zhǎng)度為77個(gè)氨基酸［10］。

Hfq是通過(guò)寡聚體化形成的六元環(huán)狀蛋白，在結(jié)構(gòu)和功能上與古細(xì)菌和真核生物的Sm蛋白類似，因此可稱為類Sm蛋白，區(qū)別在于Sm蛋白是七聚體［10］。這類蛋白可以通過(guò)與RNA的AU富集區(qū)相互作用來(lái)調(diào)節(jié)許多RNA參與的反應(yīng)。研究證實(shí)很多細(xì)菌調(diào)控小RNA都需要Hfq的輔助才能正常發(fā)揮作用。Hfq通過(guò)堿基配對(duì)與調(diào)控小RNA（DsrA、RyhB、Spot42 和 OxyS）相 互 作 用［11-13，15］。Hfq也可以作為分子伴侶參與大多數(shù)sRNA-mRNA的相互作用，但機(jī)制還不是很明確［14-15］。

2 志賀菌調(diào)控小RNA

迄今為止，志賀菌中大約有60多種小RNA被發(fā)現(xiàn)，約21個(gè)sRNA結(jié)合到Hfq蛋白發(fā)揮作用。2011年，Peng J等［16］對(duì)已鑒定的與志賀菌保守相關(guān)的64種小RNA通過(guò)機(jī)器和芯片分析、RT-PCR及Northern blot發(fā)現(xiàn)，在福氏志賀菌301大質(zhì)粒中鑒定出了9種小RNA和256個(gè)可能包含小RNA基因的區(qū)域。但是對(duì)于這些小RNA的功能以及在志賀菌體內(nèi)的作用機(jī)制研究還不透徹，目前只有2種，即RnaG和RyhB的功能研究比較清楚。

2.1 RnaG

福氏志賀菌的毒力基因icsA（也稱作virG）編碼一種膜外蛋白質(zhì)，大約有1 102個(gè)氨基酸殘基，能夠引起宿主肌動(dòng)蛋白在細(xì)胞的一端聚合，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白“尾巴”的形成，驅(qū)使細(xì)菌在細(xì)胞之間移動(dòng)，引發(fā)各種菌痢癥狀［17-18］。

Giangrossi M等在福氏志賀菌virA-icsA的基因間區(qū)發(fā)現(xiàn)了一種新型基因RnaG，這是在福氏志賀菌的毒力質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)sRNA。RnaG是一種反義RNA，分子大小約為450bp，通過(guò)2種機(jī)制調(diào)節(jié)毒力基因icsA的轉(zhuǎn)錄，即轉(zhuǎn)錄干擾和轉(zhuǎn)錄弱化：①RnaG啟動(dòng)子的沉默可以使icsA啟動(dòng)子有較高的活性；②RnaG在icsA mRNA的互補(bǔ)鏈上被順式轉(zhuǎn)錄，當(dāng)RnaG結(jié)合在icsA轉(zhuǎn)錄物上時(shí)，可以在mRNA的5′端形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，促使一個(gè)錯(cuò)誤的內(nèi)在終止子形成，使轉(zhuǎn)錄異常終止［19］，從而使細(xì)菌的毒力受到抑制。

2.2 RyhB

RyhB是一種90個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，由3個(gè)模塊部分構(gòu)成，與靶mRNA的序列反向互補(bǔ)的配對(duì)結(jié)合區(qū)域、Hfq蛋白的結(jié)合區(qū)域和一段不依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止末端。其生物功能主要體現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞內(nèi)鐵代謝的調(diào)控和對(duì)致病菌致病力的調(diào)節(jié)兩個(gè)方面［20］。

志賀菌對(duì)鐵的調(diào)控依賴鐵吸收調(diào)控蛋白-Fur蛋白，通過(guò)負(fù)調(diào)控sRNA分子RyhB來(lái)間接調(diào)控細(xì)菌內(nèi)儲(chǔ)鐵蛋白基因（bfr）和細(xì)胞內(nèi)那些含鐵的非必需元件基因sodB、sdhC、fumA的表達(dá)。RyhB通過(guò)與上述基因的mRNA配對(duì)結(jié)合，降低mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，使表達(dá)受到抑制，也可通過(guò)與RNase E形成降解復(fù)合體對(duì)這些mRNA進(jìn)行降解，減少體內(nèi)鐵的儲(chǔ)存和消耗［21］。

RyhB可以通過(guò)影響福氏志賀菌的耐酸程度而調(diào)節(jié)其致病能力，由于此菌長(zhǎng)期生存在腸道的酸性環(huán)境下，于是產(chǎn)生了一套耐受酸性環(huán)境的系統(tǒng)。RyhB可以通過(guò)調(diào)節(jié)ydeP基因的表達(dá)水平來(lái)調(diào)節(jié)福氏志賀菌的耐酸性。ydeP基因編碼一種氧化還原酶，被認(rèn)為是耐酸性細(xì)菌中所必需的，而ydeP的表達(dá)依賴于轉(zhuǎn)錄激活因子EvgA的表達(dá)，RyhB可以負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活子EvgA的表達(dá)進(jìn)而影響ydeP的表達(dá)。研究表明，當(dāng)RyhB的表達(dá)上調(diào)時(shí)，福氏志賀菌的耐酸程度顯著性降低，同時(shí)其致病能力也會(huì)明顯減弱；相反當(dāng)RyhB的表達(dá)受到抑制時(shí)，福氏志賀菌則表現(xiàn)出很高的耐酸性，存活率和致病率也相應(yīng)的提高［22-23］。

在志賀菌中，RyhB可以負(fù)調(diào)控許多毒力基因的表達(dá)，例如Ⅲ型分泌器、分泌的效應(yīng)蛋白和一些特定的分子伴侶［24］。志賀菌毒力相關(guān)基因的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄激活子virB的調(diào)控，當(dāng)VirB蛋白結(jié)合到它們的啟動(dòng)子后，致病力基因的表達(dá)增強(qiáng)［25］。RyhB通過(guò)負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活子VirB的表達(dá)，使多種致病力基因表達(dá)降低。因此，當(dāng)RyhB表達(dá)升高時(shí)，志賀菌的菌斑形成能力和對(duì)腸表皮細(xì)胞的侵襲能力會(huì)明顯降低［24，26］。

2.3 SraB

2001年，Argaman L 等［27］使 用 Northern blot技術(shù)確認(rèn)了SraB在大腸埃希菌中的存在和表達(dá)，其大小為170bp，是在所有假定的sRNA中第1個(gè)被鑒定出的基因。大腸埃希菌和志賀菌的SraB序列是高度保守的，相似性大約為99%～100%。但是與沙門(mén)菌只有82%的相似性［28］。

在痢疾志賀菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期，脫氧膽酸（DOC）或者鐵的存在可以導(dǎo)致sraB表達(dá)的微小上調(diào)，但不明顯。溫度明顯影響sraB的表達(dá)，即30℃時(shí)比37℃的表達(dá)上調(diào)，因?yàn)?7℃是宿主體內(nèi)溫度，也是毒力基因表達(dá)的最適溫度［29］。

蛋白組學(xué)分析顯示，與生理水平的SraB相比，SraB過(guò)多可以導(dǎo)致約61個(gè)蛋白質(zhì)不同程度的上調(diào)或者下調(diào)。許多上調(diào)的蛋白三羧酸循環(huán)和檸檬酸循環(huán)。對(duì)細(xì)菌的毒力和入侵有很大作用的IpaA、IpaD等有明顯的下調(diào)，這說(shuō)明過(guò)多的SraB可以降低痢疾志賀菌的入侵和感染能力［29］。

SraB調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過(guò)程的機(jī)制尚不明確。

2.4 其余小RNA

細(xì)菌非編碼小RNA的研究主要集中在大腸埃希菌等模式生物，而致病菌非編碼小RNA的研究較少。研究證實(shí)，志賀菌屬與大腸埃希菌K12菌株（MG1 655）基因組中的小RNA大部分是相似的［30］。

DsrA是由87個(gè)核苷酸構(gòu)成的非編碼RNA，大約有5種細(xì)菌的DsrA RNA序列已知，分別是大腸埃希菌、鼠傷寒沙門(mén)菌、腸沙門(mén)菌、宋內(nèi)志賀菌和福氏志賀菌，其中大腸埃希菌與2種志賀菌的序列相似性為99%左右［31］。

SraL也稱作RyjA，是一種反義小RNA，長(zhǎng)度在140bp左右，可以在大腸埃希菌和鼠傷寒沙門(mén)菌表達(dá)。Silva I J等［32］使用BlastN技術(shù)對(duì)其他腸道細(xì)菌的基因組進(jìn)行了研究，證實(shí)這種小RNA在志賀菌屬、檸檬酸桿菌屬等體內(nèi)是高度保守的。

腸道細(xì)菌中至少編碼8種調(diào)控外膜蛋白的小RNA （InvR、MicA、MicC、MicF、OmrAB、RseX和RybB），Vogel J等［33］使用BlastN技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，其中有6種存在于福氏志賀菌中，MicA、MicC、MicF、OmrAB和RybB，與大腸埃希菌類似。

除此之外，志賀菌屬基因組中還有很多與大腸埃希菌同源的及正在研究的非編碼小RNA，雖然科學(xué)家在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了這些小RNA，但是對(duì)其功能及在志賀菌體內(nèi)的作用機(jī)制研究還不透徹。

3 前景與展望

志賀菌是一類可以引起人和其他哺乳類動(dòng)物細(xì)菌性痢疾的革蘭陰性桿菌，目前最好的治療方法依然是使用抗生素類藥物，但是長(zhǎng)期使用和濫用會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，給臨床治療增加難度。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展和各種非編碼小RNA的大量發(fā)現(xiàn)，從而引起科學(xué)家對(duì)小RNA研究的熱潮。復(fù)旦大學(xué)研究人員發(fā)現(xiàn)了一種新型核糖開(kāi)關(guān)——氨基糖苷結(jié)合核糖開(kāi)關(guān)，廣泛分布在具有抗生素耐藥性的細(xì)菌病原體中［34］，其中核糖開(kāi)關(guān)是一類非編碼RNA元件。中國(guó)科技大學(xué)、華中科技大學(xué)和臺(tái)灣國(guó)立清華大學(xué)的研究人員共同證實(shí)，2種大腸埃希菌內(nèi)源性非編碼RNA-OxyS和DsrA通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)影響了線蟲(chóng)的生理學(xué)功能［35］。

志賀菌基因組內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大概60多種非編碼小RNA，而且多數(shù)與大腸埃希菌K 12菌株基因組中的小RNA是同源的，但是對(duì)于它們的功能及在志賀菌體內(nèi)的作用機(jī)制研究還不透徹，目前只有RnaG和RyhB的功能研究比較清楚。希望未來(lái)可以明確志賀菌的致病機(jī)理，并探索志賀菌的毒性、耐藥性與小RNA之間的關(guān)系，為痢疾藥物開(kāi)發(fā)提供新的作用靶標(biāo)，為痢疾桿菌疫苗研制提供一個(gè)新的思路。

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