成偉偉，張克山，劉永杰，孔漢金，尚佑軍，劉湘濤，劉 磊

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學重點開放實驗室，國家口蹄疫參考實驗室，甘肅蘭州730046；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅蘭州730070）

羊傳染性膿皰（俗稱羊口瘡）是由痘病毒科、副痘病毒屬的羊傳染性膿皰病毒又稱羊口瘡病毒（Orf virus，ORFV）引起的一種人獸共患傳染?。?］，其特征為綿羊和山羊口、唇、舌、鼻、乳房等部位皮膚與黏膜形成水皰、膿皰、潰瘍和結(jié)成疣狀厚痂［2］，該病以直接接觸和間接接觸傳染，主要危害3月齡～6月齡的羔羊和部分成年羊，羔羊發(fā)病率可達90%以上［3］。該病呈世界性分布，且廣泛流行［4］，在我國以西部地區(qū)流行較廣泛，是家畜疫病防控中的重要疫病之一。由于近年來肉羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，而該病危害嚴重，給養(yǎng)羊業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。

羊傳染性膿皰病毒（羊口瘡病毒）粒子呈橢圓形毛線團樣外觀，長220nm～300nm，寬140nm～200nm，表面為“8”字型纏繞的螺旋結(jié)構(gòu)［5］?；蚪M為線性雙鏈DNA，大小為134kb～139kb，中間是大的中央編碼區(qū)，兩端為反向末端重復序列（ITRs）形成的共價閉合的發(fā)卡結(jié)構(gòu)［6］。目前公認ORFV基因組包含16個開放閱讀框，約134個基因，其中127個為線性基因，基因組的G＋C含量可達63%～64%?；蚪M中央核心區(qū)（ORFV 009～111）相對保守主要包括與病毒復制和病毒粒子在細胞漿中裝配成熟有關(guān)的基因，主要調(diào)控病毒的復制、包裝和釋放。兩端（ORFV 001～008和ORFV 112～134）主要由與病毒的毒力、宿主范圍、免疫逃避及免疫調(diào)節(jié)有關(guān)的基因組成［7］。目前對于ORFV基因組結(jié)構(gòu)及功能還不十分清楚，本文綜述了近年來ORFV研究進展，闡述了ORFV基因組結(jié)構(gòu)及功能，以期對從事ORFV研究人員有所幫助。

1 ORFV基因組5′反向末端重復序列（ITR s）區(qū)主要基因及功能

1.1 ORFV 002基因

ORFV 002基因編碼的蛋白具有抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）的作用，NF-κB廣泛存在于各種細胞中，具有多種應激原。核因子κB抑制蛋白（inhibitor kappa B ，IκB）是 NF-κB的特異性抑制物，IκB激酶催化IκB的磷酸化，磷酸化的IκB能夠激活NF-κB。目前認為 NF-κB信號通路的主要過程為：NF-κB與IκB結(jié)合以無活性的形式存在于細胞質(zhì)中，當機體遭受病毒感染等因素刺激時，產(chǎn)生的各種激活誘導物（如細胞因子）與相應細胞表面受體結(jié)合，募集腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）受體相關(guān)因子（tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF）等結(jié)合蛋白，激活下游的激酶如 NF-κB誘導激酶（NF-κB inducing kinase，NIK）等。這些激酶并不直接磷酸化IκB，而是將信號繼續(xù)傳遞至核因子κB抑制蛋白激酶（inhibitor kappa B kinase，IκK），由后者負責磷酸化IκB。磷酸化的IκB并未與 NF-κB解離，而是迅即與泛素結(jié)合，引發(fā)IκB的泛素化并為26S蛋白酶體所識別而降解，暴露出 NF-κB核定位信號和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，NF-κB入核并結(jié)合于特定基因的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，激活特定基因轉(zhuǎn)錄［8］。ORFV 002基因編碼的蛋白通過干擾NF-κB-p65與NF-κB-p300之間的聯(lián)系而降低NF-κB-p65的乙?；瑥亩种芅F-κB的信號通路［9］。ORFV 024基因和121基因也同樣具有抑制NF-κB的作用，但作用機制有所差異，ORFV 024基因是通過逐步結(jié)合在IκK復合物的上游來抑制IκB激酶IκKα和IκKβ的磷酸化，ORFV 121基因的抑制機制是ORFV 121基因編碼的蛋白在細胞漿中和NF-κB-p65結(jié)合抑制了NF-κB-p65的磷酸化和核轉(zhuǎn)運，從而抑制了免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯［10］。

1.2 ORFV 007基因

對于ORFV 007基因（dUTPase基因）及其編碼的脫氧尿苷焦磷酸酶 （dUTP pyrophosphatase，dUTPase）的功能活性Cottone R等［11］通過研究發(fā)現(xiàn)，ORFV 007基因是一個毒力基因，而對于缺失編碼dUTPase的基因或dUTPase活性低的病毒株，其對機體的致病性明顯降低，它很可能是由于該基因的缺失導致病毒在復制過程中出現(xiàn)了缺陷。

1.3 其他基因

ORFV 003、004、008基因是與決定宿主范圍有關(guān)的基因［7］，且均編碼錨蛋白重復序列（ankyrinrepeat，ANK），ANK是普遍存在于生物體中的一種蛋白質(zhì)序列模體，F(xiàn)盒樣蛋白（F-BOX）基序已經(jīng)證明存在于大多數(shù)痘病毒的ANK中，它參與了宿主細胞的泛素∕蛋白酶體機制［12］。ORFV編碼的這些ANK通過F-BOX蛋白基序介導作用降解宿主抗病毒因子，為ORFV的復制和跨種感染提供便利。ORFV共編碼7個ANK，在ORFV基因組3′ITRs的123、126、128、129基因也同樣編碼 ANK。ORFV 006基因是與ORFV毒力相關(guān)的基因 ，而ORFV 001和005基因及編碼的蛋白的功能目前尚不清楚。

2 ORFV基因組中央核心區(qū)主要基因及功能

2.1 ORFV 011基因

ORFV 011基因（B2L基因）長1 137bp，編碼的B2L蛋白大小為41.67ku，B2L蛋白是ORFV的主要囊膜蛋白與牛痘病毒（Vaccinia virus，VACV）的主要囊膜蛋白p37k的氨基酸同源性為42%［13］。ORFV B2L基因比較保守編碼的B2L蛋白可刺激機體產(chǎn)生強烈的抗體反應，是ORFV的保護性抗原之一。ORFV編碼的B2L蛋白具有良好的免疫原性，這將在ORFV疫苗構(gòu)建方面起到重要作用。

2.2 ORFV 020基因

干擾素（interferon，IFN）的抗病毒作用主要是通過病毒與宿主在相互作用的過程中，宿主細胞會產(chǎn)生蛋白激酶（protein kinase，PKR），PKR可以被細胞內(nèi)的dsRNA或病毒復制中間體激活，而激活的PKR可以使翻譯起始因子2的α亞單位（the alpha subunit of the the initiation factor，eIF-2α）磷酸化，從而導致病毒蛋白的合成不能啟動，達到抑制病毒復制的目的［14］。ORFV的干擾素抑制基因（Orf virus interferon resistance gene，OVIFNR基因）是一種先進的抗IFN功能基因，編碼早期抗IFN的蛋白。蛋白能夠通過其羧基末端一段保守的基序競爭性結(jié)合dsRNA和病毒復制中間體，這樣就抑制了IFN誘導的PKR的激活，從而阻止宿主細胞IFN發(fā)揮 終 止 病 毒 蛋 白 翻 譯 的 作 用［15］。ORFV 的OVIFNR基因與VACV的E3L基因的同源性為31%，而編碼的氨基酸的同源性為57%。研究發(fā)現(xiàn)，體外用OVIFNR取代VACV的E3L，不會影響VACV的復制，但體內(nèi)致病力會嚴重受挫［16］。

2.3 ORFV 059基因

ORFV 059基因（F1L基因）位于ORFV基因組中部，長度為1 005bp，是一個完整的開放閱讀框，其編碼產(chǎn)生的39ku蛋白是ORFV表面微管的組成成分之一，并且能誘導宿主產(chǎn)生中和抗體，同時也能介導細胞免疫，因而該蛋白被認為是刺激機體產(chǎn)生免疫應答的主要免疫原蛋白［17］。該蛋白具有肝素結(jié)合活性，能夠與表達于大多數(shù)哺乳動物細胞表面的硫酸乙酰肝素（Heparan sulfate，HS）受體結(jié)合，因此該蛋白被認為在病毒吸附和侵入過程中起到重要作用［18］。

2.4 其他基因

ORFV 080基因編碼產(chǎn)生的蛋白與VACV A4L基因編碼產(chǎn)生的后期蛋白具有相似功能，其在病毒粒子核心蛋白的形成以及形態(tài)發(fā)生過程中起到了重要作用［7］。

ORFV 086基因是一個高度保守的晚期基因。研究表明，19ku和70ku兩個多肽都是ORFV 086基因編碼的蛋白（病毒核心蛋白p4a前體蛋白）的片段，這兩個片段在Glu-490至Arg-590區(qū)域間存在重疊，表明ORFV 086基因編碼的蛋白的水解位點可能定位于這一區(qū)域［19］，ORFV 086基因編碼的蛋白與VACA編碼的p4a蛋白同源，VACA編碼的p4a蛋白為病毒含量最多的結(jié)構(gòu)蛋白，大約占病毒粒子重量的14%。

3 ORFV基因組3′反向末端重復序列（ITRs）區(qū)主要基因及功能

3.1 ORFV 112基因

ORFV 112基因編碼一種趨化因子結(jié)合蛋白（chemokine binding protein，CBP蛋白），在病毒感染宿主的早期，趨化因子主要誘導白細胞向病毒感染部位聚集，根據(jù)趨化因子氨基端半胱氨酸殘基的排列，可將其分為4種類型，即CXC、CC、CX3C和C，其中X代表任意一種氨基酸殘基，它們是調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應的關(guān)鍵物質(zhì)。ORFV編碼產(chǎn)生的CBP蛋白結(jié)構(gòu)和功能與正痘病毒屬及黏液瘤亞群病毒屬病毒的Ⅱ型CBP蛋白相似，與CC-趨化因子（單核細胞趨化蛋白-1、巨噬細胞炎性蛋白-1a和RANTES）有高度的親和性，CBP蛋白與CC-趨化因子結(jié)合后能抑制單核細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞向感染部位集聚，與其他Ⅱ型CBP蛋白不同的是，ORFV編碼的CBP蛋白也可以與屬于C-趨化因子的淋巴細胞趨化因子結(jié)合，并通過XCR1受體抑制T、B細胞以及其他淋巴細胞向感染部位聚集［20-21］。

3.2 ORFV 117基因

ORFV 117基因僅副痘病毒屬成員具有，該基因編碼產(chǎn)生的粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）抑制因子（inhibitor of granulocytemacrophage colony-stimulating factor，GIF）可以與細胞因子GM-CSF和白介素-2（IL-2）結(jié)合并抑制其生物活性［22］。這段基因序列很可能是病毒與宿主在相互適應過程中由于基因重組而獲得，有研究表明ORFV編碼的GIF蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上類似于Ⅰ型細胞因子受體家族。ORFV編碼的GIF蛋白與Ⅰ型細胞因子受體中也存在相似的結(jié)構(gòu)，半胱氨酸殘基和 WDPWV基序，WDPWV基序?qū)儆赪SXWS基序（其中X可代表任意氨基酸），對ORFV編碼的GIF蛋白進行定點突變表明二硫鍵和WDPWV序列是其維持生物學活性所必需的結(jié)構(gòu)［23］。

3.3 ORFV 125基因

在細胞凋亡過程中，Bcl-2家族成員起著至關(guān)重要的作用。ORFV 125基因編碼的蛋白與抑制細胞凋亡有關(guān)，該蛋白能夠抑制紫外線引起的Bcl-2家族成員Bax和Bak凋亡的激活，是Bcl-2的抑制因子，也是副痘病毒屬第一個被證實的抑制細胞凋亡的蛋白［24］。

3.4 ORFV 127基因

ORFV 127基因編碼的白介素-10（virus interleukin-10，vIL-10）通常為185個氨基酸，大小約21.7ku。是ORFV早期表達的基因之一，ORFV毒株NZ2編碼的vIL-10與其他物種編碼的白介素10（interleukin-10，IL-10）的氨基酸同源性如下：綿羊（80%）、牛（75%）、人（67%）、鼠（64%）、人類皰疹病毒Ⅳ型（63%），馬皰疹病毒（67%）。vIL-10能抑制Th1細胞的增殖及IL-2、IL-3、IFN-γ和GM-CSF等細胞因子的合成以及巨噬細胞、淋巴細胞和角質(zhì)細胞分泌 TNF-α、IL-8和IFN-γ［25］。ORFV vIL-10基因在病毒成功感染宿主過程中起到了重要作用。

3.5 ORFV 132基因

ORFV的血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）基因是其早期翻譯的重要毒力基因之一，ORFV各毒株編碼的VEGF差異較大，Mercer A等［26］檢測了21株不同來源的ORFV編碼的VEGF發(fā)現(xiàn)其中大多數(shù)與NZ2毒株編碼的VEGF相似，但預測的氨基酸序列相互間的突變率卻達到30.8%，ORFV的VEGF基因具有易變性，而ORFV各毒株編碼的VEGF都保守有功能相關(guān)結(jié)構(gòu)，與其他類型的VEGF具有相似功能，能促使表皮細胞增生，引起宿主血管內(nèi)皮細胞增殖和毛細血管通透性增加等廣泛的血管變化。

4 展望

研究發(fā)現(xiàn)中央核心區(qū)B2L和F1L基因編碼的蛋白能夠誘導機體產(chǎn)生中和抗體，這對ORFV疫苗的研制具有重要作用。ORFV作為副痘病毒屬的代表成員，已進化出了一整套免疫逃避機制。ORFV的OVIFNR基因、CBP基因、GIF基因、vIL-10基因和VEGF基因在病毒抵抗宿主的免疫反應過程中發(fā)揮重要作用。ORFV在與宿主相互作用過程中不斷進化，目前對許多ORFV功能基因以及與宿主相互作用的精細程序還遠遠不為我們所探知，如ORFV基因組中還有約25個致病相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)和功能尚不明確。ORFV具有豐富的功能基因以及在免疫逃避方面表現(xiàn)出了精細的調(diào)節(jié)機制，這為深入研究ORFV的致病機理和免疫逃避機制奠定了基礎和鎖定了目標。ORFV基因組兩端的一些毒力基因表現(xiàn)出了豐富的功能特點，如OVIFNR的抗干擾素活性，CBP的趨化因子結(jié)合活性，VEGF的促血管增生功能。深入研究ORFV的基因組兩端的毒力基因?qū)⒂兄贠RFV的新型疫苗研制和為抗病毒藥物的研究打下基礎。

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