肖春宏，楊波，李善吉，李文超

(1臨滄師范高等專科學(xué)校數(shù)理系，云南臨滄677000;2嘉應(yīng)學(xué)院化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東梅州514015)

可注射型生物材料通過注射的方法植入體內(nèi)，具有微創(chuàng)性的特點(diǎn)，在組織工程和外科整形方面有著廣泛的應(yīng)用前景［1－7］。水凝膠前驅(qū)物為溶液狀態(tài)，極易注射，在體內(nèi)可快速成型，因此水凝膠體系被廣泛用于可注射型支架。作為可注射型水凝膠支架，水凝膠前驅(qū)物要求有好的生物相容性和生物降解性，并且能在溫和的條件下快速凝膠［8－13］。殼聚糖具有生物降解性和良好的生物相容性，但是酸溶性和凝膠方法限制了殼聚糖作為可注射水凝膠在體內(nèi)組織修復(fù)中的應(yīng)用［14－19］。本研究過程中，依次將聚乙二醇單甲醚(MPEG)和丙烯酰氯(AC)接枝到殼聚糖鏈上，制備了可共價(jià)交聯(lián)的水溶性殼聚糖(CS－PEG－AC)。在本研究中用細(xì)胞毒性較小的光引發(fā)劑(Irgacure2959)在特定波長(365nm)的紫外光作用下引發(fā)CS－PEG－AC聚合。由于光引發(fā)聚合有著可控的聚合反應(yīng)動力學(xué)以及聚合反應(yīng)中放熱少等優(yōu)點(diǎn)，光引發(fā)聚合在骨關(guān)節(jié)修復(fù)、牙科、眼科以及生物醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。此外，光引發(fā)聚合的可控性還滿足了水凝膠支架的可注射型要求，便于手術(shù)操作。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料與試劑

MPEG－2000，西格瑪，用甲苯共沸干燥除水;環(huán)氧氯丙烷，阿拉丁，使用前用CaO干燥24h;NaOH，廣州試劑廠;殼聚(Chitosan，CS):M=100000，浙江金橋生物化學(xué)有限公司;三乙胺，西格瑪;二氯甲烷，天津富余化學(xué)試劑廠;丙酮，廣州化學(xué)試劑廠;N、N二甲基乙酰胺，廣州化學(xué)試劑廠;甲苯，廣州化學(xué)試劑廠;四氫呋喃，廣州化學(xué)試劑廠;光引發(fā)劑2959。

1.2 Exypo－PEG合成

mPEG(10g，5mmol)60℃真空干燥48h，環(huán)氧氯丙烷epichlorohydrin(30mL)，NaOH(10g，250mmol)加入到裝有磁子的100mL單口圓底燒瓶中，體系用干燥管保護(hù)，室溫下，電磁攪拌反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后，減壓抽濾，濾去不溶物，過濾去NaCl及其他副產(chǎn)物，將濾液加入到過量(10倍溶液體積)的乙醚中，至溶液無色，進(jìn)行沉淀，沉淀產(chǎn)品經(jīng)過濾后，室溫下真空干燥24h。得產(chǎn)物7.2g，產(chǎn)率72%。

1.3 殼聚糖－mPEG的合成

2g殼聚糖溶解在300mL含量為0.4%(w/v)的乙酸溶液中。10g環(huán)氧氯丙烷－聚乙二醇單甲醚溶解在適量水20mL中，緩慢滴加到殼聚糖溶液中，混合液在80℃下，磁力攪拌反應(yīng)24h。先用0.05mol/L的NaOH溶液中和至pH在6.2附近，反應(yīng)液裝入截留分子質(zhì)量為Mn=14000透析袋，用去離子水透析除去未反應(yīng)的mPEG和小分子雜質(zhì)，透析72h，中間換水5～6次。然后冷凍干燥。得到PEG－chiosan然后用過量丙酮洗滌，去除沒反應(yīng)Exypo－PEG.樣品在室溫下真空干燥24h。

1.4 mPEG－Chitosan－Ac的合成

1g PEG－Chitosan(1.74mmol氨基重復(fù)單元，溶于50mL DMAC中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，然后混合液冷卻至0～5℃，加等HCl產(chǎn)生化學(xué)計(jì)量的三乙胺，量取0.15倍殼聚糖氨基摩爾量的丙烯酰氯(溶于10mL無水二氯甲烷)緩慢滴加到上述混合液中。0～5℃反應(yīng)4h。室溫反應(yīng)20h，反應(yīng)結(jié)束后，溶液過濾后緩慢倒入過量(10倍)丙酮中沉淀，過濾后真空干燥，溶于200倍去離子水中，得到的溶液裝入透析膜(截留分子量140kDa，透析膜，纖維素膜，Sigma)，在去離子水中透析3d除去未反應(yīng)的小分子，透析后得到的冷凍干燥。

1.5 水凝膠的溶脹比

水凝膠凍干后稱重為W0，干的水凝膠浸入37℃的水中一定時(shí)間，稱水凝膠重量為W1，平衡溶脹比定義為(W1－W0)/W0。

1.6 水凝膠的失重

200μL的水凝膠置于37℃的4mL 1mg/mL溶菌酶的PBS中。稱量不同時(shí)間下水凝膠的重量為Wt，水凝膠失重定義為(W0－Wt)×100%/W0，W0為水凝膠的起始的重量。

1.7 水凝膠的粘彈性

將大分子單體溶于PBS中，加入引發(fā)劑使其最終濃度為0.05%。將上述溶液注射到圓形透明的模具(直徑25mm，高度5rnrn)中，然后將模具放在紫外燈下照射，10min后形成水凝膠。將水凝膠取出后放在PBS溶液中24小時(shí)使其溶脹。用流變儀(ARES，Advaneed助eometrieE卻ansionSystem)的應(yīng)力控制的動態(tài)擺動模式測定溶脹后的樣品的儲能模量和損耗模量。所有的測試都是在37℃進(jìn)行的，應(yīng)變設(shè)定在1%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用完全隨機(jī)因素方差分析(one–way ANOVA)。結(jié)果用平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示。當(dāng)p＜0.05時(shí)，有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 大分子單體的制備

Epoxy－PEG的核磁共振譜圖(300MHz，CDCl3)如圖1所示。

圖1 Epoxy-PEG的核磁譜圖Fig.1 1H NMR Sprectum of Epoxy-PEG

從圖1可知，化學(xué)位移(δ)在3.2、2.8和2.6ppm處的信號為Epoxy－PEG的環(huán)氧端基的特征峰。c峰與d峰的積分面積之比1∶3，說明PEG的端基幾乎完全轉(zhuǎn)化為環(huán)氧基團(tuán)。

將殼聚糖接枝到環(huán)氧－PEG上，用透析袋透析除去未接枝上殼聚糖的環(huán)氧PEG及其他小分子雜質(zhì)，所得產(chǎn)物為mPEG－CS。其核磁譜圖(300MHz，CDCl3)如圖2所示。

圖2 mPEG-CS的核磁譜圖Fig.2 1H NMR Sprectum of mPEG-CS

從圖2中可以看出，，化學(xué)位移(δ)1.7－1.8為(NHAc)特征峰，2.6－4.4為(H－2，H－3，H－4，H－5，H－6，N－CH2－PEG)吸收峰，3.2為－OCH3吸收峰。

同時(shí)，可以根據(jù)核磁計(jì)算出mPEG的取代度(degree of substitution，DS)，即mPEG分子的摩爾數(shù)占?xì)ぞ厶擎湽?jié)摩爾數(shù)的百分比為:DS=(I3.0ppm/3I2.8ppm)×100=20%。式中的3.0是PEG上CH3的H，2.8ppm是chitosan H2。

通過?；磻?yīng)將丙烯酰氯接枝到mPEG－CS制備mPEG－CS－Ac，所得產(chǎn)物核磁譜如圖3所示。

圖3 PEG-CS-Ac的核磁譜圖Fig.3 1H NMR Sprectum of PEG-CS-Ac

從圖3可知，5.8－6.4為雙鍵CH2、CH的峰，說明雙鍵已接枝到大分子單體上，接枝率可以用雙鍵/氨基來計(jì)算，DS=(I5.8ppm/I3.3ppm)×100=13%。

2.2 聚合反應(yīng)

將5%的PEG－Chitosn－Ac水溶液加入0.05%引發(fā)劑的離心管中。充分?jǐn)嚢杈鶆蚧旌虾?，離心管在置于強(qiáng)度為10Mw/cm2的365nm的紫外燈下進(jìn)行聚合反應(yīng)。

2.3 溶脹行為

37℃下，水凝膠CS－PEG－AC/PEGDA在pH=7.2的緩沖液PBS中溶脹24后的溶脹率如圖4所示。由圖4可知，隨著PEGDA的含量的增加，溶脹性能逐漸減小，從22.3倍減少到13.6倍，這主要是隨著PEGDA的量增加，交聯(lián)密度增加，溶脹性能受到抑制。這一點(diǎn)從溶脹后凍干的水凝膠的SEM(如圖6所示)也可以看出，隨著PEGDA的量增加，水凝膠的孔密度是逐漸增加的。這和溶脹率相一致。

圖4 水凝膠CS-PEG-AC/PEGDA在緩沖液PBS中溶脹后的溶脹率Fig.4 The degree of swelling of the CSPEG-AC/PEGDA hydrogels in PBS

2.4 降解行為

用2%的大分子單體聚乙烯醇－殼聚糖－丙烯酰氯(PEG－CS－Ac)分別和4%、6%、8%及10%的聚乙二醇雙丙烯酸酯(PEGDA)合成四種水凝膠，并在37℃時(shí)，在1mg/mL溶菌酶的PBS中，對2%～4%，2%～6%，2%～8%和2%～10%四種水凝膠在溶菌酶中的降解速率進(jìn)行了測試，結(jié)果如圖5所示。

圖5 2%～4%、2%～6%、2%～8%和2%～10%水凝膠在1mg/mL溶菌酶的PBS中的降解速率Fig.5 degradation rate of 2%～4%，2%～6%，2%～8%，2%～10%hydrogels in 1mg/mL lysozyme/PBS

由圖5可知，隨著PEGDA的量增加，降解速率是逐漸減小的。第一天到第14天，降解速率相對比較穩(wěn)定，但是和其他的水凝膠相比，2%～4%降解的速率較快點(diǎn)，在第21天完全分散，而其他的水凝膠還是好的，降解速率相對比較平緩。這和降解后的水凝膠的SEM相一致(如圖6所示)。

圖6 2%～6%and 2%～10%水凝膠在1mg/mL溶菌酶PBS(37℃)中降解SEM圖(A1，A2為7天，B1，B2為14天，C1，C2為21天)Fig.6 SEM image of degradation of 2%～6%and 2%～10%hydrogels in 1mg/mL lysozyme/PBS at 37℃(A1，A2 with 7d，B1，B2 with 14d，C1，C2 with 21d)

2.5 粘彈性

殼聚糖類水凝膠的儲能模量和損耗模量如圖7所示。

圖7 2%～4%、2%～6%、2%～8%、2%～10%CS-PEG-AC/PEGDA水凝膠隨相應(yīng)頻率作用時(shí)的儲能模量(A)和損耗模量(B)(應(yīng)變和溫度分別為1%和37℃)Fig 7 Storage modulus(A)and loss modulu(B)of 2%～4%，2%～6%，2%～8%，2%～10%CS-PEG-AC/PEGDA hydrogels as a function of compressing frequency(Strain and temperature were set as 1%and 37℃，respectively)

由圖7可知，隨著PEGDA的量增加，降儲能模量和損耗模量緩慢增加，隨著頻率的增加，同一種水凝膠的降儲能模量和損耗模量緩慢增加。降儲能模量較之于損耗模量是其十幾倍，這說明所制備的水凝膠是彈性體，這和損耗因子(Eta)隨著頻率的增大表現(xiàn)出的非牛頓流體行為相一致(如圖8所示)。

圖8 2%～4%、2%～6%、2%～8%、2%～10%CSPEG-AC/PEGDA水凝膠隨相應(yīng)頻率作用下的損耗因子(應(yīng)變和溫度分別為1%和37℃)Fig.8 Eta of 2%～4%，2%～6%，2%～8%，2%～10%CS-PEG-AC/PEGDA hydrogels as a function of compressing frequency(Strain and temperature were set as 1%and 37℃，respectively)

3 結(jié)論

(1)合成了mPEG接枝率為16%、丙烯酰氯接枝10%的可交聯(lián)聚合的水溶性殼聚糖(CS－PEGAC)。CS－PEG－AC在光引發(fā)劑(Irgacure2959)的引發(fā)下聚合，形成水凝膠，反應(yīng)條件溫和。

(2)水凝膠吸收水分后可以溶脹至原重量13.2倍到22.6倍。當(dāng)PEGDA含量增加時(shí)，交聯(lián)密度較高、水凝膠的平衡溶脹比較低。水凝膠的粘彈性實(shí)驗(yàn)表明水凝膠的儲能模量在0.8kPa～1kPa，損耗模量在0.2Pa～100Pa。交聯(lián)密度較高的水凝膠，儲能模量和損耗模量也相對較高。在含溶菌酶的PBS中降解相對較慢。

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