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(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266109)

黃秋葵(AbelmoschusesculentusL. )又名秋葵、補(bǔ)腎草,為一年生草本植物,20世紀(jì)90年代從臺(tái)灣、日本等地進(jìn)入大陸,因其具有多種功能而被稱為“植物偉哥”。大量研究表明,黃秋葵多糖是黃秋葵的主要活性成分,具有抗疲勞[1 - 2]、提高免疫力[3]、抗氧化[4 - 5]、降血脂[6]、抗腫瘤[7]等多種活性。目前黃秋葵多糖主要是從莢果中提取獲得,任丹丹等[8]用響應(yīng)面法優(yōu)化黃秋葵多糖超聲提取工藝;趙煥煥[5]用水提醇沉分方法取得黃秋葵莢果中的多糖。黃秋葵莖含有同樣豐富的多糖資源,但卻被當(dāng)做工業(yè)廢料而遺棄,造成巨大的浪費(fèi)。這主要是因?yàn)榕c黃秋葵莢果相比,莖中色素含量較高,增加了多糖分離純化的技術(shù)難度。對黃秋葵莖多糖進(jìn)行脫色處理可以使其獲得良好色澤,增加莖的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

在傳統(tǒng)脫色方法中,活性炭法脫色時(shí)間長、多糖保留率低;雙氧水法脫色對多糖結(jié)構(gòu)會(huì)有較大的破壞作用,影響多糖活性[9]。新興的大孔樹脂脫色法不僅具有較高的物理化學(xué)穩(wěn)定性和較強(qiáng)的處理能力,還具有較大的比表面積、較快的吸附速度、溫和的脫色條件、較低的成本等諸多優(yōu)點(diǎn)[10 - 11],近年來受到廣泛關(guān)注。其中,大孔樹脂HP - 20是非極性樹脂,性質(zhì)穩(wěn)定,具有良好的吸附能力。廖海兵[12]用大孔樹脂HP - 20從黃秋葵果甲醇提取物中分離出多種黃酮。目前,未見用大孔樹脂HP - 20對黃秋葵多糖脫色的研究。

本文研究了大孔樹脂HP - 20對黃秋葵莖多糖進(jìn)行脫色的工藝條件,并用響應(yīng)面法對其脫色參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,為黃秋葵莖的開發(fā)和綜合利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

黃秋葵莖 市場采購;大孔樹脂HP - 20 日本三菱DIAION公司生產(chǎn);考馬斯亮藍(lán),苯酚,濃硫酸,乙醇,鹽酸,氫氧化鈉等 均為分析純。

DU - 800紫外分光光度計(jì) 美國Beckman公司;TGL - 16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)器有限公司;冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;RE - 52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;恒溫振蕩培養(yǎng)箱 蘇州麥可旺志生物技術(shù)有限公司。

1. 2 實(shí)驗(yàn)方法

1. 2. 1 黃秋葵多糖制備方法 黃秋葵莖曬干,按料水比1∶ 15加蒸餾水于22℃以180r/min搖床震蕩提取8h,紗布過濾,10000r/min離心20min,取上清液冷凍干燥備用。

1. 2. 2 大孔樹脂處理方法 一定量大孔樹脂HP - 20以一倍體積的95%乙醇浸泡24h,用蒸餾水洗至無酒精后,5%鹽酸浸泡2h,水洗至中性,再用2%氫氧化鈉浸泡2h,蒸餾水洗至中性并浸泡備用。

1. 2. 3 單因素實(shí)驗(yàn) 以脫色率和多糖保留率為指標(biāo),確定上樣質(zhì)量濃度、脫色pH、脫色溫度及脫色時(shí)間的最優(yōu)參數(shù)。采用大孔樹脂靜態(tài)脫色模型,基本脫色參數(shù)為:取大孔樹脂5mL于100mL三角瓶中,加入5mg/mL、pH為7的黃秋葵多糖溶液40mL,置于20℃保溫120r/min震蕩脫色7h,濾布過濾,取上清液計(jì)算脫色率和多糖保留率。

1. 2. 3. 1 樣品質(zhì)量濃度對脫色效果的影響 分別將黃秋葵多糖溶液的質(zhì)量濃度配成0. 5、1、5、10、15、20mg/mL,pH為7,脫色溫度20℃,脫色7h,進(jìn)行脫色并計(jì)算脫色率和多糖保留率。

1. 2. 3. 2 pH對樹脂脫色的影響 5mg/mL黃秋葵多糖溶液pH分別為3、5、7、9、11,脫色溫度20℃,為避免長時(shí)間極端pH環(huán)境會(huì)對大孔樹脂的破壞作用,因此脫色時(shí)間為縮短為3h,進(jìn)行脫色并計(jì)算脫色率和多糖保留率。

1. 2. 3. 3 脫色溫度對大孔樹脂脫色的影響 將5mg/mL pH7的黃秋葵多糖溶液分別置于10、20、30、40、50℃環(huán)境中脫色,為了避免長時(shí)間高溫大孔樹脂的破壞,因此將脫色時(shí)間縮短為3h,進(jìn)行脫色并計(jì)算脫色率和多糖保留率。

1. 2. 3. 4 脫色時(shí)間對樹脂脫色的影響 將5mg/mL pH7的黃秋葵多糖溶液于20℃環(huán)境中分別脫色1、3、5、7、9、20h,進(jìn)行脫色并計(jì)算脫色率和多糖保留率。

1. 2. 4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 根據(jù)Box - Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,綜合分析單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在Design -expert 8. 0. 6軟件平臺(tái)上,選取對脫色率和多糖保留率影響較為顯著(p<0. 05)的因素,設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),并進(jìn)行結(jié)果分析。

參考單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,選取黃秋葵多糖溶液上樣質(zhì)量濃度、pH、脫色溫度、脫色時(shí)間4個(gè)因素,設(shè)計(jì)了4因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。設(shè)計(jì)因素水平及編碼見表1。

表1 大孔樹脂對黃秋葵脫色工藝響應(yīng)面因素水平表Table 1 Coded values of corresponding actual values of independent variables in response surface design

1. 2. 5 黃秋葵脫色多糖理化性質(zhì)分析 將脫色前后的黃秋葵多糖冷凍干燥,觀察外觀,并研究其在蒸餾、無水乙醇、乙醚、丙酮、氯仿、正丁醇和三氯乙酸中的溶解性變化;用蒸餾水配成10mg/mL的溶液,測定考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)。

1. 2. 6 分析方法

1. 2. 6. 1 脫色率的測定及計(jì)算 溶液呈橙黃色,所以溶液主要吸收藍(lán)色波段可見光,因此選擇該波段中心的450nm波長為檢測波長。計(jì)算公式為:

脫色率(%)=脫色前吸光度 - 脫色后吸光度/脫色前吸光度×100

1. 2. 6. 2 多糖及其保留率的測定 利用苯酚 - 硫酸法[13]測定黃秋葵多糖溶液脫色前后的多糖含量。計(jì)算公式為:

1. 2. 6. 3 蛋白質(zhì)定性測定 采用考馬斯亮藍(lán)法[14]

2 結(jié)果與分析

2. 1 苯酚硫酸法測多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)曲線可得,回歸方程為Y=0. 0059X - 0. 001,相關(guān)系數(shù)R2為0. 9992,說明方程99. 92%的變化來自變量,相關(guān)性良好,方程有效。

圖1 苯酚 - 硫酸法測定多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve of the content determination of polysaccharide withe phenol - sulfur cacid method

2. 2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2. 2. 1 上樣質(zhì)量濃度對脫色效果的影響 結(jié)果如圖2所示,隨著上樣質(zhì)量濃度的增加,脫色率呈降低趨勢,在上樣質(zhì)量濃度為10 ～ 15mg/mL范圍內(nèi)脫色率已經(jīng)降低到90%以下,這可能與大孔樹脂與黃秋葵多糖色素的接觸面飽和從而使大孔樹脂的吸附能力降低有關(guān);隨著上樣質(zhì)量濃度的增加多糖保留率逐漸增加,在5 ～ 10mg/mL增長較為明顯。綜合考慮脫色率和多糖保留率,選擇10mg/mL為黃秋葵多糖脫色的較適宜上樣質(zhì)量濃度。

圖2 上樣質(zhì)量濃度對脫色效果的影響Fig. 2 Effect of sample concentration on decolorization rate and polysaccharide retention rate注:不同字母上標(biāo)代表數(shù)值間差異顯著(p<0. 05),圖3 ～ 圖5同。

2. 2. 2 pH對脫色效果的影響 結(jié)果如圖3所示,隨著pH的增加,脫色率和多糖保留率呈先升高后降低的趨勢。脫色率在酸性范圍內(nèi)較高,在堿性范圍內(nèi)脫色效果明顯下降,在pH6附近最高,接近多糖溶液的自然pH。分析原因,在酸性條件下,黃秋葵多糖溶液中的色素表現(xiàn)為弱極性或非極性,從而減弱與大孔樹脂的結(jié)合作用;在偏堿性條件下,某些色素分子性質(zhì)可能發(fā)生改變,使得樣品溶液顏色加深從而導(dǎo)致脫色效果不明顯,脫色率降低。多糖保留率在酸性范圍內(nèi)隨著pH的增大而升高,當(dāng)pH大于7時(shí)開始降低。為獲得較好的脫色效果,選擇pH6為較適宜pH。

圖3 pH對脫色效果的影響Fig. 3 Effect of pH value on decolorization rate and polysaccharide retention rate

2. 2. 3 脫色溫度對脫色效果的影響 結(jié)果如圖4所示,脫色溫度對黃秋葵多糖脫色率整體上起促進(jìn)作用,脫色率隨著脫色溫度的升高有顯著提高,分析原因是色素分子擴(kuò)散速度隨溫度的增加而加快,多糖溶液的黏度下降,從而有利于色素的吸附。溫度對多糖保留率的影響較明顯,隨著脫色溫度的升高多糖保留率明顯降低,在脫色溫度為20℃時(shí)多糖保留率為92. 15%,而在30℃時(shí)則下降到85. 17%。為了獲得較高的脫色率和多糖保留率,并結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)要求和條件,選擇20℃為黃秋葵多糖脫色較為適宜的溫度。

圖4 溫度對脫色效果的影響Fig. 4 Effect of temperature on decolorization rate and polysaccharide retention rate

2. 2. 4 脫色時(shí)間對脫色效果的影響 結(jié)果如圖5所示,當(dāng)脫色時(shí)間在7h以內(nèi)時(shí),隨著脫色時(shí)間的延長,脫色率明顯增加,脫色7h后,脫色率增加緩慢,脫色9h以后脫色率幾乎不再變化,即脫色20h與脫色9h時(shí)的脫色率沒有顯著性差異,分析原因可能是色素的吸附和解吸已經(jīng)達(dá)到了平衡。另一方面,多糖保留率隨脫色時(shí)間的延長呈降低趨勢,當(dāng)脫色時(shí)間在0 ～ 9h之間時(shí)多糖保留率降低尤為明顯。為了獲得較高的脫色率并兼顧多糖保留率,選擇7h為大孔樹脂對黃秋葵多糖進(jìn)行脫色的較適宜時(shí)長。

圖5 時(shí)間對脫色效果的影響Fig. 5 Effect of time on decolorization rate and polysaccharide retention rate

2. 3 響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件

2. 3. 1 響應(yīng)面結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)30個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn),其中24個(gè)析因?qū)嶒?yàn),6個(gè)中心實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。利用Design - Expert 8. 0. 6軟件對表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合,得到以脫色率(Y1)和多糖保留率(Y2)為響應(yīng)值的二次多項(xiàng)回歸方程為:

Y1=91. 41 - 0. 47X1+0. 26X2+0. 022X3+0. 47X4-0. 075X1X2- 0. 51X1X3- 0. 24X1X4+0. 37X2X3- 0. 16X2X4+0. 15X3X4- 0. 52X12- 0. 74X22- 0. 29X32- 0. 34X42

Y2=85. 16+0. 076X1+0. 14X2- 0. 011X3- 0. 15X4+0. 12X1X2+0. 26X1X3+0. 04X1X4+0. 04X1X4- 0. 24X2X3- 0. 096X2X4+0. 26X3X4- 0. 63X12- 0. 55X22- 0. 57X32-0. 39X42

分別對大孔樹脂脫色率和多糖保留率的回歸模型及各參數(shù)的顯著性進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果見表3和表4。由表3可得,脫色率為響應(yīng)值的回歸模型中,模型p值小于0. 0001為極顯著,失擬項(xiàng)的p值為0. 5695>0. 05,對脫色率影響不顯著,說明該模型的擬合度較好,可以利用該模型確定最佳工藝條件。其中R2為0. 9605,說明響應(yīng)值(脫色率)有96. 05%的變化來自所選變量。模型的一次項(xiàng)X1和X4對脫色率影響極顯著,X2影響顯著,交互項(xiàng)X1X3影響極顯著,X1X4和X2X3影響顯著,二次項(xiàng)X12、X22和X42影響極顯著,X32影響顯著,其余均不顯著,表明各影響因素對于脫色率的影響不是簡單的線性關(guān)系。剔除影響不顯著的各項(xiàng),簡化后的回歸方程為:

Y1=91. 41 - 0. 47X1+0. 26X2+0. 47X4- 0. 51X1X3-0. 24X1X4+0. 37X2X3- 0. 52X12- 0. 74X22- 0. 29X32- 0. 34X42

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果表Table 2 Experimental design for response surface analysis and corresponding experimental data

由表4可得,多糖保留率為響應(yīng)值的回歸模型中,p值小于0. 001為極顯著,失擬項(xiàng)的p值為0. 4356>0. 05,對多糖保留率影響不顯著,說明該模型的擬合度較好?？梢岳迷撃Ｐ痛_定最佳工藝條件。其中R2為0. 9622,說明響應(yīng)值(多糖保留率)有96. 22%的變化來自所選變量。模型一次項(xiàng)X2和X4對多糖保留率影響顯著,交互項(xiàng)X1X3、X2X3和X3X4影響顯著,二次項(xiàng)影響極顯著,其余均不顯著,表明各影響因素對多糖保留率的影響不是簡單的線性關(guān)系。剔除影響不顯著的各項(xiàng),簡化后的回歸方程為:

Y2=85. 16+0. 14X2- 0. 15X4+0. 26X1X3- 0. 24X2X3+0. 26X3X4- 0. 63X12- 0. 55X22- 0. 57X32- 0. 39X42

2. 3. 3 兩因素間的交互效應(yīng)分析 由表3和表4可知,交互項(xiàng)X1X4對脫色率影響極顯著,X1X3與X2X3對脫色率的影響顯著;X1X3、X2X3以及X3X4對多糖保留率影響顯著。利用Design Expert 8. 0. 6軟件進(jìn)行分析兩兩考察因素間交互作用的響應(yīng)面3D圖,如圖6和圖7所示,可直觀地看出反應(yīng)各因素和響應(yīng)值及各考察因子之間的交互作用。響應(yīng)面圖全部開口向下,隨著每個(gè)因素的編碼值的增大,響應(yīng)值增大,當(dāng)響應(yīng)值增大到極值后,又隨著因素編碼值的增大逐漸減少,從響應(yīng)面的最高點(diǎn)和等高線可看出在所選的范圍內(nèi)存在極值,即該模型有穩(wěn)定點(diǎn),且穩(wěn)定點(diǎn)是最大值。

如圖6所示,脫色率隨X1X3、X1X4以及X2X3的改變而改變,呈現(xiàn)出先增后減的趨勢。根據(jù)響應(yīng)面的陡峭程度可以看出上樣濃度對脫色率的影響較脫色溫度和脫色時(shí)間對其的影響較大。若要獲得較高的脫色率,上樣濃度應(yīng)在7. 81 ～ 9. 97mg/mL范圍,pH在5. 8 ～ 6. 2范圍內(nèi),脫色溫度應(yīng)在17. 86 ～ 25. 56℃范圍,脫色時(shí)間在6. 8 ～ 7. 6h范圍。

圖6 因素交互影響脫色率的響應(yīng)面圖Fig. 6 Response surfaces of the pairwise interactive effects of two decolorization conditions on decolorization rate

表3 脫色率為響應(yīng)值回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance table

注:p值小于0. 05,表示對應(yīng)因素對響應(yīng)值的影響顯著,用*表示;小于0. 01為極顯著,用* *表示,表4同。

表4 多糖保留率為響應(yīng)值回歸模型方差分析表Table 4 Analysis of variance table

如圖7所示,多糖保留率隨X1X3、X1X4以及X2X3的改變而改變,呈先增后減的趨勢。若要獲得較高的多糖保留率,上樣質(zhì)量濃度應(yīng)該控制在9 ～ 11mg/mL之間,pH應(yīng)控制在5. 82 ～ 6. 25之間,脫色溫度應(yīng)控制在22. 72 ～ 18. 37℃之間,脫色時(shí)間應(yīng)控制在6. 8 ～ 7. 2h之間。

圖7 因素交互影響多糖保留率的響應(yīng)面圖Fig. 7 Response surfaces of the pairwise interactive effects of two decolorization conditions on polysaccharide retention

2. 3. 4 最佳條件優(yōu)化及驗(yàn)證結(jié)果 通過所得回歸模型對脫色工藝進(jìn)行優(yōu)化,得到最佳脫色工藝條件為上樣質(zhì)量濃度9. 74mg/mL、pH6. 07、脫色溫度20. 23℃、脫色時(shí)間7. 07h,在此條件下脫色率的最大理論值為91. 56%,多糖保留率的最大理論值為85. 11%?？紤]實(shí)際操作情況,確定大孔樹脂HP - 20對黃秋葵多糖的最佳脫色工藝為上樣質(zhì)量濃度9. 8mg/mL、脫色pH為6、脫色溫度20℃、脫色時(shí)間7h。對此優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證,重復(fù)3次,平均脫色率為91. 07%,平均多糖保留率為85. 52%,表明該回歸模型具有較好的預(yù)測性能,可用于指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)。

2. 4 最佳工藝參數(shù)下獲得脫色黃秋葵多糖理化性質(zhì)分析

將最佳脫色工藝下獲得的多糖溶液冷凍干燥,進(jìn)行理化性質(zhì)分析,結(jié)果見表5。脫色前后多糖固體由橙黃色變?yōu)槿榘咨?溶解性沒有發(fā)生變化;考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)由脫色前的陽性變?yōu)槊撋蟮年幮?說明大孔樹脂具有去除蛋白、純化樣品的作用。由此說明,大孔樹脂HP - 20對黃秋葵多糖的脫色效果較好,沒有改變其基本性質(zhì),為黃秋葵多糖進(jìn)一步分離純化提供參考。

3 結(jié)論及討論

本研究以脫色率和多糖保留率為指標(biāo),通過探究上樣質(zhì)量濃度、脫色pH、脫色溫度及脫色時(shí)間在大孔樹脂HP - 20對黃秋葵多糖脫色效果中的影響,獲得最優(yōu)脫色工藝參數(shù)。通過單因素實(shí)驗(yàn)確定響應(yīng)因素,由中心組合實(shí)驗(yàn)獲得大孔樹脂HP - 20對黃秋葵多糖的脫色率(Y1)和多糖保留率(Y2)分別與上樣質(zhì)量濃度(X1)、pH(X2)、脫色溫度(X3)和脫色時(shí)間(X4)的回歸方程:

Y1=91. 41 - 0. 47X1+0. 26X2+0. 47X4- 0. 51X1X3-0. 24X1X4+0. 37X2X3- 0. 52X12- 0. 74X22- 0. 29X32- 0. 34X42

Y2=85. 16+0. 14X2- 0. 15X4+0. 26X1X3- 0. 24X2X3+0. 26X3X4- 0. 63X12- 0. 55X22- 0. 57X32- 0. 39X42

表5 黃秋葵多糖脫色前后理化性質(zhì)Table 5 The table of physical and chemical properties of okra polysaccharide before and after decoloring

兩個(gè)方程的擬合度較好,可信度也較高。通過所得回歸模型對脫色工藝進(jìn)行優(yōu)化,確定大孔樹脂HP - 20對黃秋葵多糖的最佳脫色工藝為上樣質(zhì)量濃度9. 8mg/mL、脫色pH為6、脫色溫度20℃、脫色時(shí)長7h。對此優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證,重復(fù)3次,平均脫色率為91. 07%,平均多糖保留率為85. 52%,表明該回歸模型具有較好的預(yù)測性能,可用于指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)。

大孔樹脂對色素物質(zhì)的吸附,反應(yīng)條件溫和,避免了傳統(tǒng)脫色工藝化學(xué)反應(yīng)對需保留物質(zhì)的破壞。目前,大孔樹脂脫色工藝已大量應(yīng)用于研究中,夏瑋等[15]通過比較發(fā)現(xiàn)大孔樹脂AB - 8樹脂對桑葉多糖的脫色效果最佳,脫色率達(dá)82%,多糖保留率可達(dá)83%;張強(qiáng)華等[16]通過比較獲得大孔樹脂D941對甜葉菊糖苷溶液的脫色效果較好,脫色率在90%左右;羅璽等[17]研究表明大孔樹脂D303對靈芝多糖的脫色效果最好,脫色率可達(dá)91. 89%,多糖保留率75. 28%;本實(shí)驗(yàn)通過大孔樹脂HP - 20對黃秋葵多糖溶液進(jìn)行處理也獲得較理想的脫色效果。在生產(chǎn)實(shí)踐中,一些企業(yè)也開始用大孔樹脂對樣品進(jìn)行脫色處理,改善產(chǎn)品外觀,提高有效成分含量。

本實(shí)驗(yàn)利用大孔樹脂對黃秋葵多糖溶液進(jìn)行脫色處理,降低了色素含量,改善了其外觀,同時(shí)提高了黃秋葵多糖的純度;用響應(yīng)面法進(jìn)行了脫色工藝的優(yōu)化,獲得了脫色最佳工藝參數(shù),對黃秋葵多糖的進(jìn)一步研究和產(chǎn)品的開發(fā)有所助益。

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