謝海嘯，王瑩宇，周武，王秀秀，王明山

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科，浙江 溫州 325015）

·臨床經(jīng)驗(yàn)·

凝血因子Ⅻ缺陷癥導(dǎo)致再發(fā)體外受精和胚胎移植失敗原因2例分析

謝海嘯，王瑩宇，周武，王秀秀，王明山

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科，浙江 溫州 325015）

目的：探討機(jī)體凝血因子Ⅻ（FⅫ）水平對(duì)再發(fā)體外受精和胚胎移植（IVF-ET）的影響。方法：檢測(cè)患者凝血酶原時(shí)間（PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、凝血因子Ⅻ促凝活性（FⅫ:C）、纖溶酶原活性（PLG:C）、D-二聚體（D-D）等凝血指標(biāo)；PCR擴(kuò)增FⅫ基因的14個(gè)外顯子及其側(cè)翼序列，進(jìn)行DNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)基因突變，則反向測(cè)序予以證實(shí)。50例正常對(duì)照組用于排除FⅫ基因多態(tài)性。結(jié)果：2例FⅫ缺陷患者APTT顯著延長(zhǎng)，F(xiàn)Ⅻ:C明顯降低。患者1基因分析發(fā)現(xiàn)g.6753delACA雜合突變（國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道）和46T/T。患者2發(fā)現(xiàn)g.7142insertC雜合突變和46C/T。結(jié)論：FⅫ缺陷癥患者易導(dǎo)致機(jī)體纖溶功能下降，是引起患者IVF-ET失敗的重要原因之一。

凝血因子Ⅻ；體外受精-胚胎移植；基因；缺陷

凝血因子X(jué) I I（FX I I）是內(nèi)源性凝血途徑的啟動(dòng)因子；同時(shí)在纖溶系統(tǒng)中，F(xiàn)X I I由于具有與組織型纖溶酶原激活物（t-PA）和尿激酶型纖溶酶原激活物（u-PA）同源性的絲氨酸結(jié)構(gòu)，也參與纖溶途徑的激活，纖溶酶原的內(nèi)激活途徑主要由活化的FX I I（FX I Ia）來(lái)完成。FX I I缺乏易導(dǎo)致纖溶功能下降，是靜脈血栓栓塞癥（VTE）的危險(xiǎn)因素[1]。已有學(xué)者報(bào)道部分再發(fā)流產(chǎn)可能因?yàn)樾纬商ケP(pán)微血栓而導(dǎo)致，與FX I I缺陷有關(guān)[2]。體外受精和胚胎移植（IVF-ET）俗稱(chēng)“試管嬰兒”技術(shù)，開(kāi)始于1978年，是一種輔助生育技術(shù)，該技術(shù)至今已相對(duì)成熟。IVF-ET失敗容易發(fā)生在妊娠早期，再發(fā)IVF-ET失敗與再發(fā)流產(chǎn)有很多相似之處。本研究收集了2例FX I I缺陷患者，對(duì)其再發(fā)IVF-ET失敗的原因進(jìn)行了探討。

1 資料和方法

1.1 一般資料患者1：女，25歲，雙側(cè)輸卵管堵塞，2次IVF-ET失敗。2次均在胚胎植入第14天查血清絨毛膜促性腺激素（hCG）低下，分別在胚胎植入第16天和第22天流產(chǎn)?；颊哐獫{凝血酶原時(shí)間（PT）正常；活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）顯著延長(zhǎng)；凝血因子X(jué) I I促凝活性（FX I I:C）極度降低?；颊吒文I功能正常，無(wú)自身免疫性疾病，無(wú)長(zhǎng)期服藥史。

患者2：女，34歲，重度子宮內(nèi)膜異位癥，2次IVF-ET失敗。第一次在胚胎植入第30天B超發(fā)現(xiàn)宮外孕，流產(chǎn)。第二次在胚胎植入第14天流產(chǎn)。2次均表現(xiàn)為hCG低下?；颊逷T正常，APTT明顯延長(zhǎng)，F(xiàn)X I I:C明顯下降。患者肝腎功能正常，無(wú)自身免疫性疾病，無(wú)長(zhǎng)期服藥史。

正常對(duì)照組50例，其中男23例，女27例，年齡18～59歲，平均30歲，均為我院健康體檢者。對(duì)照組經(jīng)查均無(wú)肝腎功能疾病，無(wú)血栓或出血史，采樣前已征得本人同意。正常對(duì)照組用于排除FX I I基因多態(tài)性。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集和處理：在征得患者知情同意后，采集外周靜脈血，0.109 mol/L枸櫞酸鈉1:9抗凝，立即于3 000 r/min離心10 min后收集上層血漿用于凝血指標(biāo)檢測(cè)，2 h內(nèi)檢測(cè)完畢。剩余的血細(xì)胞-40 ℃凍存，用于DNA提取。

表1 2例FXII缺陷患者凝血指標(biāo)項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果

1.2.2 凝血相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)：法國(guó)STAGO全自動(dòng)血凝儀檢測(cè)PT、APTT、纖維蛋白原（FIB）、凝血因子VI I I促凝活性（FVI I I:C）、凝血因子I X促凝活性（FI X: C）、凝血因子X(jué) I促凝活性（FX I:C）和FX I I:C、狼瘡抗凝物（LAC）、纖溶酶原活性（PLG:C）、D-二聚體（D-D）。試劑由STAGO公司配套提供。所有操作步驟均嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

FX I I基因測(cè)序：按常規(guī)酚-氯仿法抽提患者外周血基因組DNA。根據(jù)FXI I基因序列（GenBank AF538691），應(yīng)用primer5軟件共設(shè)計(jì)7對(duì)引物以覆蓋FXI I基因的所有外顯子區(qū)域及其側(cè)翼序列[3]。引物由上海桑尼生物工程有限公司合成。PCR產(chǎn)物原液送上海桑尼生物工程有限公司測(cè)序。用Chromas軟件將測(cè)序結(jié)果與美國(guó)NCBI基因庫(kù)所公布的FX I I基因序列進(jìn)行比對(duì)，尋找基因突變。發(fā)現(xiàn)基因突變的序列則反向測(cè)序予以證實(shí)。

2 結(jié)果

2.1 凝血指標(biāo)檢測(cè)2位患者APTT均明顯延長(zhǎng)，F(xiàn)X I I:C都明顯下降。其余凝血指標(biāo)PT、FIB、FVI I I: C、FIX:C、FXI:C、LAC基本正常，PLG:C偏高，D-D較低。見(jiàn)表1。

2.2 FX I I基因分析患者1：FX I I exon1啟動(dòng)子區(qū)46位多態(tài)性為46T/T型（見(jiàn)圖1a），exon9區(qū)克隆測(cè)序，4條克隆序列有2條發(fā)現(xiàn)6753-6755位缺失了3個(gè)堿基ACA，另2條序列正常，即發(fā)生了g.6753delACA雜合突變（見(jiàn)圖1b）。通過(guò)對(duì)50例正常對(duì)照組進(jìn)行篩查及查詢(xún)基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi. nlm.nih.gov/snp），初步排除了基因多態(tài)性的可能，且查詢(xún)FX I I基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)（http:/ /www.hgmd.cf.ac.uk/ac/all.php），故認(rèn)為g. 6753delACA突變?yōu)樾碌耐蛔?。患?：FX I Iexon1啟動(dòng)子區(qū)46位多態(tài)性為46C/T型（見(jiàn)圖1c），exon10區(qū)7142位插入一個(gè)堿基C，即g.7142insertC雜合突變（見(jiàn)圖1d），該位點(diǎn)已有報(bào)道[4]。

3 討論

人類(lèi)FX I I基因定位于染色體5q33-qter，DNA全長(zhǎng)約為12 kb，含14個(gè)外顯子和13個(gè)內(nèi)含子。FX I I是在肝臟中合成的絲氨酸蛋白酶，是一個(gè)由596個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈糖蛋白。成熟FX I I含有數(shù)個(gè)結(jié)構(gòu)功能區(qū)：自氨基末端起分別是I I型纖維連接蛋白區(qū)（type I I）-表皮生長(zhǎng)因子同源（EGF）區(qū)-I型纖維連接蛋白區(qū)（type I）-EGF區(qū)-kringle區(qū)和催化區(qū)，且FXI I啟動(dòng)子區(qū)對(duì)雌激素敏感。FXI I的蛋白結(jié)構(gòu)與t-PA和u-PA相似，F(xiàn)X I I由激肽-激肽釋放酶活化為FX I Ia，F(xiàn)X I Ia參與纖溶系統(tǒng)內(nèi)激活途徑，使纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶。遺傳性FX I I缺陷癥在高加索人群中發(fā)病率為1.5%～3.0%[5]。目前較多學(xué)者認(rèn)為FX I I缺陷是靜脈血栓和心肌梗死的危險(xiǎn)因子。FX I I缺陷沒(méi)有明顯的臨床癥狀，大多是體檢或術(shù)前常規(guī)檢查發(fā)現(xiàn)APTT延長(zhǎng)，若是中等程度的FX I I缺陷，APTT可能還在正常范圍內(nèi)，這更加不能引起臨床重視，存在FX I I缺陷的漏檢。

圖1 2例患者FXII基因測(cè)序圖

再發(fā)流產(chǎn)是指2次及2次以上自然流產(chǎn)，引起再發(fā)流產(chǎn)有很多原因，包括染色體異常、內(nèi)分泌異常、自身免疫病及其他病癥等，但可能還有其他潛在的原因未能引起重視，例如母體內(nèi)凝血和纖溶系統(tǒng)是否失衡等。有文獻(xiàn)[6]報(bào)道FX I I活性低下人群有12%再發(fā)流產(chǎn)，而正常對(duì)照組為1.5%。再發(fā)流產(chǎn)可能與FX I I活性減低有關(guān)[2，7-8]。再發(fā)IVF-ET失敗患者與再發(fā)流產(chǎn)有很多相似之處，日本學(xué)者M(jìn)atsubayashi等[9]研究了110名再發(fā)IVF-ET失敗患者的FX I I活性，發(fā)現(xiàn)其平均活性明顯低于正常對(duì)照組，并建議有必要對(duì)IVF-ET成功組和IVF-ET失敗組的FX I I活性進(jìn)行比對(duì)，希望能明確FX I I活性低于多少會(huì)增加IVF-ET失敗的風(fēng)險(xiǎn)。本課題組已對(duì)遺傳性凝血因子缺陷癥進(jìn)行了數(shù)年的研究[3，10]，現(xiàn)收集到2例再發(fā)IVF-ET失敗且APTT明顯延長(zhǎng)的FX I I缺陷癥患者，對(duì)其FX I I表型和基因水平進(jìn)行了檢測(cè)。

患者1 FXI I基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)exon1啟動(dòng)子區(qū)46T/ T和exon9編碼區(qū)g.6753-6755delACA突變?；颊?發(fā)現(xiàn)exon1啟動(dòng)子區(qū)46C/T和exon10編碼區(qū)g.7142insertC。FX I I基因exon1啟動(dòng)子區(qū)第46位多態(tài)性較常見(jiàn)，分別有46C/C、46C/T、46T/T三種基因型，46C/C為野生型。C→T置換后，在原始起始密碼子ATG前4個(gè)堿基處形成一個(gè)新的起始密碼子，從這個(gè)突變的起始密碼子開(kāi)始下游第7個(gè)堿基處產(chǎn)生終止密碼子（TGA），從而使翻譯提前終止，導(dǎo)致FX I I活性下降。46T/T基因型比46C/T基因型更能引起FX I I活性降低[1]。患者1另一突變?yōu)閑xon9區(qū)g.6753delACA。本課題組曾報(bào)道過(guò)exon9區(qū)g.6800del9bp突變[3]，該突變蛋白在COS7細(xì)胞內(nèi)大量積聚，但伴有分泌障礙，導(dǎo)致細(xì)胞外蛋白表達(dá)下降。本資料中g(shù).6753delACA距g.6800del9bp較近，推測(cè)該突變有可能也會(huì)導(dǎo)致FX I I蛋白表達(dá)下降，且g.6753delACA突變致使第271位密碼子天冬酰胺缺失，該密碼子距離exon9區(qū)剪切位點(diǎn)僅有2個(gè)氨基酸位置，它的缺失很可能不利于exon9區(qū)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究?；颊?另一突變是exon10區(qū)g.7142insertC，致使346位氨基酸賴(lài)氨酸變成谷氨酰胺（Lys346Gln），并在編碼了68個(gè)氨基酸后產(chǎn)生終止密碼子，即產(chǎn)生了截短蛋白[4]。本研究推測(cè)患者1 FX I I:C極度降低，可能由啟動(dòng)子區(qū)46T/T和exon9編碼區(qū)g.6753delACA突變共同引起；患者2的低FX I I:C可能由啟動(dòng)子區(qū)46C/ T和exon10編碼區(qū)7142insertC導(dǎo)致。

FX I I的缺陷會(huì)使纖溶功能降低，因?yàn)槔w溶酶原的內(nèi)激活途徑主要由FX I Ia來(lái)完成。2例FX I I缺陷患者均有纖溶功能低下的表現(xiàn)：PLG偏高，D-D較低。PLG是血漿纖維蛋白水解酶無(wú)活性的前體，當(dāng)血液凝固時(shí)，PLG大量吸附在纖維蛋白網(wǎng)上，在纖溶酶原激活劑作用下，轉(zhuǎn)化為纖溶酶，促使纖維蛋白溶解。PLG增高表示纖溶活性減低，如高凝狀態(tài)、血栓性疾病等。D-D是交聯(lián)纖維蛋白降解的特異標(biāo)志物之一，D-D含量下降提示纖溶功能受抑制。2例FX I I缺陷患者實(shí)行IVF-ET后，因本身FX I I活性低下，纖溶功能降低，有血栓形成傾向，有可能會(huì)在母體胎盤(pán)絨毛間隙形成微血栓[2]等，有較大的流產(chǎn)危險(xiǎn)。

綜上所述，本研究對(duì)2例再發(fā)IVF-ET失敗患者進(jìn)行了FX I I基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了exon9區(qū)新的g.6753delACA雜合突變，及exon10區(qū)g.7142insertC雜合突變和較常見(jiàn)的46C/T多態(tài)性。2例患者再發(fā)IVF-ET失敗和FX I I水平嚴(yán)重缺陷有關(guān)。FX I I缺陷易導(dǎo)致機(jī)體纖溶功能下降，是引起患者IVF-ET失敗的重要原因之一，建議臨床有必要對(duì)再發(fā)IVF-ET失敗患者進(jìn)行FX I I水平檢測(cè)，有助于IVF-ET的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

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（本文編輯：吳健敏）

Factor XII deficiency in two women with recurrent in vitro fertilization-embryo transfer failure

XIE Haixiao, WANG Yingyu, ZHOU Wu, WANG Xiuxiu, WANG Mingshan.Department of Laboratory, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To identify the possible correlation of FXII deficiency with recurrent IVF-ET failure.Methods:Prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT), FXII procoagulant activity (FXII:C), Plasminogen activity, D-Dimer and other coagulant parameters were detected. Exons 1-14, boundary introns including the splice junctions of the FXII gene were amplified with Polymerase chain reaction (PCR). The PCR products were purified and sequenced directly. If a gene mutation was found, then reverse sequence to confirm it. Fifty heathy persons as normal controls.Results:Both APTT in the two patients were significantly prolonged. And the FXII:C values of the patients were low. Patient 1 was found heterozygous deletion mutation g.6753delACA in exon 9 and 46T/T genetype in the promoter region of FXII gene. Patient 2 was found heterozygous insert mutation g.7142 insertC in exon 10 and 46C/T genetype. The mutation of FXII g.6753delACA was a new mutation. Conclusion: FXII deficiency may contribute to impairment of fibrinolytic activity. Decreased FXII activity may be one of the important reasons of recurrent IVF-ET failure.

coagulation factor XII; in vitro fertilization-embryo transfer; gene; deficiency

R394

B

1000-2138（2014）04-0286-04

2013-08-19

溫州市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（Y20100 208)。

謝海嘯（1979-），女，浙江溫州人，主管技師。

王明山，副主任技師，碩士生導(dǎo)師，Email：wywms@ 126.com。