舒凡帆，代 琦，蘇錫鈞，蘇子峰，蘇鴻雁

（大理學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003）

云南是我國牦牛生產(chǎn)的重要基地之一，牦牛是牛屬（Bosspp.）動物中能適應(yīng)高寒氣候條件的特有種類，是唯一能夠充分利用高山牧場自然資源的牛種〔1〕。大理花甸壩牧場、中甸打日壩牧場、白馬雪山牧場牦牛養(yǎng)殖是當(dāng)?shù)剞r(nóng)牧民生產(chǎn)生活的源泉之一。近年來，由于草原放牧的牦牛與其他各種家畜交錯放牧，接觸頻繁，致使牦牛感染寄生蟲病情況處于上升趨勢〔2〕。長期以來，控制和預(yù)防牦牛消化道線蟲病主要以化學(xué)藥物為主，但藥物無節(jié)制的使用不僅易導(dǎo)致耐藥蟲株大量產(chǎn)生，而且會造成藥物殘留在畜產(chǎn)品中的食品衛(wèi)生安全問題。用化學(xué)藥物進行線蟲病防治副作用較大，如蟲體抗藥性問題、藥物殘留及藥物代謝產(chǎn)物影響生態(tài)環(huán)境等問題，而且絕大多數(shù)化學(xué)藥物僅對成蟲起作用，對蟲卵及幼蟲無能為力。因此，人們一直在尋求新的防治方法〔3〕。

捕食線蟲真菌（nematode-trapping fungi）是線蟲重要的天敵之一，且廣泛存在于自然界中，其通過菌絲特化形成各種捕食結(jié)構(gòu)捕食線蟲，是目前研發(fā)寄生線蟲生防制劑的重要資源〔4〕。其特點是在線蟲幼蟲感染動物之前將其殺死，避免家畜的感染或重復(fù)感染〔5〕。國外畜牧業(yè)發(fā)達的國家，如新西蘭、澳大利亞等，已成功將捕食線蟲真菌開發(fā)成生防制劑，并成功應(yīng)用于家畜寄生線蟲病的防治〔6-7〕。國內(nèi)許多學(xué)者在這一領(lǐng)域也取得了顯著的成果〔8-10〕。

然而，對于特定牧區(qū)寄生線蟲的生物防治，土著生防菌因長期適合本地區(qū)自然環(huán)境條件而成為首選的評估資源，該類生防菌不僅需具有抗消化的能力，還需具有較強的捕食活力〔11〕。通過前期對云南3 個高原牧場：大理花甸壩牧場、中甸打日壩牧場、白馬雪山牧場捕食線蟲真菌資源的初步調(diào)查，已獲得40株捕食線蟲真菌。本實驗擬從中選出12株捕食線蟲真菌做體外抗消化試驗并測定捕食率，擬篩選出具有抗消化能力且捕食活力較高的生防菌株，以期為牦牛及其它動物線蟲病的生物防治提供捕食線蟲真菌菌種資源。

1 材料和方法

1.1 供試菌由大理學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院微生物實驗室分離于云南大理花甸壩，中甸打日壩牧場及白馬雪山牧場新鮮耗牛糞便〔12-13〕，共12株捕食線蟲真菌，包括3株少孢節(jié)叢孢（A.oligospora）、3株彎孢節(jié)叢孢（A. musiformis），3 株橢圓隔指孢（D. ellipsospora）及3 株長孢隔指孢（D. leptospora）。見表1。

表1 抗鹽酸胃蛋白酶的捕食線蟲真菌篩選結(jié)果

1.2 線蟲秀麗隱桿線蟲（Paragrellus redivius）：參照文獻〔14〕方法制備新鮮有活力的第三期線蟲幼蟲，用無菌水將其制成每100 μL約含50條線蟲幼蟲懸液。

1.3 培養(yǎng)基CMA（玉米粉瓊脂）：參照文獻〔15〕方法制備0.4 g/L玉米粉瓊脂培養(yǎng)基。

1.4 鹽酸-胃蛋白液胃蛋白酶按1%（W/V）的濃度配制，然后用10%的稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值到2.5，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.5 抗鹽酸-胃蛋白酶試驗將12 株供試菌株分生孢子分別加入39 ℃預(yù)熱的鹽酸-胃蛋白酶溶液離心管中，混勻后置于39 ℃培養(yǎng)箱作用4 h。分別取少量溶液接種于CMA 培養(yǎng)基，置25 ℃溫箱中培養(yǎng)7 d 后，在超凈工作臺上用體視鏡觀察是否有目標(biāo)菌的生長，向生長的菌株中加入第三期幼蟲，培養(yǎng)24 h后觀察捕食器官形態(tài)結(jié)構(gòu)，以確認(rèn)并篩選目標(biāo)耐受菌株。

1.6 耐受菌株捕食器官產(chǎn)生數(shù)量比較根據(jù)“1.1”試驗的結(jié)果，比較耐受鹽酸-胃蛋白酶溶液的捕食線蟲真菌捕食器官產(chǎn)生數(shù)量的情況。將耐受菌株接種于CMA培養(yǎng)基中央，設(shè)立不接種菌株的空白對照組，在25 ℃條件下培養(yǎng)7 d后，向其中加入第三期幼蟲溶液200 μL。試驗分7組，每組3個培養(yǎng)皿，分別在5、10、15、20、25、30、35 ℃條件下培養(yǎng)，24 h 后觀察捕食器官產(chǎn)生情況：在培養(yǎng)皿中隨機取20個直徑為5 mm 的圓形區(qū)域，在體視鏡下測其捕食器官數(shù)，計算出捕食器官數(shù)/cm2。采用SPSS 11.5 統(tǒng)計軟件對不同溫度下菌株產(chǎn)生的捕食器官數(shù)進行方差分析，其中，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.7 耐受菌株捕食線蟲活性比較根據(jù)“1.1”、“1.2”試驗結(jié)果，比較最適溫度下，耐受鹽酸-胃蛋白酶溶液的捕食線蟲真菌捕食活性情況。將耐受菌株接種于CMA 培養(yǎng)基中央，每株接種3 個培養(yǎng)皿，設(shè)立不接種菌株的空白對照組，在25 ℃條件下培養(yǎng)7 d后，向其中加入第三期幼蟲溶液200 μL，在25 ℃條件下培養(yǎng)，24 h后在培養(yǎng)皿中隨機取10個直徑為5 mm的圓型區(qū)域，在體視鏡下觀察記錄真菌對線蟲幼蟲的捕食情況，按公式計算出菌株捕食線蟲活性即捕食率（%）。捕食率（P）=被捕獲的蟲體數(shù)（X）/〔X+自由活動蟲體數(shù)（Y）〕×100%。

2 結(jié)果

2.1 抗鹽酸-胃蛋白酶試驗12個供試菌株中6個菌株通過了鹽酸-胃蛋白酶處理，總通過率50.00%，其中A. oligospora，A. musiformis，D. ellipsospora，D.leptospora通過率分別為66.66%、66.66%、33.33%、33.33%。結(jié)果：從12株菌株中成功篩選到6株耐鹽酸-胃蛋白酶的捕食線蟲真菌。見表1。

2.2 耐受菌株捕食器官產(chǎn)生數(shù)量比較在5～35 ℃之間，A.oligospora、A.musiformis的 4 株耐受菌株均能產(chǎn)生不同數(shù)量的捕食器官，而D.leptospora、D.ellipsospora的2株耐受菌株在5 ℃以下或35 ℃以上不產(chǎn)生捕食器官。另外，在25 ℃條件下，各耐受菌株產(chǎn)生的捕食器官數(shù)最多，與其它溫度差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），相對而言，在25 ℃條件下，A.oligospora的Ao-HDB、Ao-DRB及D.ellipsospora的De-BMXS 產(chǎn)生的捕食器官數(shù)較A. musiformis的Am-HDB、Am-DRB 和D. leptospora的 Dl-DRB 高（P＜0.05）。結(jié)果表明，25 ℃條件下6株耐受菌株均能產(chǎn)生較多的捕食器官，其中A.oligospora的2株及D.ellipsospora的1株耐受菌產(chǎn)生捕食器官的能力相對較強。見表2。

表2 耐受菌株在不同溫度下產(chǎn)生的捕食器官數(shù)量比較

2.3 耐受菌株捕食線蟲活性比較6 株耐受菌捕食率在23.40%～77.77%之間，均顯示出一定的捕食活性。其中，A. oligospora的 Ao-HDB、Ao-DRB 及D. ellipsospora的 De-BMXS 捕食率較高，分別為77.77%、70.52%、68.81%；其次為A. musiformis的Am-HDB、Am-DRB，捕食率分別為53.84%、47.12%；最低的是D.leptospora的Dl-DRB，僅有23.40%。結(jié)果再次表明，6 株耐受菌中A. oligospora的2 株及D.ellipsospora的1株耐受菌的捕食線蟲活性相對較強。見表3。

表3 耐受菌株25 ℃條件下捕食活性比較

3 討論

在動物生防控制中，通過將捕食線蟲真菌加入飼料使之出現(xiàn)在糞便，用以捕捉糞便中的線蟲幼蟲是防治動物線蟲病理想的方法，因此用于生物防治的捕食線蟲真菌需具有一定的抗消化能力〔16〕。有研究表明大多數(shù)捕食線蟲真菌由于不能耐受瘤胃液和真胃中的鹽酸胃蛋白酶液作用，因而在實驗室進行體外抗消化篩選可快速得到耐消化的捕食線蟲真菌〔11，17〕。根據(jù)本次試驗結(jié)果，12株云南高海拔牧場牦牛糞便中的捕食線蟲真菌中有6株通過鹽酸胃蛋白酶處理，通過率50.00%。

捕食線蟲真菌在營養(yǎng)貧瘠的環(huán)境中若存在新鮮幼蟲，真菌很快就會形成捕食器官捕食幼蟲以補充營養(yǎng)來源的不足〔18〕。本實驗在5～35 ℃之間，加入幼蟲后，6 株耐受菌在20、25 ℃時產(chǎn)生的捕食器官最多，這與楊曉野等〔19〕已有研究基本一致，只是A.oligospora產(chǎn)生的捕食器官數(shù)略高于D.ellipsospora，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與菌株來源于高海拔牧場有一定的關(guān)系。根據(jù)產(chǎn)生捕食器官的數(shù)量，我們從6株耐受菌株中初步篩選出Ao-HDB、Ao-DRB 及De-BMXS 3 株產(chǎn)生捕食器官的能力相對較強的菌株。

由于捕食線蟲真菌主要作用于寄生線蟲在環(huán)境中的自由生活階段。因此，對真菌體外捕食線蟲效力的測定能為其防治線蟲效果提供重要參考依據(jù)〔15〕。孟慶玲等〔18〕對A.oligospora新疆分離株的捕食活性進行研究，結(jié)果表明菌株在CMA培養(yǎng)基上捕食率達到92.8%～97.6%。楊曉野等〔19〕對A. oligospora和D.ellipsospora的捕食效力進行研究，結(jié)果表明菌株在CMA 培養(yǎng)基上捕食率達到78.2%和80.1%。本研究中3 株產(chǎn)生捕食器官數(shù)量較多的耐受菌Ao-HDB、Ao-DRB及De-BMXS捕食率分別為77.77%、70.52%、68.81%，也表現(xiàn)出較強的捕食線蟲活性。

同一捕食線蟲真菌在不同的地區(qū)可能存在著菌株的差異，云南高海拔牧場獨特的地理環(huán)境和氣候條件使得捕食線蟲性真菌云南分離到的菌株生物學(xué)特性和捕食能力與其它地區(qū)分離到的菌株有所不同，因此篩選出本地自然環(huán)境條件下適應(yīng)本地氣候、生態(tài)環(huán)境和動物飼養(yǎng)管理條件的菌株尤為重要。本研究篩選到了3株能耐受鹽酸胃蛋白酶液作用且具有較強捕食活性的捕食線蟲真菌，可為研制適合于云南高原牧場牦牛及其它動物線蟲病高效生物防治菌劑提供菌種資源。但該3株捕食線蟲真菌是在實驗室條件下篩選到的，是否能正常通過動物體內(nèi)的消化液，并在外界保持有效地捕食活力還有待進一步研究。

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