蘆文奇, 周海波, 陳 嬌, 徐繼林, 周成旭, 馬 斌, 嚴(yán)小軍

(寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室， 寧波 315211)

微藻是海洋初級生產(chǎn)力的主要組成部分，多種海洋生物體內(nèi)的脂肪酸都是通過攝食海洋微藻而獲取[1]。如沿海灘涂貝類的主要餌料來源是某些特定的海洋微藻，這些微藻細(xì)胞中脂肪酸的含量及種類直接影響著灘涂貝類的生長發(fā)育[2-3]。目前灘涂貝類人工育苗中沿用的餌料微藻均來自國內(nèi)屈指可數(shù)的幾個微藻種質(zhì)庫，長期的擴(kuò)繁使得實際生產(chǎn)中繁殖能力和營養(yǎng)品質(zhì)大大降低，急需篩選出品種更多、脂肪酸適宜、適合在不同溫度條件下繁殖以及繁殖能力迅速的優(yōu)良餌料微藻品種，以滿足品種日益豐富、規(guī)模越來越大的灘涂貝類苗種培育的要求。其中，脂肪酸組成是衡量微藻餌料效果的最主要指標(biāo)[4-7]。

象山港是浙江省一重要港灣，灣內(nèi)海洋單細(xì)胞微藻豐富，為灣內(nèi)多種經(jīng)濟(jì)貝類及其他海產(chǎn)動物的生長繁殖提供了充足的餌料供應(yīng)。本研究從象山港分離出了15種微藻并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并對其脂肪酸組成進(jìn)行了檢測和分析研究，以期為海產(chǎn)動物尤其是灘涂貝類新型餌料的探索提供營養(yǎng)學(xué)方面的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 微藻樣品及培養(yǎng)

微藻藻種由寧波大學(xué)海洋生物教育部重點實驗室藻種室提供，均分離自浙江省象山港，共15株， 隸屬于5個綱，分別是：中心硅藻綱(Coscinodiscophyceae)的脆根管藻(Rhizosoleniafragilissima)/1、布氏雙尾藻(Ditylumbrightwellii)/2、中華盒形藻(Bidduphiasinensis)/3、佛氏海毛藻(Thalassiothrixfrauenfeldii)/4、威氏海鏈藻(Thalassiosiraweissflogii)/5及假微型海鏈藻(Thalassiosirapseudonana)/6；針胞藻綱(Raphidphyceae)的赤潮異彎藻(Heterosigmaakashiwo)/7；縱裂甲藻綱(Desmophyceae)的海洋原甲藻(Prorocentrummicans)/8和尖葉原甲藻(Prorocentrumtriestinum)/9；甲藻綱(Dinophyceae)的錐狀斯克里普藻(Scrippsiellatrochoidea)/10、共生甲藻(Symbodiniumsp.)/11、沃氏藻(Woloszynskiasp.)/12、米氏凱倫藻(KareniamikimotoiHasen)/13及裸甲藻(Gymnodiniumsp.)/14和顆石藻綱(Coccolithophyceae)的顆石藻(Pleurochrysissp.)/15。微藻培養(yǎng)海水經(jīng)0.45 μm醋酸纖維濾膜過濾后煮沸冷卻，培養(yǎng)液采用浙江水產(chǎn)學(xué)院三號配方(鹽度25)。藻種先在5 L的錐形瓶中自然光培養(yǎng)1周，培養(yǎng)溫度為(20±2)℃。后部分轉(zhuǎn)入光生物反應(yīng)器，在 160 μmol.m-2.s-1光強(qiáng)，(20±2)℃下培養(yǎng)1周左右，每天測定微藻密度，當(dāng)?shù)竭_(dá)穩(wěn)定期后，4000 r/min下分別對瓶中的藻和光生物反應(yīng)器中的藻離心收集，冷凍干燥，-20℃下充氮冷凍保存。

1.2 樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取3份100 mg左右的微藻干品，分別參考改進(jìn)后的Bligh-Dyer法[8]提取總脂于4 mL棕色帶密封蓋的樣品瓶中。樣品瓶使用前洗凈烘干后置于干燥器中保存，用分析天平準(zhǔn)確稱重，總脂提取后置于干燥器中12 h后用分析天平準(zhǔn)確稱重，兩者之差得到總脂準(zhǔn)確重量，結(jié)果取均值。

總脂提取后加入2 mL 5%～6%氫氧化鉀甲醇水(V/V為4∶1)溶液，充氮氣1 min，密封，60℃水浴皂化2 h, 冷卻，氯仿: 正己烷(V/V 1∶4)6 mL分3次提取，加入1 g無水硫酸鈉吸水12 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空干燥，加入100 μL過量BSTFA，密封，60℃水浴2 h，N2吹干，正己烷定容，進(jìn)行GC-MS分析。

1.3 GC-MC分析

采用QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析儀(日本SHIMADZU公司)進(jìn)行GC-MS分析[9]。GC條件：色譜柱采用30 m ×0.25 mm×0.25 m SPB-50色譜柱(美國SUPELCO公司)，進(jìn)樣口的溫度為250℃，載氣為高純氦，流速為0.81 mL/min，柱前壓73.0 kPa。起始溫度為150℃，保持3.5 min后，以20℃/ min升至200℃，保持5 min，再以5℃/ min升至280℃，保持30 min。分流進(jìn)樣，分流比為50∶1。MS條件: 用EI源分析時電子能量設(shè)為70 eV，離子源溫度為200℃，接口溫度為250℃，選擇SCAN模式，質(zhì)量掃描范圍為40～600，溶劑延遲3.5 min。用CI 電離源分析時反應(yīng)氣為甲烷。定性分析：選用C19∶0脂肪酸作為內(nèi)標(biāo)，其他組分各自相對C19: 0脂肪酸的保留時間作為定性依據(jù)。從GC-CIMS-TIC圖中各組分的質(zhì)譜，可以初步確定出各組分的分子量，再根據(jù)GC-EIMS-TIC中各組分的離子碎片質(zhì)量譜圖，通過NIST 庫并參考脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鑒定。定量分析：在50 mg左右的微藻樣品中準(zhǔn)確加入50 μg C19∶ 0 脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為定量內(nèi)標(biāo)，再用內(nèi)標(biāo)法計算各組分在樣品中的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 總脂含量

15株微藻在給定條件下培養(yǎng)14 d左右，在穩(wěn)定期后收集并冷凍干燥，通過Bligh-Dyer法提取總脂得到各樣品總脂占干重含量(表1)。表1可見，從象山港分離的15株微藻總脂含量在4.46%～19.8%之間，其中總脂含量高于10%的有9種，分別是布氏雙尾藻、佛氏海毛藻、赤潮異彎藻、海洋原甲藻、尖葉原甲藻、斯克里普藻、共生甲藻、沃氏藻和米氏凱倫藻，而脆根管藻和假微型海鏈藻含量較低，不足5%。

大型藻的總脂含量僅為干重的1%左右[10]，可見海洋微藻的總脂含量總體遠(yuǎn)高于大型藻類。微藻的總脂含量代表了藻類積累脂類的能力。有研究表明[11]，微藻總脂含量會隨著培養(yǎng)時間的增加而不斷增加，到平臺末期達(dá)到最高，所以研究不同海洋微藻間總脂含量差別需要控制在同一個培養(yǎng)時期進(jìn)行收集。

2.2 微藻的脂肪酸組成

根據(jù)氣相色譜質(zhì)譜總離子圖中各分離的離子碎片質(zhì)量圖譜通過檢索并參考脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)，從15株微藻中一共鑒定出23種脂肪酸(表2)。其中，飽和脂肪酸有10種，單不飽和脂肪酸4種，多不飽和脂肪酸9種。

表1 15種微藻脂肪酸總脂含量

2.2.1 中心硅藻綱的脂肪酸組成

從象山港新分離出的15種微藻中，隸屬于中心硅藻綱的微藻有6種。總體而言，這6種硅藻均含有高比例的C14、C16和C20系列脂肪酸，18C系列的脂肪酸含量很低，尤其含有高比例的C14∶0、C16∶0、C16∶1(n-7)脂肪酸和EPA，并含有一定含量的DHA，這些特性均符合標(biāo)準(zhǔn)的硅藻綱微藻的脂肪酸特征組成[14]。

雖然這6種中心硅藻綱微藻總體脂肪酸組成相近，但各種微藻間仍存在一定的差異。脆根管藻、布氏雙尾藻、中華盒形藻和威氏海鏈藻中含量最高的脂肪酸均為EPA，占總脂肪酸的比例均超過20%，其中中華盒形藻的EPA含量高達(dá)31.38%，另從威氏海鏈藻也檢測到超過5%的DHA，其他3種DHA的含量也在2%左右。

這6種中心硅藻綱微藻中，佛氏海毛藻跟其他幾種藻有較大區(qū)別，主要表現(xiàn)在C14∶0、C16∶1(n-7)和C18∶1(n-7)脂肪酸均比其他5種藻中對應(yīng)的脂肪酸比例要高，相反DHA和EPA的含量則要比其他5種藻要低。事實上在本文報道的所有15種微藻中，該藻所含的C14∶0、C16∶1(n-7)和C18∶1(n-7)脂肪酸占對應(yīng)微藻總脂肪酸的比例均是最高，分別高達(dá)34.27%、24.83%和6.67%。

2.2.2 針胞藻綱的脂肪酸組成

本文研究的15種象山港微藻中，只有赤潮異彎藻隸屬于針胞藻綱。赤潮異彎藻作為一種常見的海洋赤潮品種，許多研究者開展了大量關(guān)于該藻對其他海洋生物的影響研究，還未見其脂類組成特別是脂肪酸組成的研究報道。本文從該藻中共檢測出19種脂肪酸(表2)，跟中心硅藻綱明顯不同，其C14系列脂肪酸含量相對較低，而C16、 C18和 C20系列的脂肪酸含量均較高，尤其含有高組分含量的C16∶0、C18∶4(n-3)和EPA，其中EPA含量高達(dá)35.25%，在本文研究的15種微藻中含量最高。

表2 15種微藻的脂肪酸組成

2.2.3 縱裂甲藻綱的脂肪酸組成

海洋原甲藻和尖葉原甲藻這兩株隸屬于縱裂甲藻綱的微藻，也顯示出跟其他藻類明顯不同的脂肪酸組成，其C18和C22系列的脂肪酸明顯高于其他藻類，而C14和C15脂肪酸含量相對較低，C16不飽和脂肪酸也明顯較低。其中EPA的含量明顯不如前兩綱的微藻，含量較高的脂肪酸為C16∶0、C18∶4(n-3)、C18∶5(n-3)和DHA，特別是兩種高度不飽和脂肪酸C18∶5(n-3)和DHA，占總脂肪酸含量分別超過30%和16%，在所有微藻中均是最高，考慮到這2種藻的總脂含量也都超過微藻干重的15%，所以這兩種藻在餌料營養(yǎng)和人體健康營養(yǎng)開發(fā)研究方面將有著較廣泛的前景。

2.2.4 甲藻綱的脂肪酸組成

從象山港新分離出的15種微藻中，隸屬于甲藻綱的微藻有5種。從總體脂肪酸分布來看，跟縱裂甲藻綱的脂肪酸組成比較接近，主要幾個高含量組成的脂肪酸也是C16∶0、C18:4(n-3)、C18∶5(n-3)和DHA，幾乎不含有C15∶0系列脂肪酸。跟縱裂甲藻綱不同的是，其C16:0含量總體要比在縱裂甲藻綱中的含量高。另外，雖然甲藻綱和縱裂甲藻綱的C18∶4(n-3)和C18∶5(n-3)含量均較高，但縱裂甲藻綱的C18∶5(n-3)含量是C18∶4(n-3)含量的3倍左右，而在甲藻綱中相反，除了錐狀斯克里普藻外，其他藻中C18∶4(n-3) 含量均是C18∶5(n-3)含量的2～3倍。至于錐狀斯克里普藻中該現(xiàn)象為什么跟其他甲藻相反，還需在化學(xué)分類學(xué)上進(jìn)一步研究和探討。

2.2.5 顆石藻綱的脂肪酸組成

顆石藻又稱鈣板金藻、園石藻，屬于定鞭藻門、顆石藻綱、鈣質(zhì)鞭毛藻科，是一種比較特殊的藻類，能產(chǎn)生由碳酸鈣構(gòu)成的外殼(顆石粒)，死后這些碳酸鈣會沉積到海底，在海洋碳循環(huán)中扮演著重要的角色。本文從顆石藻中共檢測出13種脂肪酸，其中含有高比例的C16∶0和C18∶4(n-3)，含量跟甲藻綱中相近。另外含有一定含量C16∶1(n-7)、C18∶1(n-9)、C18∶2(n-6)、EPA和DHA，這些特性跟金藻綱的微藻脂肪酸特性非常接近[14]，不同的是，其碳數(shù)低于15的脂肪酸系列在顆石藻中沒有檢測到。

2.3 討論

本研究中的15種微藻分別隸屬于5個門綱，其中，中心硅藻綱中共有的含量相對較高的主要脂肪酸為C14∶0、C16∶0、C16∶1(n-7)和EPA，針胞藻綱的赤潮異灣藻則含有高比例的C16∶0、C18∶4(n-3)和EPA，縱裂甲藻綱和甲藻綱中共有的含量相對較高的主要脂肪酸為C16∶0、C18∶4(n-3)、C18∶5(n-3)和DHA，而隸屬于定鞭藻門顆石藻綱的顆石藻含量相對較高的主要脂肪酸分別為C16∶0和C18∶4(n-3)和DHA，各綱間脂肪酸組成各異，跟很多研究得出的各綱的主要脂肪酸種類一致[12-14]，說明微藻中的脂肪酸確實可以作為微藻化學(xué)分類的重要參考依據(jù)。

早在20世紀(jì)就有許多研究已經(jīng)表明哺乳動物的生長發(fā)育離不開其自身所不能合成的不飽和脂肪酸，而直到1972年，水產(chǎn)動物對餌料中不飽和脂肪酸的需求才得以確定[15]。脂類為水產(chǎn)動物幼體變態(tài)過程提供重要的營養(yǎng)基礎(chǔ)，如淡水魚需要亞油酸和亞麻酸等，而海水魚除了上述的脂肪酸外，還需要AA(花生四烯酸)、EPA(二十碳五烯酸)及DHA(二十二碳六烯酸)等高級不飽和脂肪酸。表2中的數(shù)據(jù)是以各種脂肪酸所占總脂含量的百分比來表示，是一個相對含量。在評價某種微藻的脂肪酸含量是否能滿足某種水產(chǎn)動物的營養(yǎng)需要時，還應(yīng)考察這種微藻的總脂含量的多少。一般認(rèn)為總含量達(dá)到10%且富含EPA 和DHA的微藻是優(yōu)質(zhì)餌料的選擇品種[16]， 如總脂含量偏低和缺乏EPA和DHA 等長鏈不飽和脂肪酸，對貝類、蝦等的餌料效果不好。微藻的總脂含量和各種脂肪酸的組成比例，是構(gòu)成微藻營養(yǎng)價值的主要限制因素之一[17]。

本文所測定的15種微藻總脂含量絕大部分接近或高于10%，所以EPA和DHA的含量可以作為是否是優(yōu)質(zhì)餌料微藻的參考指標(biāo)。15種微藻中均含EPA和DHA，只是各藻類的含量有所差別，中心硅藻綱微藻和針胞藻綱微藻EPA含量很高，而縱裂甲藻綱、甲藻綱和顆石藻的DHA含量相對較高，因此在實際生產(chǎn)中可通過餌料的組合投喂方式實現(xiàn)營養(yǎng)的均衡化，如將含有高量EPA的中心硅藻綱微藻跟含高含量DHA的甲藻綱或定鞭藻混合投喂，從而實現(xiàn)在實際生產(chǎn)過程脂肪酸的均衡供給。當(dāng)然，培養(yǎng)過程中一些甲藻可能會產(chǎn)生一定的生物毒素，從而危害到培養(yǎng)生物，所以最終一種藻能否作為生物的優(yōu)質(zhì)餌料，還需要在生產(chǎn)過程中進(jìn)行預(yù)先投喂實驗以確定其實際餌料效果。

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