丁小維

(陜西理工學院 生物科學與工程學院， 陜西 漢中 723000)

0 引 言

耐(嗜)鹽真菌是能夠在鹽濃度為0.2 mol/L以上環(huán)境中生長的真菌，主要分布在鹽湖、鹽田、海洋等高鹽環(huán)境中。目前，對耐(嗜)鹽真菌的研究主要集中在海洋環(huán)境耐(嗜)鹽真菌物種多樣性及其代謝產(chǎn)活性物質(zhì)方面[1-3]，而對植物內(nèi)生耐(嗜)鹽真菌的研究相對較少。鈕旭光等[4]從遼寧雙臺子國家自然保護區(qū)內(nèi)陸鹽堿地及潮間帶生長的翅堿蓬(Suaedasalsa)中分離到13個屬的內(nèi)生真菌。在高鹽環(huán)境中生長的耐鹽植物組織中可能蘊藏著豐富的耐鹽內(nèi)生真菌。此外，研究證實高鹽地區(qū)植物內(nèi)生真菌對宿主適應鹽逆境方面發(fā)揮重要作用[5-7]。因此，研究內(nèi)陸極端鹽湖區(qū)植物內(nèi)生耐(嗜)鹽真菌可為耐鹽植物的培育及促進鹽堿化土壤的綜合利用提供豐富的菌種資源。

花馬鹽湖屬于堿性碳酸鹽型內(nèi)陸高鹽湖泊，位于陜西省榆林定邊縣城西北10 km處的鹽場堡鄉(xiāng)?；R鹽湖蘊藏著非常豐富的碳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀及氯化鈣等資源。該鹽湖區(qū)寒暑變化劇烈，年降水量小(年降水約為316.9 mm)，日照強烈，蒸發(fā)量大(年蒸發(fā)量高達2 490 mm)，干燥及輻射強烈，因此具有高鹽堿、大溫差、高寒、高熱、干燥及強輻射等極端環(huán)境特征。鹽湖區(qū)沉積物Na+濃度從46.7 g/kg到飽和Na+濃度，生長于湖岸的鹽蒿其組織中Na+含量為普通植物6倍多，該地區(qū)無疑是發(fā)掘極端耐(嗜)鹽真菌多樣性的理想?yún)^(qū)域之一。

本文利用不同含鹽培養(yǎng)基分離純化花馬鹽湖區(qū)耐鹽植物鹽蒿的耐(嗜)鹽真菌，基于形態(tài)學和ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育關系認識真菌物種多樣性，豐富我國鹽湖真菌菌種資源，為耐(嗜)鹽真菌的進一步開發(fā)利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

鹽蒿(A.halodendron)采自陜北榆林定邊縣北鹽堡鄉(xiāng)花馬鹽湖區(qū)(海拔1 301 m，緯度37°40′478N，經(jīng)度107°30′724E)。新鮮的植物材料收集于塑料袋中，置于冰盒中帶回實驗室，用于分離耐(嗜)鹽真菌。

1.1.2 分離培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：(1)改良馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(cPDA)：去皮馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO41.5 g/L，維生素B110 mg/L，瓊脂粉15 g/L，pH自然；(2)麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(MEA)：麥芽提取物20 g/L，蛋白胨1 g/L，葡萄糖15 g/L，瓊脂15 g/L，pH 6；(3)酵母膏葡萄糖蛋白胨(YPD)：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉15 g/L，pH自然。在上述3種分離培養(yǎng)基中分別添加濃度為2.5%，5%，10%和15%的NaCl。

1.1.3 主要儀器和設備

主要儀器設備：光學顯微鏡(E600型，日本尼康公司)，熒光倒置顯微成像系統(tǒng)(奧林巴斯IX71/IX81)，冷凍超速離心機(Beckman)，PCR擴增儀(Bio-Rad)，電泳儀(Bio-Rad)，紫外凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad)及DNA測序儀(ABI PRISM 377)等。

1.2 方法

1.2.1 耐(嗜)鹽真菌的分離純化

將鹽蒿莖、葉組織置于自來水下沖洗4～5 h后，在無菌條件下依次用有效氯含量為4.5%～5%的次氯酸鈉(含0.01% Tween 80)處理3 min，用75%乙醇處理15 s，最后用無菌水清洗6次。將表面消毒徹底的植物材料切成0.5 cm2小塊，并置于分離培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)1～3 w，挑取菌絲接入含5% NaCl的YPD斜面純化培養(yǎng)，純化斜面于4 ℃保藏備用。

1.2.2 耐(嗜)鹽真菌的鑒定

采用形態(tài)學并結合ITS系統(tǒng)發(fā)育分析對內(nèi)生真菌進行鑒定。菌落培養(yǎng)特征、菌絲、產(chǎn)孢結構及孢子特征參照魏景超主編的《真菌鑒定手冊》進行鑒定[8]。采用CTAB法[9]提取鹽蒿內(nèi)生真菌基因組DNA。PCR反應體系(25 μL)：超純無菌水9 μL，2×PCR Mix 11 μL，10 μmol/L的ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS2(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)各2 μL，基因組DNA約50 ng；PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃ 變性1 min，55 ℃退火40 s，72 ℃ 擴增1 min，35個循環(huán)；72 ℃再保持10 min。PCR產(chǎn)物由上海生工生物技術服務有限公司進行測序。序列提交GenBank，并下載相似性高的數(shù)據(jù)，用Clustal-X[10]軟件對所得序列文件進行比對分析，通過Mega 4.0軟件構建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹[11]。

2 結果與分析

2.1 耐(嗜)鹽真菌的分離

利用cPDA、YPG及MEA培養(yǎng)基分離鹽蒿內(nèi)生真菌，從表面消毒的莖、葉組織塊中共分離到1 215株真菌，以YPG上獲得的內(nèi)生真菌菌株數(shù)最多，占35.5%，而在cPDA和MEA上分離到的菌株數(shù)較YPG的少。培養(yǎng)基不同鹽濃度對內(nèi)生真菌分離研究表明，以含鹽濃度為15%的NaCl培養(yǎng)基上出菌數(shù)最多(404株)，含5%NaCl的培養(yǎng)基次之(340株)，分別占其出菌總數(shù)的33.3%和28%。

2.2 耐(嗜)鹽真菌的鑒定

2.2.1 耐(嗜)鹽真菌的形態(tài)學

形態(tài)學研究表明，不同形態(tài)種的菌落特征正反面形態(tài)及顏色差異很大(圖1，表1)，如AH-1菌落較圓整平鋪，正面粉紅色，反面內(nèi)側淺灰黑色，外側粉紅色，菌絲較粗壯、發(fā)達，分枝有隔(圖1A,C)；AH-18菌落正面乳白色菌絲上有土黃色孢子分生孢子頭，反面黃色，菌絲分枝有隔，分生孢子梗上產(chǎn)生球形孢子，大小2.0 μm×2.0 μm(圖1B,D)；AH-35菌落正面黃綠色，反面黃褐色，分生孢子球形或近球形，大小2.5 μm×2.5 μm，(2.0～2.5)μm×(2.5～4.75)μm?；诰浜惋@微形態(tài)特征，從鹽蒿中獲得的內(nèi)生真菌屬于9個不同的形態(tài)種，以AH-1為優(yōu)勢種，其分離頻率為78.8%，其余菌株分離頻率在0.09%～2.1%之間(表1)。

圖1 鹽蒿部分耐(嗜)鹽真菌菌落及顯微形態(tài)特征

菌株編號分離頻率/%形態(tài)學特征(菌絲、孢子大小/μm)ITS/%GenBank中最相似種及其登錄號分類地位AH-178.8菌落較圓整,正面粉紅色,反面產(chǎn)脂溶性黑色素;菌絲(5.0～8.75)粗壯、發(fā)達,分枝有隔,且局部膨大;菌絲內(nèi)生孢子呈圓形,大小(2.25～2.5)×(2.25～2.5)99/97Pleosporales sp.HQ914837Leptosphaeria sp.AH-20.2菌落圓整,正面內(nèi)側淺灰色,外側青綠色,反面淺黃色;菌絲分枝有隔;產(chǎn)生帚狀枝,分生孢子呈球形99Penicillium chrysogenum,JQ015265PenicilliumchrysogenumAH-40.7菌落正面黃綠色,反面黃褐色;分生孢子球形或近球形99Trichoderma longibrachiatum,HQ882796Trichoderma sp.AH-180.09菌落正面乳白色菌絲上有土黃色孢子分生孢子頭,反面黃色;菌絲分枝有隔,分生孢子梗上產(chǎn)生球形孢子,大小2.0×2.0100Aspergillus westerdijkiae,JN793950Aspergillus westerdijkiaeAH-200.09菌落較圓整平鋪,正面粉紅色,反面內(nèi)側淺灰黑色,外側粉紅色;菌絲較粗壯、發(fā)達,分枝有隔;未見產(chǎn)孢結構100Alternaria tenuissima,JQ417902Alternaria sp.AH-222.1菌落呈褐色絨狀,菌絲分枝有隔;分生孢子榴彈形,有縱橫隔100Alternaria tenuissima,JQ417902Alternaria tenuissimaAH-290.09菌落呈灰褐色絨狀,菌絲分枝有隔;分生孢子榴彈形,有3～5個縱橫隔,孢子大小(10～15)×(30～36)100Alternaria alternata,JQ070079Alternaria alternataAH-340.2菌落正反面淺粉色,棉絮狀;菌絲有隔分枝;未見分生孢子99Fusarium chlamydosporum,HQ671187Fusarium sp.AH-350.09菌落正面黃綠色,反面黃褐色;分生孢子球形或近球形,大小2.5×2.5,(2.0～2.5)×(2.5～4.75)99/100Trichoderma longibrachiatum,JQ653055Trichoderma longibrachiatum

2.2.2 ITS的系統(tǒng)發(fā)育分析

鹽蒿內(nèi)生真菌ITS的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示，8個代表菌株(AH-2，AH-4，AH-18，AH-20，AH-22，AH-29，AH-34及AH-35)的ITS序列同GenBank數(shù)據(jù)庫中序列相似性≥99%，聚于系統(tǒng)發(fā)育樹分枝上的步長值在74%～100%之間。結合形態(tài)學特征，上述菌株屬于Penicillium、Trichoderma、Aspergillus、Alternaria及Fusarium，被鑒定為Penicilliumchrysogenum、Aspergilluswesterdijkiae、Alternariatenuissima和Trichodermalongibrachiatum等。菌株AH-1，AH-32，AH-58，AH-64和AH-77同GenBank數(shù)據(jù)庫中格孢菌目(Pleosporales)一真菌的ITS序列相似性為97%，上述菌株內(nèi)聚于一個分枝上，步長值分別為99%?；谛螒B(tài)學特征，上述5個菌株為Leptosphaeria屬的一潛在新物種。Leptosphaeria是花馬鹽湖鹽蒿內(nèi)生真菌的優(yōu)勢屬，其次為Alternaria，分別占78.8%和2.28%。研究結果表明，陜北花馬鹽湖堿蓬中蘊藏著較豐富的耐(嗜)鹽真菌。上述真菌的ITS序列提交GenBank登錄號為：KC460798，KC460799，KC460801，KC460814，KC460816，KC460818，KC460825，KC460828，KC460830，KC460831，KC460858和KC460871。

圖2 鹽蒿內(nèi)生真菌ITS鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹分析

3 討 論

研究了通過含鹽濃度不同的cPDA、MEA及YPG培養(yǎng)基分離鹽蒿內(nèi)生耐(嗜)真菌并研究物種多樣性。從鹽蒿莖、葉組織中共分離到1 215株真菌，在YPG上獲得的內(nèi)生菌株數(shù)最多，以含NaCl濃度為15%的培養(yǎng)基出菌率最高。楊麗源等[12]分離耐(嗜)鹽真菌時發(fā)現(xiàn)，鹽礦水樣中的真菌在以5%NaCl的YPG培養(yǎng)基上出菌數(shù)最多，某些固體樣則以含5%或15%的NaCl培養(yǎng)基為最佳。由于樣品類型差異，為獲得鹽蒿中多樣的耐(嗜)鹽真菌，分離培養(yǎng)基的鹽濃度需要多樣化。

近年來，形態(tài)學和ITS序列分析被廣泛應用于真菌物種多樣性研究[13-15]。由于ITS序列長度合適，具有較高的種間變異和低種內(nèi)變異及其在GenBank，EMBL/ENA及DDBJ等國際數(shù)據(jù)庫中有大量參考序列，被認為是真菌鑒定的理想分子標簽[16-17]。本研究從花馬鹽湖鹽蒿中獲得6個真菌屬，Leptosphaeria為優(yōu)勢屬，獲得9個形態(tài)種如P.chrysogenum、A.westerdijkiae、Al.tenuissima和T.longibrachiatum等。鈕旭光等[4]從翅堿蓬根、莖及葉組織中獲得49株的內(nèi)生真菌，以Glomerella、Alternaria、Colletotrichum和Cladosporium為優(yōu)勢菌屬。雖然不同生境中的鹽蒿內(nèi)生真菌群落豐富度存在一定相似性，但在某些種屬分布存在差異性，這可能由于某些內(nèi)生真菌具有宿主特異性，且其分布受宿主所生長的環(huán)境影響。本研究探討鹽湖鹽蒿內(nèi)生耐(嗜)鹽真菌物種多樣性，將為耐(嗜)鹽真菌的開發(fā)利用提供菌種資源。

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