丁傳波，趙 婷，董 嶺，陳大勇，李慧萍,高 暢，李 偉，鄭毅男，劉文叢

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

山荊子[Malusbaccata(Linn.)Borkh.]，別名山丁子、林荊子、山定子等，是薔薇科(Rosaceae) 蘋果屬(Malus)多年生木本植物，主要分布于我國(guó)東北、華北及西南等地，朝鮮及俄羅斯西伯利亞地區(qū)也有分布[1]。目前，針對(duì)山荊子的研究主要集中在其綠化觀賞及抗旱作用等方面[2-3]，對(duì)于其化學(xué)成分的研究少有報(bào)道。李偉[4]研究表明，山荊子花和葉中的揮發(fā)油包括萜類、酯類和烯烴類化合物等，主要成分是法呢烯。山荊子葉中主要活性成分是黃酮類和多酚類化合物，其中根皮苷是其藥理活性成分之一[5-6]。根皮苷是一種廣泛分布于蘋果果實(shí)、樹(shù)皮和葉以及多穗柯甜茶嫩葉中的多酚類化合物，具有抗氧化[7]、調(diào)節(jié)血糖[8]、清除自由基[9-10]等多種藥理活性。目前，對(duì)于山荊子葉中根皮苷的研究?jī)H見(jiàn)少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道[6]，莖皮及果中的根皮苷含量尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)測(cè)定了同時(shí)期山荊子鮮葉、莖皮和果實(shí)中根皮苷的含量及其陰干葉和果實(shí)中的黃酮含量，并比較了山荊子陰干葉和果實(shí)乙醇提取物的抗氧化活性，以期為山荊子的品質(zhì)評(píng)價(jià)及開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料 山荊子鮮葉、青果及莖皮均于06-02在同株采收，于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)不同的地點(diǎn)采取3批樣品，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院鄭毅男教授鑒定為薔薇科(Rosaceae) 蘋果屬(Malus)山荊子。

1.1.2 儀器與試劑 LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津，SPD-20A紫外檢測(cè)器)，超聲波清洗器(KQ-250DB，昆山超聲儀器有限公司)，BP211D電子天平(德國(guó)Sartorious公司)，SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)，UV-2450紫外分光光度計(jì)(日本SHI-MADZU公司)等。根皮苷對(duì)照品(批號(hào)：K111228)購(gòu)于西安開(kāi)來(lái)生物工程有限公司，VC、2,2′氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)購(gòu)于Sigma公司，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、亞油酸購(gòu)于西亞試劑公司，蘆丁對(duì)照品純度為98.6%(實(shí)驗(yàn)室自制)，乙腈(色譜純)購(gòu)于美國(guó)Fisher公司，純水為杭州娃哈哈有限公司生產(chǎn)。其余試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 方 法

1.2.1 山荊子鮮葉、莖皮、果實(shí)中根皮苷含量的測(cè)定 (1)根皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。精密稱取根皮苷對(duì)照品10.00 mg，置于100 mL容量瓶中用甲醇溶解后定容，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即可制得質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL的根皮苷對(duì)照品溶液。

取上述制備的根皮苷對(duì)照品溶液0.20，0.40，0.60，0.80和1.00 mL，分別定容到1 mL離心管中，搖勻后進(jìn)行HPLC檢測(cè)。用外標(biāo)法計(jì)算峰面積，以質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程，用于測(cè)定山荊子鮮葉、莖皮、果實(shí)中的根皮苷含量。

(2) 山荊子鮮葉、莖皮、果實(shí)中根皮苷含量的測(cè)定。精密稱取新鮮的山荊子葉1.006 0 g，莖皮 1.002 5 g，青果0.995 5 g，剪碎后各自放入規(guī)格相同的250 mL錐形瓶中，分別加入50 mL甲醇， 于40 ℃在40 Hz、250 W超聲波作用條件下提取30 min，提取2次，合并2次提取液，過(guò)濾后定容至100 mL容量瓶中，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得山荊子鮮葉、莖皮和果實(shí)的甲醇提取物。對(duì)樣品進(jìn)行HPLC檢測(cè)，以甲醇為對(duì)照，計(jì)算根皮苷含量。

(3) HPLC條件。色譜柱：大連依利特HypersilODS2(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：乙腈-水(V(乙腈)∶V(水)=25∶75)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：285 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.2 陰干山荊子葉、果實(shí)中黃酮含量的測(cè)定 (1)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。精確稱取蘆丁對(duì)照品(105 ℃干燥至恒定質(zhì)量)10.00 mg于100 mL容量瓶中，加60.00 mL體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶解之后再定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL的蘆丁溶液。將蘆丁溶液用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇配制成質(zhì)量濃度分別為0，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

準(zhǔn)確吸取不同質(zhì)量濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL，置于10 mL具塞試管中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaNO2溶液0.30 mL，搖勻，放置6 min后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%Al(NO3)3溶液0.30 mL，搖勻，放置6 min 后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%NaOH溶液4.00 mL，搖勻，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇定容，15 min后于510 nm下測(cè)定吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X軸)、吸光度為縱坐標(biāo)(Y軸)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程，用于測(cè)定陰干的山荊子葉和果實(shí)中的黃酮含量。

(2) 陰干山荊子葉、果實(shí)中黃酮含量的測(cè)定。分別稱取70 g陰干后的山荊子葉和果，粉碎，按料(g)液(mL)比1∶25分別加入體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇， 于40 ℃在40 Hz、250 W超聲波作用條件下提取30 min，提取3次，合并3次提取液。減壓濃縮至浸膏狀，冷凍干燥即得山荊子葉和果實(shí)乙醇提取物。測(cè)定樣品在510 nm下的吸光度，計(jì)算黃酮含量。

1.2.3 山荊子陰干葉和果實(shí)乙醇提取物的抗氧化活性測(cè)定 抗氧化活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[11-12]的方法并略有改動(dòng)。(1) 清除DPPH自由基活性的測(cè)定。將山荊子陰干葉和果實(shí)乙醇提取物及VC(陽(yáng)性對(duì)照)配制成不同質(zhì)量濃度(0.012 5，0.125，1.25，2.50和5.00 mg/mL)的溶液。將DPPH用無(wú)水乙醇配制成2×10-4mol/L的溶液。取2.00 mL樣品溶液，加入7.50 mL DPPH溶液，振蕩，搖勻，室溫下反應(yīng)1 h，在517 nm下測(cè)定其吸光度，以體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇為空白對(duì)照。自由基清除率=(As-Ai)/As×100%。式中：As表示空白對(duì)照在517 nm的吸光度，Ai表示樣品在517 nm的吸光度。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值作圖。

(2) 清除ABTS自由基活性的測(cè)定。 用去離子水配制7 mmol/L的ABTS溶液及2.45 mmol/L的過(guò)硫酸鉀溶液。取過(guò)硫酸鉀溶液5.00 mL，加入到15.00 mL ABTS溶液中，在室溫下置于黑暗處反應(yīng)16 h，形成ABTS 自由基儲(chǔ)備液。用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇對(duì)ABTS自由基儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋，使其在734 nm下的吸光度為0.70±0.05，備用。準(zhǔn)確吸取0.80 mL不同質(zhì)量濃度(0.019，0.19，1.90，3.85，7.70 mg/mL)的樣品溶液及BHT溶液(陽(yáng)性對(duì)照)，加入7 mL 稀釋的ABTS液，振蕩混勻，在室溫下反應(yīng)30 min，于734 nm下測(cè)定其吸光度，以體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇為空白對(duì)照。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值作圖。

ABTS自由基清除率=(A2-A1)/A2×100%。

式中：A1為樣品在734 nm下的吸光度，A2為空白對(duì)照在734 nm下的吸光度。

(3)還原力測(cè)定。將山荊子陰干葉、果實(shí)乙醇提取物以及陽(yáng)性對(duì)照BHT配制成不同質(zhì)量濃度的溶液(0.019，0.19，1.90，3.85，7.70 mg/mL)。取各質(zhì)量濃度的溶液0.20 mL，加入2.50 mL的磷酸鹽緩沖液(0.20 mol/L，pH 6.6)和2.50 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的鐵氰化鉀，劇烈振蕩，混勻后50 ℃下水浴20 min。然后向體系中加入2.50 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸?；靹蚝笤? 200 r/min下離心10 min，取上清液2.00 mL于10 mL試管中，加入2.50 mL蒸餾水和0.50 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.10%的三氯化鐵，10 min后于700 nm下測(cè)定其吸光度。吸光度越高表明還原力越強(qiáng)。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 山荊子中鮮葉、莖皮、果實(shí)中根皮苷含量的測(cè)定

經(jīng)分析，根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品峰面積(Y)與其質(zhì)量濃度(X)的回歸方程為：Y=2.000×105X+1.874 6×104，R2=0.996 2(n=5)，在20.00～100.00 μg/mL范圍內(nèi)根皮苷質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

山荊子中鮮葉、莖皮、果實(shí)樣品的HPLC結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可以看出，在本試驗(yàn)的HPLC條件下，山荊子鮮葉、莖皮和果實(shí)中的根皮苷HPLC峰能與其他物質(zhì)的HPLC峰完全分開(kāi)，說(shuō)明本試驗(yàn)設(shè)置的條件，適用于山荊子鮮葉、莖皮和果實(shí)中根皮苷的含量測(cè)定。經(jīng)測(cè)算，山荊子鮮葉、莖皮和果實(shí)中根皮苷的含量分別為(12.00±3.60)，(21.60±6.10)和(1.18±0.15) mg/g?？梢?jiàn)根皮苷在莖皮中的含量最高，其次是葉，在果實(shí)中含量最低，其莖皮中根皮苷的含量是葉的1.80倍，是果實(shí)的17倍。

2.2 山荊子陰干葉和果實(shí)中黃酮含量的測(cè)定

蘆丁質(zhì)量濃度(X)與510 nm下吸光度(Y)的回歸方程為：Y=12.993X-6×10-4，R2=0.998 6。在0～0.05 mg/mL內(nèi)，蘆丁的質(zhì)量濃度與其吸光度呈良好的線性關(guān)系。

經(jīng)測(cè)算，山荊子陰干葉中黃酮含量((4.78±0.62) mg/g)約是果實(shí)((0.68±0.04) mg/g)中的7倍。

2.3 陰干山荊子葉和果實(shí)乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除活性

DPPH是一種在常溫下很穩(wěn)定的自由基，因此常被用來(lái)評(píng)價(jià)化合物的抗氧化活性。從圖2可以看出，山荊子陰干葉和果實(shí)乙醇提取物對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除效果，當(dāng)山荊子葉和果實(shí)乙醇提取物的質(zhì)量濃度為0.012 5 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除率分別為57.50%和14.50%，顯然山荊子葉乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的半數(shù)清除率(IC50)<0.012 5 mg/mL，較果實(shí)乙醇提取物清除DPPH自由基的能力強(qiáng)。在相同的質(zhì)量濃度(0.012 5 mg/mL)下，天然抗氧化劑VC對(duì)DPPH自由基的清除率為86.70%。隨著質(zhì)量濃度的增加，山荊子陰干葉和果實(shí)乙醇提取物樣品對(duì)DPPH自由基的清除率逐漸增大，而VC的清除率變化不大。各樣品清除DPPH自由基的能力從小到大依次為：山荊子果實(shí)乙醇提取物<山荊子葉乙醇提取物

2.4 陰干山荊子葉和果實(shí)乙醇提取物對(duì)ABTS自由基的清除活性

圖3顯示，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，陰干山荊子葉和果實(shí)乙醇提取物及BHT對(duì)ABTS自由基的清除率不斷增大，當(dāng)BHT的質(zhì)量濃度增加到0.19 mg/mL時(shí)，其對(duì)ABTS自由基的清除率為92.4%，之后趨于穩(wěn)定，表明ABTS自由基基本被清除。而在此質(zhì)量濃度下，山荊子陰干葉和果實(shí)乙醇提取物對(duì)ABTS自由基的清除率分別為66.5%和47.0%，可見(jiàn)葉乙醇提取物的IC50<0.19 mg/mL，果實(shí)乙醇提取物的IC50接近于0.19 mg/mL。表明山荊子葉和果實(shí)乙醇提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

圖2 山荊子陰干葉和果實(shí)乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除活性

圖3 山荊子陰干葉和果實(shí)乙醇提取物對(duì)ABTS自由基的清除活性

2.5 陰干山荊子葉和果實(shí)乙醇提取物的還原力

抗氧化劑能夠通過(guò)自身的還原作用給出電子，使自由基變成穩(wěn)定的分子，從而失去活性,還原力越大，其抗氧化活性就越強(qiáng)，因此可通過(guò)還原力的大小來(lái)判斷物質(zhì)抗氧化活性的強(qiáng)弱。由圖4可知，當(dāng)樣品和BHT的質(zhì)量濃度為0.019 mg/mL時(shí)， BHT、山荊子陰干葉和果實(shí)乙醇提取物在700 nm下的吸光度分別為0.076，0.061和0.079，但隨著質(zhì)量濃度的不斷增大，三者的還原力差距逐漸加大。在0.019～7.7 mg/mL的質(zhì)量濃度內(nèi)，山荊子陰干葉和果實(shí)的還原力與其質(zhì)量濃度呈現(xiàn)量效關(guān)系，即隨著質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，且山荊子葉的還原力較果實(shí)強(qiáng)，但均較BHT弱。

圖4 山荊子陰干葉和果實(shí)乙醇提取物的還原力比較

3 討 論

本研究采用超聲波輔助提取山荊子莖皮、葉和果實(shí)中的根皮苷，這種方法較傳統(tǒng)的熱回流提取操作簡(jiǎn)單、提取時(shí)間短；采用乙腈-水為流動(dòng)相的方法與文獻(xiàn)[13]有所不同，但能夠較好地將根皮苷分離出來(lái)，且峰形較好。

黃酮是一類復(fù)雜的化合物，具有多種藥理活性，可以提高抗氧化酶水平、清除自由基、保護(hù)機(jī)體因自由基過(guò)多而產(chǎn)生的損傷[14-15]。山荊子葉和果實(shí)中含有較多的黃酮類化合物，但對(duì)于其黃酮含量及活性研究較少，僅有少數(shù)研究報(bào)道了其抗肥胖活性[16]。本試驗(yàn)通過(guò)亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉方法測(cè)定了山荊子葉和果實(shí)中的黃酮含量，并就山荊子葉和果實(shí)乙醇提取物對(duì)DPPH、ABTS自由基的清除能力和還原能力進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示，山荊子葉和果實(shí)乙醇提取物均具有較強(qiáng)的抗氧化活性和還原力，這可能與其含有較多的黃酮類物質(zhì)有關(guān)，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示，山荊子中根皮苷含量莖皮>葉>果實(shí)，這與李榮濤等[17]的研究結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

本研究采用超聲波輔助提取結(jié)合HPLC法，測(cè)出山荊子鮮莖皮、葉和果實(shí)中的根皮苷含量分別為(21.60±6.10)，(12.00±3.60)，(1.18±0.15) mg/g；本研究還測(cè)定了陰干山荊子葉和果實(shí)中的黃酮含量，結(jié)果表明，陰干的山荊子葉乙醇提取物中黃酮含量約為果實(shí)的7倍。結(jié)果顯示，山荊子是一種天然的抗氧化劑，具有廣闊的開(kāi)發(fā)和利用前景。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 李育農(nóng).蘋果屬植物種質(zhì)資源研究 [M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2001:67.

Li Y N.Researches of germplasm resources ofMalusMill [M].Beijing:China Agriculture Press,2001:67.(in Chinese)

[2] 馬樹(shù)華.四種北方闊葉樹(shù)苗木對(duì)汽車尾氣污染的生理反應(yīng)與抗性評(píng)價(jià) [D].哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué),2004.

Ma S H.The physiologlcal and biochemcial response of seedings of four northern deciduous trees to automobile exhaust and tolerance evaluating [D].Harbin:Northeast Forest University,2004.(in Chinese)

[3] 孫志虎，王慶成.應(yīng)用PV技術(shù)對(duì)北方4種闊葉樹(shù)抗旱性的研究 [J].林業(yè)科技,2003,39(2):33-38.

Sun Z H,Wang Q C.The drought resistance of four broad-leaved species in the North of China with PV technique [J].Scientia Silvae Sinicae,2003,39(2):33-38.(in Chinese)

[4] 李 偉.頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜法分析山荊子花和葉中的揮發(fā)性成分 [J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā).2012,24(4):490-493.

Li W.HS-SPME-GC-MS analysis of volatile constituents from the flowers and leaves ofMalusbaccata(Linn.) Borkh [J].Nat Prod Res Dev,2012,24(4):490-493.(in Chinese)

[5] 聶繼云，呂德國(guó)，李 靜，等.22 種蘋果種質(zhì)資源果實(shí)類黃酮分析 [J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科技,2010,43(21):4455-4462.

Nie J Y,Lü D G,Li J,et al.A preliminary study on the flavonoids in fruits of 22 apple germplasm resources [J].Scientia Agricultura Sinica,2010,43(21):4455-4462.(in Chinese)

[6] 李 萍.蘋果屬植物葉片類黃酮的含量及多樣性研究 [D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2010.

Li P.The study on contents and diversity of flavonoids in leaves ofMalusspecies [D].Beijing:Chinese Academy of Agricultural Sciences,2010.(in Chinese)

[7] 張澤生,胡 莎，邵 嬋,等.根皮苷對(duì)由高脂導(dǎo)致果蠅氧化損傷的保護(hù)作用 [J].食品科技,2012,37(4):195-198.

Zhang Z S,Hu S,Shao C,et al.Protective effect of phloridzin on the fat-induced oxidative damage in drosophila melanogaster [J].Food Science and Technology,2012,37(4):195-198.(in Chinese)

[8] Dudash J,Zhang X,Zeck R,et al.Glycosylated dihyd rocha lcones as potent and selective sodium glucofle co-transporter 2 (SGLT2) inhibitors [J].Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,2004,14:5121.

[9] Rezk B M,Haenen G R,Bast A,et al.The antioxidant activity of phloretin:The disclosure of a new antioxidant pharmacophore in flavonoids [J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2002,295:9-13.

[10] Vasantha Rupasinghe H P,Yasmin Afsana.Inhibition of oxidation of aqueous emulsions of omega-3 fatty acids and fish oil by phloretin and phloridzin [J].Molecules,2010,15:251-257.

[11] He J S,Huang B,Ban X Q,et al.Invitroandinvivoantioxidant activity of the ethanolic extract fromMeconopsisquintuplinervia[J].Journal of Ethnopharmacology,2012,141:104-110.

[12] Huang B,Ke H B,He J S,et al.Extracts ofHaleniaellipticaexhibit antioxidant propertiesinvitroandinvivo[J].Food and Chemical Toxicology,2011,49:185-190.

[13] 李勝華，伍賢進(jìn)，牛友芽，等.HPLC 法測(cè)定多穗柯葉中根皮苷含量 [J].食品工業(yè)科技,2009,30(8):327-331.

Li S H,Wu X J,Niu Y Y,et al.Detemintation of phloridzin inLithocarpuspolystarchRehd by HPLC method [J].Science and Technology of Food Industry,2009,30(8):327-331.(in Chinese)

[14] Tachakittirungrod S,Okonogi S,Chowwanapoonpohn S.Study on antioxidant activity of certain plants in Thailand:Mechanism of antioxidant action of guava leaf extract [J].Food Chemistry,2007,103:381-388.

[15] Terao J.Dietary flavonoids as antioxidants [J].Forum of Nutrition,2009,61:87-94.

[16] Wei X，Zhao R，Sun Y H，et al．The leaf extract of Siberian Crabapple (Malusbaccata(Linn.) Borkh) contains potential fatty acid synthase inhibitors [J].Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry,2009,24:234-340.

[17] 李榮濤，劉杰超，焦中高.RP-HPLC測(cè)定蘋果樹(shù)枝、葉中根皮苷的含量 [J].食品工業(yè)科技,2009,30(12):385-387.

Li R T，Liu J C,Jiao Z G.Determintation of phloridzin in apple tree branch and leaf by RP-HPLC [J].Science and Technology of Food Industry,2009,30(12):385-387.(in Chinese)