張麗霞，張雅君，張麗萍

(1 大慶師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 大慶 163712；2 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州510225；3 東北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130024)

藥用真菌多糖是從真菌子實(shí)體、菌絲體、發(fā)酵液中分離出來(lái)的一種多糖[1-2]，具有調(diào)節(jié)免疫[3-4]、抗腫瘤[5]、抗病毒[6]、抗衰老[7]、抗放射[8]、抗凝血[9]等多種藥理活性，是公認(rèn)的安全低毒活性物質(zhì)。大量研究證明，真菌多糖不僅能夠激活小鼠脾淋巴細(xì)胞、腹腔巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞，還能活化補(bǔ)體，促進(jìn)細(xì)胞因子的生成，對(duì)免疫系統(tǒng)具有多途徑、多層面的調(diào)節(jié)作用[10]。真菌多糖作為良好的藥物資源，已成為繼蛋白質(zhì)和核酸之后的又一科學(xué)研究熱點(diǎn)[11]。

靈芝古稱瑞草，隸屬于擔(dān)子菌亞門(mén)層菌綱非褶菌目靈芝菌科靈芝屬[12]，是我國(guó)傳統(tǒng)的補(bǔ)益中藥，具有扶正固本、延年益壽之功效[13]。目前，有關(guān)靈芝孢子粉純多糖的免疫調(diào)節(jié)作用研究還未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究以靈芝孢子粉為試驗(yàn)材料，提取靈芝水溶性粗多糖，分離純化后對(duì)其理化性質(zhì)及免疫活性進(jìn)行研究，以期為靈芝多糖的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

靈芝孢子粉購(gòu)自遼寧百發(fā)生物制品有限公司。ICR雄性小鼠，體質(zhì)量(20.0±2.0) g/只，購(gòu)于吉林大學(xué)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，自由進(jìn)食。

Sepharose CL-6B，Pharmacia Biotech公司生產(chǎn)；MTT、脂多糖(LPS)、刀豆蛋白A (ConA)，Sigma公司產(chǎn)品；中性紅，Amersco公司產(chǎn)品；RPMI1640培養(yǎng)基，Gibco公司產(chǎn)品；新生牛血清，杭州四季青公司產(chǎn)品；Mouse TNF-alpha ELISA Kit，ADI公司產(chǎn)品；iNOS測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

超低溫冰箱、二氧化碳培養(yǎng)箱，SANYO Electric Company 公司生產(chǎn)；高效液相色譜儀，日本島津蘇州公司生產(chǎn)；Varian 3400氣相色譜儀，美國(guó)Varian公司生產(chǎn)；醫(yī)用型潔凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀，Bio-RAD 公司生產(chǎn)；倒置顯微鏡，IXTO OLYMPUS公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 靈芝多糖的提取與純化 稱取靈芝孢子粉1 000 g，經(jīng)石油醚(60～90 ℃)回流脫脂后，再用體積分?jǐn)?shù)70%甲醇抽提20 h，抽濾。將殘?jiān)诱麴s水浸泡過(guò)夜，沸水煮提3次，1 h/次，離心(4 000 r/min，15 min)，合并3次煮提濾液，減壓濃縮至200 mL，加3倍體積的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇醇析過(guò)夜，離心(4 000 r/min，15 min)，常規(guī)干燥得靈芝粗多糖。

將靈芝粗多糖配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的溶液，置于-20 ℃冰箱冷凍過(guò)夜，室溫緩慢融化，高速冷凍離心(8 000 r/min，10 min，4 ℃)，重復(fù)此操作5次，直至無(wú)沉淀產(chǎn)生。采用Sevag法[14]對(duì)樣品脫蛋白，重復(fù)多次，至無(wú)游離蛋白為止。通過(guò)Sepharose CL-6B 柱層析( 1.5 cm×100 cm) 對(duì)樣品進(jìn)行分析，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9% 氯化鈉溶液洗脫，自動(dòng)部分收集器收集，酚-硫酸法[15]檢測(cè)糖的分布。

采用Separose CL-6B 柱(2.5 cm×90 cm)層析制備靈芝多糖，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，收集糖峰洗脫液，依次進(jìn)行流水逆向透析(24 h)和蒸餾水透析(24 h，每4 h換蒸餾水1次)脫鹽，然后水浴(80 ℃)濃縮，凍干過(guò)夜，即得純化的靈芝多糖(GLP)。

1.2.2 GLP相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定及組成分析 精確稱取3 mg GLP溶于1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.7% 硫酸鈉溶液中，超聲波處理5 min，過(guò)濾后進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析(洗脫液流速0.6 mL/min)。采用氣相色譜法(G.C.)[16]測(cè)定GLP糖組成。

1.2.3 GLP的免疫活性 (1)GLP對(duì)脾淋巴細(xì)胞體外增殖的影響。參考文獻(xiàn)[17]制備小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液。將脾淋巴細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，設(shè)空白對(duì)照(CK)孔、ConA(5 μg/mL)對(duì)照孔、LPS(10 μg/mL)對(duì)照孔、待測(cè)糖液(質(zhì)量濃度為50，100，200和400 μg/mL)孔、待測(cè)糖液(質(zhì)量濃度為50，100，200和400 μg/mL)+5 μg/mL ConA 50 μL孔和待測(cè)糖液(質(zhì)量濃度為50，100，200和400 μg/mL)+10 μg/mL LPS 50 μL孔，每孔總體積為200 μL，混勻后放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入MTT液(5 mg/mL)20 μL，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)每孔棄去100 μL上清，加入150 μL二甲基亞砜，用酶標(biāo)儀在570 nm處檢測(cè)其吸光度(OD570)，每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。

(2)GLP對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。參考文獻(xiàn)[17]制備小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。將純化后的腹腔巨噬細(xì)胞加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，同時(shí)加入質(zhì)量濃度為50，100，200和400 μg/mL待測(cè)糖液(200 μL/孔)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照、LPS(20 μg/mL)陽(yáng)性對(duì)照，培養(yǎng)24 h后吸去上清，每孔加入100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.075% 的中性紅溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，用PBS(pH7.4)洗去剩余的中性紅后，加入100 μL的細(xì)胞裂解液(V(乙醇)∶V(乙酸)=1∶1)，24 h后用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)550 nm處檢測(cè)其吸光度(OD550)。

(3)GLP對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響。精確稱取NaNO269.0 mg，加蒸餾水溶解定容至1 L，配制成1 mmol/L NaNO2溶液備用。用移液管分別吸取1，0.9，0.8，0.7，0.6，0.5，0.4，0.3，0.2和0.1 mL NaNO2溶液于10 mL離心管中，補(bǔ)加水至10 mL。取上述各溶液100 μL，加入96孔酶標(biāo)板中，加入等體積的Griess試劑，10 min后用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)540 nm處檢測(cè)。以NaNO2濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

純化腹腔巨噬細(xì)胞，以2×106mL-1加入24孔板中，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照和LPS(20 μg/mL)陽(yáng)性對(duì)照，加入質(zhì)量濃度為50，100，200和400 μg/mL的待測(cè)糖液培養(yǎng)24 h后，吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清液(100 μL)轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)板中，并加入等體積的Griess試劑，10 min后于波長(zhǎng)540 nm處用酶標(biāo)儀檢測(cè)，根據(jù)NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算NO的產(chǎn)量。

(4)GLP對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)活性的影響。取100 μL腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液，通過(guò)比色法測(cè)iNOS的酶活力，具體操作按照iNOS試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。同時(shí)設(shè)20 μg/mL的LPS為陽(yáng)性對(duì)照組。

(5)GLP對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)腫瘤壞死因子(TNF-α)的影響。將純化的腹腔巨噬細(xì)胞以2×106mL-1加入24孔板中，加質(zhì)量濃度為50，100，200和400 μg/mL待測(cè)糖液培養(yǎng)24 h后，吸取細(xì)胞培養(yǎng)液上清100 μL，用ELISA試劑盒檢測(cè)TNF-α。同時(shí)設(shè)20 μg/mL的LPS為陽(yáng)性對(duì)照組。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示有顯著差異，P<0.01 表示有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝多糖的提取純化及其理化性質(zhì)

從1 000 g靈芝孢子粉中獲得6.6 g水溶性粗多糖，純化后得GLP，通過(guò)HPLC檢查其純度發(fā)現(xiàn)，GLP為單一狹窄對(duì)稱峰，確定其可以用于后續(xù)活性試驗(yàn)。GLP為白色粉末，易溶于水，相對(duì)分子質(zhì)量為5.1 ku，糖含量為89.4%。氣相色譜分析結(jié)果(圖1)表明，GLP的單糖組成為葡萄糖(Glc)和半乳糖(Gal)，其物質(zhì)的量比為16.8∶1.0。

圖1 靈芝多糖的氣相色譜圖

2.2 GLP對(duì)脾淋巴細(xì)胞體外增殖的影響

GLP對(duì)脾淋巴細(xì)胞的促增殖作用見(jiàn)圖2。

圖2 靈芝多糖對(duì)脾淋巴細(xì)胞體外增殖的影響

由圖2可知，50～400 μg/mL GLP單獨(dú)作用時(shí)，能不同程度地促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖，且與CK相比，差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。GLP能促進(jìn)ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞的增殖，不能促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞的增殖；與ConA對(duì)照相比，50～400 μg/mL GLP與ConA協(xié)同作用效果均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，并具有劑量依賴性。

2.3 GLP對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

將小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和不同質(zhì)量濃度的GLP(50～400 μg/mL)加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，結(jié)果(圖3)表明，GLP能夠激活腹腔巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬功能。當(dāng)GLP的質(zhì)量濃度為50～100 μg/mL時(shí)，可顯著促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能；當(dāng)其質(zhì)量濃度為200～400 μg/mL時(shí)，可極顯著促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能；GLP質(zhì)量濃度為 50～400 μg/mL時(shí)，其對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的促進(jìn)作用與LPS差異未達(dá)到顯著水平。

2.4 GLP對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞NO產(chǎn)量及iNOS活性的影響

根據(jù)Griess法，得到OD540(y)與NaNO2質(zhì)量濃度(x)的標(biāo)準(zhǔn)方程為：y=0.054 8x+0.071 7。測(cè)定樣品的OD540值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算NO的產(chǎn)量，結(jié)果(圖4)表明，GLP質(zhì)量濃度≥100 μg/mL時(shí)，能顯著或極顯著增強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的能力；當(dāng)GLP質(zhì)量濃度為400 μg/mL時(shí)，腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO量最高，接近于陽(yáng)性對(duì)照組(LPS，20 μg/mL)。

圖3 靈芝多糖對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響

由圖5可知，GLP質(zhì)量濃度≥100 μg/mL時(shí)，能顯著或極顯著增強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞分泌iNOS的活力；當(dāng)GLP質(zhì)量濃度為400 μg/mL時(shí)，腹腔巨噬細(xì)胞分泌iNOS的活力最高，但仍低于LPS(20 μg/mL)陽(yáng)性對(duì)照組。

2.5 GLP對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的影響

靈芝多糖對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的影響結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖5 靈芝多糖對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞iNOS活性的影響

腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α是機(jī)體免疫反應(yīng)和殺傷腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。GLP對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的影響結(jié)果(圖6)表明，當(dāng)GLP質(zhì)量濃度≥200 μg/mL時(shí)，腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α與CK相比極顯著增加(P<0.01)；當(dāng)GLP質(zhì)量濃度為400 μg/mL時(shí)，腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α最多，但仍低于LPS(20 μg/mL)陽(yáng)性對(duì)照組。

3 討 論

真菌多糖作為重要的生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑，對(duì)機(jī)體的先天免疫系統(tǒng)具有重要的調(diào)節(jié)作用。脾臟是淋巴細(xì)胞定居和接受抗原刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要場(chǎng)所?；罨母骨痪奘杉?xì)胞吞噬功能明顯增強(qiáng)，還能夠釋放TNF-α、NO等細(xì)胞因子。誘導(dǎo)型iNOS的合成是對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生特異性免疫的應(yīng)答反應(yīng)。大量的研究表明，真菌多糖不僅能夠激活T、B淋巴細(xì)胞、腹腔巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，還能促進(jìn)細(xì)胞因子的生成，對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)揮多方面的作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，從靈芝孢子粉中提取純化的活性物質(zhì)靈芝多糖，能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖，顯著增強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，提高其分泌iNOS的活力和NO的生產(chǎn)量；同時(shí)還能促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，這可能是靈芝多糖增強(qiáng)機(jī)體免疫力的重要機(jī)制之一。靈芝多糖的免疫活性與其單糖組成、糖苷鍵類型、分子質(zhì)量大小、分子結(jié)構(gòu)等都有密切關(guān)系，為了闡明靈芝多糖的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，還需對(duì)其構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行深入研究。

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