薛 菁， 王 楠， 孟艷秋

(沈陽化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院， 遼寧 沈陽 110142)

積雪草酸(Asiatic acid,AA)，又名亞細(xì)亞酸，為五環(huán)三萜類化合物，具有烏蘇烷型骨架，存在于龍腦香科植物龍腦香的樹脂和揮發(fā)油中，也可由傘形科植物草中的積雪草苷水解而得.近代研究表明，積雪草酸具有廣泛的藥理活性，如抗腫瘤[1-2]、抗氧化[3]、神經(jīng)保護(hù)[4]、抗抑郁[5]、保護(hù)肝臟[6]和抗炎[7]等.本文以積雪草酸(化合物1)為原料，保留五環(huán)三萜骨架，對其2位、3位、12位、23位和28位進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，設(shè)計(jì)并合成了12個積雪草酸類似物.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

化合物熔點(diǎn)在X-4數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)測定儀上測定，溫度未經(jīng)校正.紅外光譜在ThermoNicolet 470FT紅外光譜儀上測定(KBr壓片).質(zhì)譜在菲尼根hermo-finnigan LCQ equipment儀上測定.核磁共振氫譜在Bruker ARX-300型核磁共振分析儀上測定，CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo).薄層色譜采用高效色譜硅膠GF254(青島海洋化工廠生產(chǎn)).柱色譜用200～300目柱色譜硅膠(青島海洋化工廠生產(chǎn)).流動相采用石油醚(沸程在60～90 ℃)和乙酸乙酯的混合溶液.所有試劑均為分析純或化學(xué)純，部分試劑使用時根據(jù)需要進(jìn)一步純化.

1.2 化學(xué)合成

1.2.1 2-乙酰氧基-3,23-O-異亞丙基-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸 (2a)的合成

合成路線如圖1所示.將100.0 mg(0.20 mmol)化合物1和對甲基苯磺酸17.0 mg(0.20 mmol)溶解在DMF中，然后滴加2,2-二甲氧基丙烷0.5 mL(2.0 mmol),在室溫下攪拌，TLC檢測反應(yīng)，反應(yīng)完畢，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5 %的NaOH調(diào)節(jié)pH至7～8，混合物用乙酸乙酯提取，有機(jī)層用蒸餾水及飽和NaCl溶液洗滌，無水MgSO4干燥，抽濾，減壓蒸餾得白色固體(化合物2)，mp:156.4～158.2 ℃.IR(KBr):3 400，1 698，1 200 cm-1.將產(chǎn)物用THF溶解，加入少量的DMAP，滴加乙酸酐10 mmol，室溫下反應(yīng)并用TLC檢測反應(yīng)的終點(diǎn)(顯色劑:體積分?jǐn)?shù)95 %的硫酸乙醇溶液，展開劑為V(石油醚)V(乙酸乙酯)=3/1).反應(yīng)結(jié)束后，蒸干溶劑，充分水洗，過濾，濾餅洗至中性.自然晾干，得化合物(2a)96 mg，總收率:42.1 %.IR(KBr)，cm-1:2 951,2 923,1 747,1 697,1 457,1 370,1 235,1 045.ESI-MS:1 227(2M+2CH3CO)+.

a:(CH3)2C(OCH3)2,P-TsOH,DMF,rt b:Ac2O,DMAP(cat.),THF,rt c:AC2O,DMAP d:K2CO3,NBS,C4H8O2e:K2CO3,BrR,DMF f:K2CO3,NBS,C4H8O2g:K2CO3,BrR,DMF h:CH2Cl2,C2O2Cl2I:aniline,Et3N,CH2Cl2,rt j:K2CrO7/ACOH,reflux k:NHOH.HCl,pyridine,116 ℃,reflux l:BrR,Et3N,CH2Cl2,rt m:(COCl)2,Et3N,CH2Cl2,rt n:aniline,Et3N,CH2Cl2,rt o:NaOH,CH3OH,reflux p:NH2OH.HCl,CH3COONa,C5H5N q:K2CO3,BrR,DMF

圖1 目標(biāo)化合物的合成路線

Fig.1 Synthetic routes of target compounds

1.2.2 2-乙酰氧基-3,23-O-異亞丙基-烏蘇烷型-11-溴-12-烯-28-酯類化合物(2b-2c)的合成

由化合物2a經(jīng)11位溴代后和溴乙烷反應(yīng).粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=3/1，得白色粉末狀固體(化合物2b)18.2 mg，產(chǎn)率為25.7 %.mp:153.2～156.1 ℃.IR (KBr):2 923 cm-1，2 853 cm-1，1 745 cm-1，1 632 cm-1，1 457 cm-1，1 043 cm-1，602 cm-1.ESI-MS:716.8 (M+H+H2O)+.

由化合物2a經(jīng)11位溴代后再和溴代正丙烷反應(yīng).粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=3/1，得白色粉末狀固體(化合物2c)20.2 mg，產(chǎn)率為28.6 %.mp:152.2～156.9 ℃.IR (KBr):2 919 cm-1，2 850 cm-1，1 746 cm-1，1 466 cm-1，1 041 cm-1，601 cm-1.ESI-MS:744.9(M+K)+.

1.2.3 2α,3β,23-三乙酰氧基-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸 (3)的合成

在25mL茄形瓶中加入100.0 mg(0.20 mmoL)積雪草酸，加入少量4-二甲氨基吡啶(DMAP)，再加入5 mL的THF使其溶解，滴加6 mmoL乙酸酐.室溫?cái)嚢?TLC檢測反應(yīng)的終點(diǎn)(顯色劑:體積分?jǐn)?shù)95 %的硫酸乙醇溶液，展開劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=3/1).反應(yīng)結(jié)束后，蒸干溶劑，充分水洗，過濾，濾餅洗至中性.自然晾干，得產(chǎn)物108 mg，收率為86.80 %.mp:150.8～152.6 ℃.IR(KBr):2 951 cm-1,2 923 cm-1,1 747 cm-1,1 697 cm-1，1 457 cm-1，1 370 cm-1,1 235 cm-1,1 045 cm-1，ESI-MS:632.5(M+H2O)+.

1.2.4 2α,3β,23-三乙酰氧基-烏蘇烷型-11-溴-12-烯-28-羧酸 (4)的合成

在25mL茄形瓶中加入50.0 mg(0.08 mmoL)化合物3，加入6 mL的1,4二氧六環(huán)使其溶解，攪拌5 min后加入6.64 mg(0.08 mmoL)K2CO3，在光照條件下加入18.0 mg(0.1 mmol)NBS，室溫?cái)嚢? h.母液以15 mL水稀釋后，用乙酸乙酯提取(4×4 mL)，合并乙酸乙酯層，依次以1 mol/L稀鹽酸，飽和NaHCO3，飽和食鹽水洗滌，無水Na2SO4干燥，抽濾，減壓蒸餾.粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=3/1，得白色粉末狀固體(化合物4)32.3 mg，產(chǎn)率為57.68 %.IR(KBr):2 941 cm-1，2 875 cm-1，1 743 cm-1，16 23 cm-1，1 236 cm-1，1 032 cm-1.mp:140.2～142.1 ℃.ESI-MS:707.5(M+H)+.

1.2.5 N-[2α,3β,23-三乙酰氧基-烏蘇烷型-11-溴-12-烯-28-酰]-酯類化合物(4a-4c)的合成

由化合物4和溴乙烷反應(yīng).粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=7/1，得白色粉末狀固體(化合物4a)23.7 mg，產(chǎn)率為40.86 %.mp:143.2～144.1 ℃.1H-NMR(300 MHz,CDCl3):δ5.6(m,1H,H-12),δ4.1(m,2H,—COOCH2—),δ3.5～3.9(s,2H,—CH2OH),δ2.3～2.4(m,3H,—CH—),δ1.6～1.9(m,2H,—CH2—)，δ2.0～2.1(s,15H,—OAC),δ1.7(m,2H,—CH—),δ1.2～1.5(m,14H,—CH2×7),δ1.3(s,3H,CH3),δ1.25(s,9H,CH3×3),δ0.6～0.9(m,9H,CH3×3).IR(KBr):2 930 cm-1，2 873 cm-1，1 747 cm-1，1 633 cm-1，1 233 cm-1，1 042 cm-1，601 cm-1.ESI-MS:722.3(M+H)+.

由化合物4和溴代正丙烷反應(yīng).粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=7/1，得白色粉末狀固體(4b)16.2 mg，產(chǎn)率為27.93 %.mp:145.6～146.9 ℃.IR(KBr):2 975 cm-1，2 851 cm-1，1 741 cm-1，1 632 cm-1，1 460 cm-1，1 039 cm-1，642 cm-1.ESI-MS:734.2(M)+.

由化合物4和溴代異丁烷反應(yīng).粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=7/1，得白色粉末狀固體(4c)15.7 mg，產(chǎn)率為27.07 %.mp:148.2～150.1 ℃.1H-NMR(300 MHz,CDCl3):δ5.6(s,1H,H-12),δ4.0(m,2H,—COOCH2—),δ3.6～3.8(s,2H,—CH2OH),δ2.3～2.4(m,3H,—CH—),δ1.5～2.2(m,6H,—CH2CH2CH2—),δ2.0(s,15H,—OAC),δ1.7(m,2H,—CH—),δ1.2～1.4(m,14H,—CH2×7),δ1.3(s,3H,CH3),δ1.25(s,9H,CH3×3),δ0.6～0.9(m,9H,CH3×3).IR(KBr):2 929 cm-1，2 871 cm-1,1 741 cm-1,1 633 cm-1,1458 cm-1,1 034 cm-1,601 cm-1.ESI-MS:747.5(M-H)+.

1.2.6 N-[2α,3β,23-三乙酰氧基-烏蘇烷型-11-溴-12-烯-28-酰]-胺類化合物(4d)的合成

在25 mL茄形瓶中加入0.100 g(0.16 mmoL)的2,3,23-三乙酰氧基-11-溴-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸，加入3 mL二氯甲烷使其充分溶解，再緩慢滴加0.64 mmoL的草酰氯，室溫?cái)嚢?4 h.反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸干溶劑，加入3 mL環(huán)己烷，溶液呈渾濁狀態(tài)，蒸干溶劑.重復(fù)該操作3次，得相應(yīng)的三乙酰氧基-11-肟基-積雪草酸的酰氯粗品.用3 mL二氯甲烷溶解，滴加三乙胺，調(diào)節(jié)溶液的pH值為8～9，然后加入苯胺0.05 mL(0.64 mmoL).室溫?cái)嚢?TLC檢測反應(yīng)終點(diǎn).反應(yīng)結(jié)束后，蒸干溶劑，加入適量的水稀釋，2 mol/L鹽酸調(diào)溶液的pH值3～4，充分水洗.過濾，濾餅洗至中性.粗品經(jīng)柱層析分離純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=4/1，得白色粉末(化合物4d)32.5 mg，收率31.86 %.mp:137.3～139.9 ℃.IR(KBr):2 961 cm-1，1 745 cm-1，1 661 cm-1，922 cm-1，803 cm-1，744 cm-1；ESI-MS:644.1(M+H+H2O)+.

1.2.7 2α,3β,23-三乙酰氧基-烏蘇烷型-11-羰基-12-烯-28-羧酸(5)的合成

將50.0 mg (0.08 mmoL) 化合物3與75.0 mg(0.25 mmoL) K2Cr2O7加入到5 mL AcOH中攪拌回流.TLC跟蹤檢測反應(yīng)終點(diǎn).反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，加入適量H2O稀釋，用CH2Cl2萃取2～3次，合并有機(jī)相，用飽和NaHCO3溶液洗滌至體系呈弱堿性，分出有機(jī)相，再用飽和NaCl溶液洗滌有機(jī)相2次，合并有機(jī)相，無水MgSO4干燥過夜.抽濾干燥劑，減壓蒸除溶劑，得到粗品為淡綠色晶體.粗品經(jīng)硅膠柱色譜分離純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=3/1，減壓蒸干洗脫劑得到白色晶體(化合物5)32.1 mg，收率:63.86 %.IR(KBr):2 932 cm-1，1 743 cm-1，1 672 cm-1，1 456 cm-1，1 367 cm-1，1 265 cm-1，1 040 cm-1.mp:288.4～289.6 ℃.ESI-MS:650.3(M+H)+.

1.2.8 2α,3β,23-三乙酰氧基-烏蘇烷型-11-肟基-12-烯-28-羧酸 (6)的合成

將250.0 mg (0.08 mmoL) 化合物5溶于適量吡啶中，加入鹽酸羥胺6.68 mg(0.096 mmoL).115 ℃下回流1.5 h.TLC跟蹤檢測反應(yīng)終點(diǎn).反應(yīng)完畢，倒入冰水中，產(chǎn)生大量白色沉淀，抽濾，水洗濾餅，粗品經(jīng)硅膠柱色譜分離純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=3/1，干燥得白色固體(化合物6)26.8 mg，產(chǎn)率為47.54 %.mp:157.3～159.8 ℃；IR(KBr):2 924 cm-1，1 741 cm-1，1 692 cm-1，1 458 cm-1，1 387 cm-1，1 245 cm-1，1 045 cm-1.ESI-MS:644.3(M+H)+.

1.2.9 2,3,23-三乙酰氧基-烏蘇烷型-11-肟基-12-烯-28-酯類化合物(6a-6b)的合成

將350 mg(0.075 mmoL)化合物6溶解在4 mL的DMF中，加入少量的碳酸鉀，滴入溴乙烷0.023 mL(0.310 mmoL)，室溫?cái)嚢?用TLC跟蹤檢測確定反應(yīng)終點(diǎn).混合物用乙酸乙酯提取，有機(jī)層用蒸餾水及飽和NaCl溶液洗滌，無水MgSO4干燥，抽濾，減壓蒸餾得白色固體，粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=9/1，得白色粉末狀固體(化合物6a)29.5 mg，產(chǎn)率為58.57 %.mp:170.6～173.2 ℃；IR(KBr):2 931 cm-1，2 873 cm-1，1 745 cm-1，1 660 cm-1，1 455 cm-1，1 369 cm-1，1 237 cm-1，1 040 cm-1.ESI-MS:672.9(M+H)+.

由化合物6和溴代異丁酯反應(yīng).粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=7/1，得白色粉末狀固體(化合物6b)21.2 mg，產(chǎn)率為40.41 %.mp:178.2～180.1 ℃.1H-NMR(300 MHz,CDCl3):δ5.65(s,1H,H-12),δ4.05(m,2H,—COOCH2—),δ3.6～3.7(m,2H,—CH—),δ3.1(s,2H,—CH2OH),δ2.3～2.4(m,3H,—CH—),δ1.6～1.7(m,6H,—CH2CH2CH2—)，δ2.0(s,15H,—OAC),δ1.1～1.8(m,14H,—CH2×7)，δ1.3(s,3H,CH3)，δ1.2(s,9H,CH3×3),δ0.7～0.9,(m,9H,CH3×3).IR(KBr):2 923 cm-1，2 853 cm-1，1 745 cm-1，1 632 cm-1，1 457 cm-1，1 371 cm-1，1 236 cm-1，1 043 cm-1.ESI-MS:700.3(M+H)+.

1.2.10 2,3,23-三乙酰氧基-烏蘇烷型-11-肟基-12-烯-28-酰胺類化合物(6c)的合成

在25 mL茄形瓶中加入0.100 g(0.15 mmoL)化合物6，加入3 mL二氯甲烷使其充分溶解，再緩慢滴加0.64 mmoL草酰氯，室溫?cái)嚢?4 h.反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸干溶劑，加入3 mL環(huán)己烷，溶液呈渾濁狀態(tài)，蒸干溶劑.重復(fù)該操作3次，得相應(yīng)的三乙酰氧基-11-肟基-積雪草酸的酰氯粗品.用3 mL二氯甲烷溶解，滴加三乙胺，調(diào)節(jié)溶液pH值為8～9，然后加入苯胺0.05 mL(0.64 mmoL).室溫?cái)嚢?TLC檢測反應(yīng)終點(diǎn).反應(yīng)結(jié)束后，蒸干溶劑，加入適量的水稀釋，2 mol/L鹽酸調(diào)溶液pH值為3～4，充分水洗.過濾，濾餅洗至中性.粗品經(jīng)柱層析分離純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=4/1，得白色粉末(化合物6c)49 mg，收率45.16 %.mp:115.0～118.9 ℃.IR(KBr):2 961 cm-1，1 745 cm-1，1 661 cm-1，922 cm-1，803 cm-1，744 cm-1；ESI-MS (m/z):722.9(M+H)+.

1.2.11 2α,3β,23-羥基-烏蘇烷型-11-羰基-12-烯-28-羧酸 (7)的合成

將250.0 mg(0.08 mmoL)化合物5溶于甲醇/四氫呋喃(2 mL/2 mL)溶液中，加入1 mL(0.1 mol/L)氫氧化鈉溶液，40 ℃下攪拌，TLC檢測反應(yīng)終點(diǎn).反應(yīng)結(jié)束，減壓蒸出溶劑，加入水分散固體，過濾，濾餅水洗至中性.粗品經(jīng)柱層析分離純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=2/1，室溫干燥，產(chǎn)物為白色粉末狀固體(化合物7)30.2 mg，產(chǎn)率75.14 %.mp:142.3～145.6 ℃.IR(KBr):2 924 cm-1，1 741 cm-1，1 692 cm-1，1 655 cm-1，1 458 cm-1，1 245 cm-1，1 046 cm-1.

1.2.12 2α,3β,23-羥基-烏蘇烷型-11-肟基-12-烯-28-酯類化合物 (7a-7c)的合成

將150.0 mg(0.08 mmoL) 化合物7溶于適量吡啶中，加入鹽酸羥胺6.68 mg(0.096 mmol).115 ℃下回流1.5 h,TLC跟蹤檢測反應(yīng)終點(diǎn).反應(yīng)完畢，倒入冰水中，產(chǎn)生大量白色沉淀.抽濾，水洗濾餅，干燥得白色固體2α,3β,23-羥基-烏蘇烷型-11-肟基-12-烯-28-羧酸20.4 mg，產(chǎn)率為49.28 %.mp:146.3～147.8 ℃；IR(KBr):2 924 cm-1，1 741 cm-1，1 692 cm-1，1 458 cm-1，1 387 cm-1，1 245 cm-1，1 045 cm-1.由化合物2α,3β,23-羥基-烏蘇烷型-11-肟基-12-烯-28-羧酸和溴乙烷反應(yīng).粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=7/1，得白色粉末狀固體(化合物7a)19.2 mg，產(chǎn)率為44.31 %.mp:151.2～154.1 ℃.IR(KBr):2 920 cm-1，2 851 cm-1，1 725 cm-1，1 660 cm-1，1 463 cm-1，1 265 cm-1.ESI-MS(m/z):585.2(M+K+H)+.

由化合物2α,3β,23-羥基-烏蘇烷型-11-肟基-12-烯-28-羧酸和溴代正丙烷反應(yīng).粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=7/1，得白色粉末狀固體(化合物7b)18.5 mg，產(chǎn)率為41.34 %.mp:153.2～154.1 ℃.IR(KBr):2 919 cm-1,2 850 cm-1,1 727 cm-1,1 657 cm-1,1 632 cm-1,1 458 cm-1,1 241 cm-1.ESI-MS(m/z):601.5(M+H)+.

由化合物2α,3β,23-羥基-烏蘇烷型-11-肟基-12-烯-28-羧酸和溴代正戊烷反應(yīng).粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=7/1，得白色粉末狀固體(化合物7c)16.2 mg，產(chǎn)率為34.46 %.mp:133.2～140.1 ℃.1H-NMR(300 MHz,CDCl3)：δ5.63(s,1H,H-12),δ4.05(m,2H,—COOCH2—)，δ3.4～3.6(m,2H,—CH—),δ3.2(s,3H,—OH),δ2.9(s,2H,—CH2OH),δ2.3～2.4(m,3H,—CH—),δ1.5～2.2(m,6H,—CH2CH2CH2—),δ2.1(m,1H,—NOH),δ1.1～1.8(m,14H,—CH2×7),δ1.3(s,3H,CH3),δ1.25(s,9H,CH3×3),δ0.8～0.9(m,9H,CH3×3).IR(KBr):2 919 cm-1，2 850 cm-1，1 275 cm-1，1 661 cm-1，1 463 cm-1，1 270 cm-1，1 047 cm-1.ESI-MS(m/z):587.9(M)+.

1.3 初步體外細(xì)胞毒活性測試

采用MTT法，選用人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901，人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549和人成纖維肉瘤細(xì)胞株HT-1080為靶細(xì)胞，以吉非替尼和阿霉素為陽性對照物，進(jìn)行積雪草酸類似物體外細(xì)胞毒活性藥理評價.

1.3.1 MTT法檢測體外抗腫瘤活性原理

MTT法是化學(xué)物質(zhì)噻唑藍(lán)(MTT)，能被活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原，生成難溶性藍(lán)紫色結(jié)晶物甲瓚(Formazan)，沉積在細(xì)胞當(dāng)中，而死細(xì)胞無此功能.二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞的藍(lán)紫色沉積物，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測定其吸光度值，可間接反應(yīng)活細(xì)胞數(shù)量.在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶數(shù)形成量與活細(xì)胞數(shù)線性相關(guān).

1.3.2 實(shí)驗(yàn)操作步驟

1.3.2.1 埋板

將生長至對數(shù)生長期的細(xì)胞消化、離心，制成細(xì)胞懸液，吹勻并將3種細(xì)胞SGC-7901、A549、HT-1080密度分別調(diào)至2×104個/mL、2.5×104個/mL、1×104個/mL，以180 μL/孔接種到96孔板中，接種過程中不斷吹勻細(xì)胞，保證細(xì)胞密度一致，鋪板過程要迅速，保證每孔的細(xì)胞數(shù)目大致相同，將96孔板置于37 ℃、含摩爾分?jǐn)?shù)5 %的CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育24 h.

1.3.2.2 加藥

將藥物配制成以完全培養(yǎng)基為溶劑，初始質(zhì)量濃度為1 μg/L的溶液，將上述溶液稀釋成5個劑量組，藥物質(zhì)量濃度分別為500 mg·L-1，50 mg·L-1，5 mg·L-1，0.5 mg·L-1，0.05 mg·L-1.取各個劑量的藥液加入96孔板中，每孔20 μL，每劑量3個復(fù)孔.加藥后的藥物終質(zhì)量濃度為50 mg·L-1，5 mg·L-1，0.5 mg·L-1，0.05 mg·L-1，0.005 mg·L-1.加藥完畢放入培養(yǎng)箱中孵育72 h.

1.3.2.3 MTT檢測

將加藥并于培養(yǎng)箱中孵育72 h后的96孔板中培養(yǎng)基輕輕甩出，然后加入配置好的MTT溶液(5 g·L-1)，每孔20 μL，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育3 h.取出孵育3 h的96孔板，將其中的MTT溶液輕輕甩出，每孔加100 μL的DMSO，微量振蕩儀上振蕩5 min以使甲瓚完全溶解，用酶標(biāo)儀在490 nm下測光密度(OD)值，按下列公式計(jì)算藥物對腫瘤細(xì)胞體外增殖的抑制率(Inhibition Rate，IR):

2 結(jié)果與討論

2.1 化學(xué)合成

以積雪草酸為先導(dǎo)化合物，對其2位、3位、12位、23位和28位進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，設(shè)計(jì)并合成12個積雪草酸類似物.目標(biāo)產(chǎn)物在反應(yīng)過程中采用TLC監(jiān)測反應(yīng)終點(diǎn)，柱層析分離后，其結(jié)構(gòu)通過IR，MS，1H-NMR得以確證.

2.2 生物活性評價

采用四甲基偶氮唑鹽法(MTT比色法)，選用人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901，人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549和人成纖維肉瘤細(xì)胞株HT-1080為靶細(xì)胞，以吉非替尼和阿霉素為陽性對照物，進(jìn)行積雪草酸類似物體外細(xì)胞毒活性藥理評價.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1.細(xì)胞株圖見圖2、圖3.

由表1數(shù)據(jù)可知:積雪草酸衍生物對3種腫瘤細(xì)胞有一定抑制作用.化合物4b，6a，6b對SGC-7901、A549、HT-1080的抑制作用均高于AA，其中化合物6b在質(zhì)量濃度為50 mg·L-1時對SGC-7901、A549、HT-1080的抑制率分別為98.9 %，95.4 %，99.9 %，明顯優(yōu)于對照品吉非替尼(93.1 %，56.5 %，98.2 %)與ADM的抑制活性基本相同.而化合物6a在質(zhì)量濃度為50 mg·L-1時對于SGC-7901、A549、HT-1080的抑制率分別為33.8 %，30.0 %，58.5 %，具有較弱的抑制活性.化合物4b在質(zhì)量濃度為50 mg/L時對SGC-7901、A549、HT-1080的抑制率分別為90.1 %，52.4 %，98.6 %，與對照品吉非替尼(93.1 %，56.5 %，98.2 %)抑制活性相當(dāng)，抑制活性一般.化合物6a(IC50:4.323 μmol·L-1，2.63 μmol·L-1，1.077 5 μmol·L-1)對3種細(xì)胞系SGC-7901、A549、HT-1080的細(xì)胞毒性與吉非替尼(3.217 μmol·L-1,15.869 μmol·L-1，1.511 5 μmol·L-1)相當(dāng)，其中對A549的細(xì)胞毒性明顯優(yōu)于吉非替尼，對HT-1080的細(xì)胞活性略優(yōu)于吉非替尼.

表1 積雪草酸衍生物對SGC-7901、A549、HT-1080的抑制活性

圖2 未經(jīng)藥物處理的A549細(xì)胞株

圖3 用不同濃度的4b處理A549 細(xì)胞株48 h的外觀形態(tài)

3 結(jié) 論

初步的藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，積雪草酸12位成肟之后抗腫瘤活性提高，但是被溴取代后抗腫瘤活性降低.28位酯基對積雪草酸的抗腫瘤活性也有一定的影響.研究結(jié)果對積雪草酸的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步修飾具有一定的指導(dǎo)意義.

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