徐來(lái)清， 張書(shū)祥

(安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230601)

假蜜環(huán)菌 [Armillariellatabescens(Scop.ex Fr.)Sing]是層菌綱口蘑科假蜜環(huán)菌屬真菌，因菌絲體在暗處發(fā)出熒光，故稱(chēng)為亮菌。該菌具有治療肝炎、膽囊炎、腫瘤以及放療、化療引起的白細(xì)胞減少等藥效，且還具有強(qiáng)筋壯骨、疏風(fēng)活絡(luò)、明目、利肺、醒酒、益腸胃等保健功效[1-3]?，F(xiàn)代研究表明，用乙醇、乙酸乙酯提取可得到亮菌甲素、亮菌乙素、亮菌丙素，而亮菌甲素主要用于急慢性肝炎、慢性淺表性胃炎和慢性膽囊炎急性發(fā)作等疾病的對(duì)癥治療[3，4]。另?yè)?jù)報(bào)道，用水提或堿提法可提取得到亮菌雜多糖ATM3、AT-HW和AT-AC，而亮菌多糖是假蜜環(huán)菌生理生化活性的主要成分之一，具有抑制小鼠S180腫瘤的生長(zhǎng)，提高機(jī)體免疫機(jī)能的功效[5-8]。

目前, 國(guó)內(nèi)亮菌口服液或膠囊制劑多采用固體發(fā)酵工藝生產(chǎn)，以廉價(jià)易得的玉米粉、紅薯粉等原料按一定比例混合配制固體培養(yǎng)基, 滅菌接種, 然后在室內(nèi)避光培養(yǎng)2個(gè)月左右。這種生產(chǎn)方式優(yōu)點(diǎn)是發(fā)酵程度深，有利于多種藥用有效成分的表達(dá)分泌，但明顯存在的問(wèn)題是生產(chǎn)周期長(zhǎng)，污染的概率大，且一旦染菌只能全部丟掉，浪費(fèi)大。因此，固體發(fā)酵規(guī)模小、周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低的缺點(diǎn)嚴(yán)重制約了企業(yè)的產(chǎn)能和效益。

本文在相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上[9，10]，針對(duì)合肥誠(chéng)志生物制藥有限公司提供的假蜜環(huán)菌菌種，在本實(shí)驗(yàn)室前期工作的基礎(chǔ)[11]上，進(jìn)行液體發(fā)酵罐深層發(fā)酵和靜置發(fā)酵兩種發(fā)酵方式的研究，探究其取代傳統(tǒng)固體發(fā)酵方式的可行性，為亮菌口服液的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

假蜜環(huán)菌[Armillariellatabescens(Scop.ex Fr.)Sing]菌種由合肥誠(chéng)志生物制藥有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

1)試管斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

2)液體培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯去皮，200；KH2PO4，2；MgSO4·7H2O，1。

1.1.3 試劑

亮菌甲素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.1.4 主要儀器

UV-5200 紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)； SX-700壓力蒸汽滅菌鍋(TOMY)；R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI)；高效液相色譜儀(HITACHI D-2000 series)；色譜柱：Agilent TC-C18(2) (4.6 mm × 250 mm,5 μm);檢測(cè)器：L-2420； PiloFD系列中試型凍干機(jī)(SIM)，GF-1高速勻漿機(jī)(海門(mén)市麒麟醫(yī)用儀器廠)；SNB-2數(shù)字粘度計(jì)(上海精科)；BIOFLO-410型發(fā)酵罐(NBS)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 液體種子的制備[11]

試管菌種經(jīng)活化，用接種鏟挑取試管表面菌絲體于盛有無(wú)菌水的250 mL三角瓶中，勻漿機(jī)打散，按10%接種量接種入250 mL 三角瓶?jī)?nèi)，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)4 d。

1.2.2 發(fā)酵罐液體深層發(fā)酵

待三角瓶?jī)?nèi)形成菌絲球并均勻分散在培養(yǎng)基中時(shí)，將液體種子按5%接種量接種于14 L 發(fā)酵罐中。28 ℃，200 r/min，pH值5.5，通氣量1∶ 1 v/v·m，培養(yǎng)7 d，放罐。

1.2.3 靜置發(fā)酵

將液體種子按10%接種量接種于500 mL三角瓶中，先28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)4 d，然后避光靜置培養(yǎng)2個(gè)星期。用勻漿機(jī)將發(fā)酵液攪勻，準(zhǔn)確測(cè)定菌絲生物量及各活性成分含量。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 亮菌干重的測(cè)定

取發(fā)酵罐的發(fā)酵液樣品共9份，每份100 mL，4000 r/min離心20 min，去上清，沉淀用蒸餾水沖洗，重復(fù)操作2次收集沉淀，取9份中的任意3份，80℃烘干至恒重，電子天平稱(chēng)量菌絲體的干質(zhì)量。另外6份冷凍干燥制成亮菌菌粉，測(cè)定菌粉中多糖和蛋白含量。靜置發(fā)酵菌絲體生物量的測(cè)定與之相同。

1.3.2 多糖含量測(cè)定[10,12]

1)熱水浸提法提取亮菌粗多糖。發(fā)酵罐液體深層發(fā)酵法：稱(chēng)取制得的1 g菌粉，加入蒸餾水300 mL，80℃下水浴2.5 h，不斷攪動(dòng)，防止黏壁。浸提完畢后冷卻至室溫，4000 r/min離心20 min，收集上清，沉淀在相同條件下重復(fù)浸提2次，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(65℃)濃縮至原液的1/6，得亮菌粗多糖提取液。

液體靜置法：取發(fā)酵完畢后的發(fā)酵液100 mL代替1 g菌粉，其余操作與發(fā)酵罐液體深層發(fā)酵法完全相同。

2)樣品多糖含量測(cè)定。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備：精密量取0.1 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mL分別置于潔凈的具塞試管中，分別加入蒸餾水補(bǔ)充至1 mL，依次加入6%的苯酚1 mL，再迅速加入濃硫酸5 mL，振蕩混勻10 min，冷卻至室溫靜置20 min，490 nm處比色，測(cè)定吸光值。測(cè)的多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程為y= 11.41x+0.003(x為多糖濃度，y為OD值)，回歸率R2= 0.9993。

樣品多糖含量測(cè)定：向提取的多糖溶液中加入95%乙醇，使含醇量達(dá)到80%，4℃靜置過(guò)夜，4000 r/min條件下離心20 min得粗多糖，加入蒸餾水復(fù)溶,定容至1000 mL。苯酚硫酸法測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算發(fā)酵液中多糖濃度。

1.3.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定[11]

1)考馬斯亮藍(lán)G-250染液的配置：取50 mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于25 mL 95%乙醇中，待完全溶解后加入50 mL 85%磷酸，最后用蒸餾水定容至500 mL。

2)考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備：精密量取100 mg/L的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6和0.8 mL，分別置于潔凈的具塞試管中，分別加入蒸餾水補(bǔ)充至1 mL，各試管中依次加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，595 nm處比色，測(cè)定吸光值。測(cè)的考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程為y=6.9463x+0.0054(x為蛋白濃度，y為OD值)，回歸率R2=0.9997。

3)樣品中蛋白質(zhì)含量測(cè)定：稱(chēng)取1 g菌粉(菌粉用蒸餾水定容至100 mL)或100 mL發(fā)酵液，4000 r/min ，4℃離心20 min，破碎細(xì)胞，收集上清，沉淀相同條件重復(fù)浸提2次，合并濾液，定容至1000 mL，595 nm處比色，測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算發(fā)酵液中蛋白濃度。

1.3.4 亮菌甲素含量的測(cè)定[13,14]

1)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備：精密稱(chēng)取10 mg亮菌甲素標(biāo)準(zhǔn)品置500 mL容量瓶中，以流動(dòng)相為甲醇和0.1 mol/L乙酸(50∶ 50)溶解定容，超聲20 min后，用流動(dòng)相梯度稀釋成濃度為0.125、0.25、0.5、1、2和4 mg/L的系列對(duì)照品溶液。分別進(jìn)樣16 μL,柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為366 nm，測(cè)定峰面積積分值。在上述色譜條件下測(cè)定，測(cè)的亮菌甲素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程為y=112.57x+2978.8(x為亮菌甲素濃度，y為峰面積積分值)，回歸率R2=0.9997。

2)樣品中亮菌甲素含量的測(cè)定：為了進(jìn)一步的分析靜置發(fā)酵液中藥效成分亮菌甲素的含量，稱(chēng)取經(jīng)勻漿機(jī)打散的靜置發(fā)酵的發(fā)酵液100 mL，超聲15 min，4000 r/min ，4℃離心20 min，收集上清，沉淀相同條件重復(fù)浸提2次，合并濾液，定容至1000 mL，取50 mL置分液漏斗中加無(wú)水乙醇10 mL，再加50 mL無(wú)水乙醚提取，收集有機(jī)相，水相繼續(xù)用50 mL無(wú)水乙醚提取2次，合并乙醚液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸干，用流動(dòng)相溶解定容至10 mL，進(jìn)樣16 μL，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為366 nm，測(cè)定峰面積積分值。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵罐深層發(fā)酵

經(jīng)發(fā)酵罐7 d避光培養(yǎng)，測(cè)得此時(shí)的發(fā)酵液粘度為746 mPa·S(測(cè)定條件：25.0℃，1#轉(zhuǎn)子，6 r/min)，此時(shí)發(fā)酵液中菌絲呈白色纖維糊狀，發(fā)酵液呈棕黃色。發(fā)酵液菌絲干重及菌粉中多糖和蛋白含量見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵罐發(fā)酵液組分

由表1可知，通過(guò)發(fā)酵罐液體深層發(fā)酵方式所獲得的亮菌生物量平均能達(dá)到16.55 g/L，且周期短。但缺點(diǎn)是發(fā)酵液顏色不深，發(fā)酵程度低，無(wú)法像固體發(fā)酵那樣菌絲體表層分泌大量棕褐色液體，這可能是由于液體發(fā)酵環(huán)境無(wú)法為亮菌次級(jí)代謝產(chǎn)胞外棕褐色漿液創(chuàng)造適宜的環(huán)境。

2.2 靜置培養(yǎng)發(fā)酵

靜置發(fā)酵2周后，發(fā)酵液表面形成約5 mm厚的菌絲層，且菌絲分泌大量棕褐色液體，發(fā)酵液中菌索向下延伸粗壯且多分支布滿(mǎn)整個(gè)三角瓶，三角瓶中發(fā)酵液呈膠質(zhì)半固體形態(tài)。稱(chēng)取經(jīng)勻漿機(jī)打散的發(fā)酵液100 mL，4000 r/min條件下離心20 min ,沉淀80℃烘干至恒重。發(fā)酵液組分各項(xiàng)指標(biāo)見(jiàn)表2。

表 2 靜置培養(yǎng)發(fā)酵液組分

通過(guò)表2可知，發(fā)酵液中多糖含量為9.5%，蛋白質(zhì)含量為3.0%。對(duì)比表1和表2，雖然靜置發(fā)酵得到的亮菌生物量不及發(fā)酵罐液體深層發(fā)酵，但其發(fā)酵程度深，培養(yǎng)基利用率高，發(fā)酵液中多糖和蛋白含量明顯優(yōu)于液體深層發(fā)酵的發(fā)酵結(jié)果，同時(shí)也優(yōu)于傳統(tǒng)的固體發(fā)酵[11]。

為了進(jìn)一步的探究靜置發(fā)酵生產(chǎn)工藝能否取代傳統(tǒng)的亮菌固體發(fā)酵生產(chǎn)工藝，本實(shí)驗(yàn)室采用HPLC法檢測(cè)靜置發(fā)酵液中亮菌甲素的含量(見(jiàn)圖1和圖2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中亮菌甲素含量平均為3.118 mg/L。

圖 1 亮菌甲素對(duì)照品HPLC色譜圖

圖2 樣品HPLC色譜圖

由圖1和圖2可以看出，亮菌甲素對(duì)照品和供試品中亮菌甲素的保留時(shí)間均在6.91 min左右，峰形較好。亮菌甲素屬于香豆素類(lèi)衍生物，具有親脂性，易溶于乙醚，因此采用乙醚提取純化，結(jié)果顯示純化后的樣品中雜質(zhì)含量較少且對(duì)待測(cè)物峰無(wú)影響[4,14]。

3 小結(jié)與討論

1)通過(guò)14 L發(fā)酵罐進(jìn)行液體深層發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)盡管能夠?qū)崿F(xiàn)可觀的菌絲生物量和較短的發(fā)酵周期，但發(fā)酵液顏色不是很深，發(fā)酵程度低，發(fā)酵液制得的菌粉中多糖和蛋白含量均較低，無(wú)法形成像固體發(fā)酵菌絲體分泌大量棕褐色液體和粗壯多分枝菌索的現(xiàn)象，而能否大量分泌棕褐色液體是合肥誠(chéng)志生物制藥有限公司在應(yīng)用傳統(tǒng)的固體發(fā)酵工藝生產(chǎn)亮菌口服液制劑中衡量亮菌發(fā)酵質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)，因此本文所采用的發(fā)酵罐液體深層發(fā)酵工藝尚需進(jìn)一步加以研究和探討。

2)采用液體靜置發(fā)酵的方法，觀察發(fā)現(xiàn)所有三角瓶都能分泌大量棕褐色液體和形成粗壯多分支的菌索。該方法大大縮短了發(fā)酵周期，且發(fā)酵液質(zhì)量高，雜質(zhì)少，提取濃縮簡(jiǎn)單易行，亮菌多糖等活性成分指標(biāo)均優(yōu)于傳統(tǒng)的固體發(fā)酵。

綜合以上兩種發(fā)酵方法，液體靜置發(fā)酵法結(jié)合了傳統(tǒng)固體發(fā)酵程度深和液體發(fā)酵周期短的雙重優(yōu)點(diǎn)，且在多項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)及發(fā)酵成本方面均有優(yōu)越性。此外，靜置發(fā)酵法操作簡(jiǎn)便，無(wú)需專(zhuān)門(mén)設(shè)備，是亮菌制劑工業(yè)生產(chǎn)工藝改進(jìn)與創(chuàng)新的首選。

參考文獻(xiàn)：

[1]卯曉嵐．中國(guó)大型真菌[M].鄭州：河南科學(xué)技術(shù)出版社，2000,187.

[2]凌慶枝，袁懷波，王妮娜，等．亮菌固態(tài)和液體發(fā)酵多糖及其醒酒作用研究[J]．食品科學(xué)，2008，29(5)：324-326.

[3]沈業(yè)壽，馬金寶．亮菌研究的現(xiàn)狀與展望[J].安徽大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，31(1)：82-86.

[4]王 巖.香豆素類(lèi)利膽藥物亮菌甲素的藥代動(dòng)力學(xué)研究[D].長(zhǎng)春，吉林大學(xué)，2008.

[5]Nagai K， Tanaka J， Kiho T， et al． Synthesis and antitumor activities of mitomycin C (1-3)-beta-D-glucan conjugate[J]．Chem Pharm Bull(Tokyo)， 1992， 40(4)： 986-989.

[6]趙戈清，羅 霞，劉高陽(yáng)，等．亮菌多糖對(duì)S180荷瘤小鼠免疫功能的研究[J].免疫學(xué)雜志，2006，22(3)：146-148.

[7]Kiho T．Polysaccharides in fungi. XXIX. structural features of two antitumor polysaccharides from the fruiting bodies ofArmillariellatabescens[J]．Chemical and Pharmaceutical Bulletin，1992，40(8)：2212-2214.

[8]高 婷，白家峰，羅 霞，等.亮菌粗多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，42(2)：395-398.

[9]敖宗華, 符慧子, 鄒錫良. 大規(guī)模液體深層發(fā)酵生產(chǎn)亮菌菌絲體菌粉及其多糖工藝[P]. CN: 1596585, 2005-03-23.

[10]敖宗華，陸震鳴，孫軍恩,等.亮菌菌粉和亮菌糖漿品質(zhì)分析比較[J].生物技術(shù)通報(bào)，2008,4：188-190.

[11]宋 淼，王 清，張書(shū)祥．假蜜環(huán)菌液體種子培養(yǎng)條件的優(yōu)化及其應(yīng)用研究[J].生物學(xué)雜志，2012，29(5)：64-67.

[12]董麗輝，范三微，黃貝貝.亮菌液體發(fā)酵多糖提取工藝研究[J].食品工業(yè)，2012，33(10)：4-6.

[13]黃趙剛，李紹平，張 平，等．高效液相色譜法測(cè)定亮菌糖漿中亮菌甲素的含量[J].藥物分析雜志，2003， 23(3)：229-231.

[14]任惠霞，張 平，程 剛，等．高效液相色譜法測(cè)定亮菌水提液中亮菌甲素的含量[J].安徽醫(yī)藥，2012，16(6)：759-760.