高秀芝， 蔣霞敏， 葉 麗

(寧波大學 海洋學院， 浙江 寧波 315211)

微藻中所含的高不飽和脂肪酸(HUFA)，特別是二十碳五烯酸(EPA)對魚蝦等幼體的生長發(fā)育具有重要的作用，并且EPA在營養(yǎng)強化、預防和治療多種疾病方面也發(fā)揮著非常重要的作用。而溫度、光照、鹽度等基礎生態(tài)因子是影響微藻生長、油脂積累和脂肪酸組成的重要因素。因此，研究微藻的生長、總脂及脂肪酸組成與基礎生態(tài)因子的關系，是一項必須的基礎性研究工作。

國內外關于骨條藻屬中的中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)研究的較多，主要集中在中肋骨條藻的脂肪酸組成[1-2]，溫度、光照[3]、氮磷營養(yǎng)鹽[4-6]等對其生長的影響方面，對影響總脂含量、脂肪酸組成的重要環(huán)境因素鮮有報道。本文在分析了5株海洋微藻的總脂及脂肪酸組成，篩選出3株總脂、EPA含量較高藻株的基礎上，研究了溫度、光照和鹽度對分離篩選藻株曼氏骨條藻(Skeletonemamunzelii)SM-1、曼氏骨條藻SM-2的生長、總脂含量及脂肪酸組成的影響，旨在了解重要理化因子對2株曼氏骨條藻油脂積累和脂肪酸組成影響的規(guī)律，為優(yōu)化培養(yǎng)條件、增加生物量、促進油脂積累和提高EPA提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藻種

曼氏骨條藻SM-1和曼氏骨條藻SM-2是作者分別從浙江漁山列島海域(122°13′00″～122°18′50″E，28°52′00″～28°57′00″N)，朱家尖近海海域(29°52′ N, 122°25′ E)采用水滴分離法和稀釋法分離獲得的藻株，經特殊處理掃描電鏡拍攝專家鑒定。采用MAV培養(yǎng)基[7]進行單種培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度25℃，光照強度60 μ mol/m2·s，自然海水鹽度25，pH值8.05，不充氣培養(yǎng)。

1.2 溫度試驗

設置溫度梯度為10、15、20、25和30℃。培養(yǎng)容器為3 L三角燒瓶，培養(yǎng)水體為2.5 L，各三平行。采用MAV培養(yǎng)基進行單種培養(yǎng)，各組放在GXZ-260C型智能型光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為不充氣培養(yǎng)，光照強度為60 μ mol/m2·s，光暗周期12 h∶12 h，鹽度25，培養(yǎng)時間7 d，

1.3 光照試驗

設置光照強度梯度為20、40、60、80、100和120 μmol/m2·s，光暗周期12 h∶12 h。培養(yǎng)溫度為25℃，其他條件同1.2。

1.4 鹽度試驗

設置鹽度梯度為10、15、20、25、30、35和40。用消毒自然海水、消毒的淡水和飽和氯化鈉溶液調節(jié)鹽度。培養(yǎng)溫度為25℃，其他條件同1.2。

1.5 測定指標和測定方法

生長速率的測定：達到指數生長末期后，采用血球計數板測定藻細胞密度，生長速率按K=(lnN2-lnN1)/t計算。

式中：t為培養(yǎng)天數；N1為培養(yǎng)開始時的藻細胞數；N2為培養(yǎng)t天后的藻細胞數。

總脂含量的測定：在藻細胞達到指數生長末期后將藻液離心收集(4000 r/min, 4℃)，冷凍干燥，藻粉于-20℃冷凍保存。稱取100 mg左右的藻粉，參照改進后的Bligh-Dyer法[8]進行總脂含量的測定。

總脂含量(%)=(總脂質量/藻粉質量)×100

脂肪酸組成的測定：總脂移入4 mL樣品瓶，加入5%～6%KOH甲醇溶液(V/V 4∶1), 充N21 min。皂化甲酯化過程參照文獻[9]，然后用日本SHIMADZU公司QP2010氣象色譜-質譜分析儀進行分析, 參考脂肪酸標準和參考文獻[10-13]，用面積歸一法計算出各脂肪酸的百分含量(以占脂肪酸含量的百分比表示)。

1.6 數據處理與統(tǒng)計

繪圖采用Excel，數據統(tǒng)計分析利用SPSS 13.0進行單因素方差分析(One-way ANOVA), 并采用LSD進行多重比較。

2 結果

2.1 溫度試驗

圖1 溫度對2株曼氏骨條藻生長速率的影響

2.1.1 溫度對藻生長速率的影響 不同溫度對2株藻生長速率影響顯著(P<0.05)，見圖1。SM-1和SM-2的生長速率均隨溫度的上升先增加后降低， SM-1在25℃時生長速率達到最大(0.288)，顯著高于其它組(P<0.05)；30℃時生長速率最小(0.063)，顯著低于其它組(P<0.05)。SM-2在20℃時生長速率達到最大(0.303)，顯著高于其它組(P<0.05)；30℃時生長速率最小(0.042)，顯著低于其它組(P<0.05)。

2.1.2 溫度對藻總脂含量的影響 不同溫度對2株藻總脂含量影響顯著(P<0.05，見圖2。10～25℃下，SM-1總脂含量隨溫度的升高而降低，10℃時總脂含量達到最高(16.40%)，與其它組差異顯著(P<0.05)，20℃與25℃無顯著差異(P>0.05)。SM-2總脂含量在10～25℃下隨溫度的升高，有下降趨勢。與SM-1相比，SM-2在25℃時的總脂含量(11.48%)要高于20℃時的總脂含量(9.98%)，且差異顯著(P<0.05)，而20℃與30℃無顯著差異(P>0.05)；10℃時，SM-2總脂含量也達到最高(18.06%)，與其它組差異顯著(P<0.05)。

圖2 溫度對2株曼氏骨條藻總脂含量的影響

2.1.3 溫度對藻脂肪酸組成的影響 不同培養(yǎng)溫度對2株藻脂肪酸組成的影響差異極顯著(P<0.01)，見表1。2株微藻的主要脂肪酸為C16:1 n-7、C16:0、C20:5 n-3、C14:0、C16:3。SM-1的EPA、PUFA含量隨溫度的升高呈先上升后下降的趨勢，15℃時EPA、PUFA含量均達到最高，分別為18.87%和40.98%，與其它組差異均極顯著(P<0.01)，30℃時均最低，均顯著低于其它組(P<0.01)。SM-2的EPA、PUFA含量變化趨勢同SM-1，15℃時EPA、PUFA含量最高(19.97%、42.59%)，與其它組均差異極顯著(P<0.01)，30℃時EPA、PUFA含量均最低(13.89%和29.20%)，顯著低于其它組(P<0.01)。

2.2.2 光照強度試驗

2.2.1 光照強度對藻生長速率的影響 不同光照強度對2株藻生長速率影響顯著(P<0.05)，見圖3。在光照強度為120 μ mol/m2·s時2株藻均出現藻細胞死亡現象，說明這2株藻不適合在120 μ mol/m2·s及以上的強光照下培養(yǎng)。20～120 μ mol/m2·s下，2株藻的生長速率均隨光照強度的增強呈現先增高后降低的趨勢，2株藻的的生長速率從高到低依次為60 μmol/m2·s>40 μmol/m2·s>80 μmol/m2·s>20 μmol/m2·s>100 μmol/m2·s。60 μmol/m2·s時，2株藻的生長速率均達到最大值(SM-1 0.262、SM-20.275)，與其它組相比均差異顯著(P<0.05)。

2.2.2 光照強度對藻總脂含量的影響 不同光照強度對2株藻總脂含量影響顯著(P<0.05)，見圖4。在光照強度 20 μ mol/m2·s～100 μ mol/m2·s下，2株藻的總脂含量均隨溫度的升高而降低。SM-1藻株在20 μ mol/m2·s時SM-1總脂含量達到最高(13.9%)，顯著高于其它組(P<0.05)，100 μ mol/m2·s時最低(9.67%)，而 80 μ mol/m2·s與100 μ mol/m2·s無顯著差異(P>0.05)。SM-2藻株在20 μ mol/m2·s時總脂含量也達到最高(13.21%)，與其它組差異顯著(P<0.05)，100 μ mol/m2·s時最低(9.74%)，顯著低于其它組(P<0.05)。

表1 不同溫度下微藻的脂肪酸組成(占脂肪酸含量的百分比)

同行數據肩標無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同字母表示差異顯著(P<0.05). NT: no detected. SFA: saturated fatty acid. MUFA: monounsaturated fatty acid. PUFA: polyunsaturated fatty acid. 下表同。

2.2.3 光照強度對藻脂肪酸組成的影響 不同光照強度對藻脂肪酸組成的影響顯著(P<0.05)，見表2。共檢出14種脂肪酸，主要脂肪酸為C16:1 n-7、C16:0、C20:5 n-3、C14:0、C16:3。SM-1的EPA、PUFA含量均隨光照強度的增強呈下降的趨勢，40 μ mol/m2·s時，EPA含量達到最高(19.39%)，40 μ mol/m2·s與20 μ mol/m2·s的EPA含量無顯著差異(P>0.05)；而PUFA含量在20 μ mol/m2·s時達到最高，為41.88%；20 μ mol/m2·s時的PUFA含量與其它組差異顯著(P<0.05)，在60 μ mol/m2·s時，EPA、PUFA含量均為最低，分別僅為14.43%、29.35%，均與其它組差異顯著(P<0.05)。SM-2的EPA含量隨著光照強度的增強呈先減后增的趨勢，40 μ mol/m2·s時最高(21.21%)，但與20 μ mol/m2·s(20.74%)無顯著差異(P>0.05)，60 μ mol/m2·s時最低(16.75%)，與其它組顯著差異(P<0.05)；PUFA 含量隨光照強度的增強呈先減后增的趨勢，20 μ mol/m2·s時最高(43.49%)，與其它組差異顯著(P<0.05)，60 μ mol/m2·s時最低(34.80%)，與其它組差異顯著(P<0.05)，80 μ mol/m2·s與100 μ mol/m2·s的PUFA無顯著差異(P>0.05)。

表2不同光照下微藻的脂肪酸組成

圖3光照強度對2株曼氏骨條藻生長速率的影響

Fig 3 Effect of light intensity on growth rate ofS.munzeliiSM-1and SM-2

圖4 光照強度對2株曼氏骨條藻總脂含量的影響

圖5 鹽度對2株曼氏骨條藻生長速率的影響

2.3 鹽度試驗

2.3.1 鹽度對藻生長速率的影響 不同鹽度對2株藻生長速率影響顯著(P<0.05)，見圖5。在鹽度10～40下，隨著鹽度的增加，2株藻的生長速率均呈先升高后降低的趨勢。2株藻均在鹽度30時生長速率最大，分別為0.290和0.284，與其它組差異顯著(P<0.05)；鹽度10時小，顯著低于其它組(P<0.05)。

圖6 鹽度對2株曼氏骨條藻總脂含量的影響

2.3.2 鹽度對藻總脂含量的影響 不同鹽度對2株藻總脂含量影響顯著(P<0.05)，見圖6。SM-1在鹽度15時總脂含量最高，顯著高于其它組(P<0.05)；鹽度30時最低，顯著低于其它組(P<0.05)。各鹽度下的總脂含量從高到低依次為為鹽度15(17.01%)>35(14.85%)>20(13.49%)>25(11.73%)>30(10.21%)，其中鹽度35與10無顯著差異(P>0.05)，鹽度10和鹽度20無顯著差異(P>0.05)，鹽度25和鹽度40差異不顯著(P>0.05)。SM-2在鹽度35時總脂含量最高，鹽度40最低，各鹽度下的總脂含量從高到低依次為鹽度35(18.56%)>15(15.46%)>20(13.76%)>40(11.97%)，鹽度40與鹽度10、鹽度25、鹽度30無顯著差異(P>0.05)。

2.3.3 鹽度對藻脂肪酸組成的影響 不同鹽度對藻脂肪酸組成的影響顯著(P<0.05)，見表3、表4。共檢出14種脂肪酸，主要脂肪酸為C16:1 n-7、C16:0、C20:5 n-3、C14:0、C16:3。SM-1的EPA含量隨鹽度的增加呈先增后降的趨勢，鹽度15的EPA含量達到最高，顯著高于其它組(P<0.05)；鹽度35時最低。SM-1的PUFA含量隨鹽度的增加呈先增后減的趨勢，鹽度15時PUFA含量達到最高，顯著高于其它組(P<0.05)；鹽度25時最低(34.72%)。SM-2的EPA含量也隨鹽度的增加呈先增后減的趨勢，鹽度15時EPA含量達到最高，顯著高于其它組(P<0.05)；鹽度35時最低，顯著低于其它組(P<0.05)。SM-2的PUFA含量隨鹽度的增加亦呈先增后減的趨勢，鹽度15時達到最大，顯著高于其它組(P<0.05)；鹽度25時最低，顯著低于其它組(P<0.05)。

表3 鹽度對曼氏骨條藻SM-1脂肪酸組成的影響

3 討論

3.1 溫度對藻生長、總脂及脂肪酸組成的影響

溫度是影響微藻生長、脂肪含量及脂肪酸組成的重要因子之一。本試驗中2株曼氏骨條藻在不同溫度下的生長速率差異顯著，這2株藻均能在10～25℃下正常生長，最適生長溫度分別為20～25℃，與于萍等[3]報道的中肋骨條藻的最適溫度為25℃，在30℃下培養(yǎng)幾天后大量死亡的結果較為一致。對于光自養(yǎng)型生物來說溫度主要通過控制酶動力學來影響它們的生長[14]。超出適溫范圍溫度時，可能由于微藻細胞出現不同程度的質壁分離[15]進而影響了其正常生活。

本試驗中2株藻的總脂含量隨著溫度的升高而減少，10℃總脂含量達到最高，30℃時最低，與周洪琪等[16]報道的海洋硅藻鏟狀菱形藻(Nitzschiapaleacea)脂肪含量在10～30℃下隨培養(yǎng)溫度的升高而減少，在10℃時脂肪含量最高的結果較為一致。而Somerville[17]研究的微綠球藻(Nannochloropsisoculata)的油脂含量在一定溫度范圍內隨溫度的升高而增加，可見溫度對脂肪含量的影響因種而異。

硅藻的主要脂肪酸為C14:0、C16:0、C16:1 n-7和EPA，而C18和C22多不飽和脂肪酸含量較低，本試驗中2株曼氏骨條藻均為海洋硅藻，其脂肪酸組成符合硅藻的特性。試驗表明低溫有利于2株藻EPA及PUFA的合成，SM-1和SM-2在15℃時EPA及PUFA含量達到最高，而在生長速率達最大時PUFA含量較低，甚至低于30℃時的PUFA含量，可見并不是溫度越高，PUFA、EPA含量越低。魏東等[18]研究表明在一定溫度范圍內，可通過降低培養(yǎng)溫度來提高微藻的脂肪酸的不飽和度，以保持膜的通透性，從而提高細胞對低溫的耐受力。

溫度試驗表明，對于SM-1、SM-2，在25℃生長速率達到最大時總脂含量、EPA和PUFA含量并不是最高。雖然低溫可獲得較高含量的PUFA，但勢必會影響到生長速率或生物量，最終影響EPA及PUFA產量。因此在大規(guī)模培養(yǎng)中，可采用二次培養(yǎng)法，即先在最適溫度下培養(yǎng)，積累生物量，再轉至低溫下培養(yǎng)調控，提高PUFA產量。

表4 鹽度對曼氏骨條藻SM-2脂肪酸組成的影響

3.2 光照對藻生長、總脂及脂肪酸組成的影響

光是單胞藻培養(yǎng)中影響其生長及生化成分的重要因子之一。在適光范圍，增加光照強度可使光合作用速度加快，細胞分裂速率加快，細胞分裂速率達到最高時的光強為飽和光強。若超過飽和光強，光合作用就會減弱甚至受到抑制[19]。試驗中光照強度對2株曼氏骨條藻SM-1、SM-2的生長速率及生物量的影響是顯著的，2株藻的最適光強是60 μ mol/m2·s，在20～100 μ mol/m2·s光強下，兩者的生長速率均隨著光強的增加而減??；而在高光強120 μ mol/m2·s下，均出現藻體死亡現象，說明SM-1、SM-2不適合在120 μ mol/m2·s及以上的高光強下培養(yǎng)。于萍等[3]研究的中肋骨條藻的最適光照強度已經高于120 μ mol/m2·s，可見即使是同種屬的藻其最適光強也因藻株不同而異。

研究發(fā)現，在20～100 μ mol/m2·s光強下，SM-1、SM-2的總脂含量隨光強的增加而減少，20 μ mol/m2·s光強下，總脂含量達到最高，100 μ mol/m2·s時最低，這與石娟等[19]研究的小新月菱形藻(Nitzschiaclosteriumf.minutissim)(MACC/B228)和等鞭金藻8701(IsochrysisgalbanaParke 8701)(MACC/H060)在較低的光強下，2種藻的脂肪含量增多，較高光強下脂肪含量減少的研究結果相似，而這可能與細胞內光合作用的機制有關，光合作用在葉綠體的類囊體上進行，而類囊體的主要組分是甘油脂，甘油脂的相對數量與細胞的光合活力關系密切。低光強下，為增加光合效率，類囊體的表面積有所增加，膜脂的合成速率維持在較高水平，而高光強下，光合機構受損，光合效率下降，脂膜合成速率降低，甚至受到破壞[20]。

更多研究表明，生長在高光照強度下的微藻其不飽和脂肪酸的比例在下降[20]。孫利芹等[21]研究的紫球藻(Porphyridiumcruentum)在中等光強下有利于EPA的積累。而Lee 等[22]研究的紫球藻的EPA含量則隨光照強度的增加而增加。蔣霞敏等[9， 23]對微綠球藻和綠色巴夫藻(Pavlovaviridid)的研究中發(fā)現PUFA含量隨光強的增強而降低，針對這一現象，Renaud等[24]認為是由于不同的微藻細胞中存在不同類型的去飽和酶，而這些酶的活性受光強的影響不同所致。本研究中SM-1、SM-2的EPA含量均在中等偏低的光強40 μ mol/m2·s時達到最大，而均與光強20 μ mol/m2·s時的EPA含量無顯著差異。2株藻的PUFA含量均在低光強20 μ mol/m2·s時達到最大值。

光照試驗表明，2株藻最適生長光強為60 μ mol/m2·s，而總脂、EPA、PUFA達到最高含量時的光強為20 μ mol/m2·s，因此在大規(guī)模生產當中，可考慮先在最適生長光強60 μ mol/m2·s下培養(yǎng)一段時間，再轉移到低光強20 μ mol/m2·s下培養(yǎng)，以便提高EPA和PUFA 產量。

3.3 鹽度對藻生長、總脂及脂肪酸組成的影響

鹽度是影響微藻生長、脂肪含量及脂肪酸組成的又一重要因子，但也因種而異。海水單胞藻一般都是廣鹽性藻[25]，試驗發(fā)現在鹽度10～40下，2株藻都能正常的生長。2株藻的最適生長鹽度均為30。而陳炳章等[26]研究的中肋骨條藻在18～35.7下均適合其生長，鹽度對中肋骨條藻影響較小，幾乎看不出什么影響。霍文毅等[27]提出中肋骨條藻的最適鹽度增值范圍20～30，這與本研究結果相似。

研究表明SM-1合成脂肪的最適鹽度為15，其次為鹽度35，而SM-2合成脂肪的最適鹽度為35，其次為15。高于或低于最適鹽度則隨鹽度的升高或下降而減少。韋芳三等[28]研究的鹽藻(Dunaliellasalina)在鹽度40時脂肪含量達到最高，高于或低于40時，隨鹽度的升高或下降減少，這與本研究的結果較為相似。鹽度對微藻總脂含量的影響機理尚未清楚。

2株藻的EPA、PUFA含量在鹽度10～20時較高，而鹽度15時EPA、PUFA含量均最高，而最適生長鹽度30時，EPA、PUFA含量偏低。這與馮雷等[29]研究的4株小球藻的EPA含量隨鹽度的增加有所下降的結果一致。Al-Hason 等[30]報道鹽度對Naviculaoculara中脂肪酸的影響，結果表明鹽度對脂肪酸的影響因種而異。

鹽度試驗表明鹽度顯著影響2株曼氏骨條藻的生長、總脂及脂肪酸組成。建議大規(guī)模生產時調整鹽度為25～30，先提高生物量，后降鹽度，提高總脂含量及PUFA產量。

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