冷歡，張幸，劉家書，趙勇，李谞，江正兵，宋慧婷

（1.湖北省工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湖北大學(xué)），湖北武漢430062；2.湖北大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，湖北武漢430062）

0 引言

凝乳酶是從未斷奶的小牛第四胃中提取的一種天冬氨酸蛋白酶，它可以切斷牛乳κ－酪蛋白的Phe－Met肽鍵，導(dǎo)致牛乳凝結(jié)［1］.在小牛皺胃中，凝乳酶通常合成為一個含有381個氨基酸的前體聚肽—凝乳酶原前體，凝乳酶原前體在分泌過程中去掉16個信號肽形成含有365個氨基酸的凝乳酶原［2］.凝乳酶原無活性，它在酸性pH下通過多步的自動催化過程，去掉N末端42個氨基酸形成有活性的含有323個氨基酸的蛋白－凝乳酶［3］.目前，凝乳酶年均需求量為2.5×107L，約占全世界酶制劑總量的15%，居第二位［4］.傳統(tǒng)的凝乳酶來源于小牛皺胃.但是隨著世界奶酪產(chǎn)業(yè)的不斷壯大，單純靠宰殺大量的小牛獲取凝乳酶顯然與現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展不相符，植物凝乳酶雖然來源廣泛，但是其蛋白水解力強(qiáng)，并且受時間、地點(diǎn)等的限制難以發(fā)展.微生物凝乳酶從1965年起開始取代小牛皺胃酶生產(chǎn)干酪以來，成功地彌補(bǔ)了小牛凝乳酶短缺的問題，并在奶酪制造業(yè)與酪素產(chǎn)業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用.目前利用微生物凝乳酶生產(chǎn)的干酪已占世界干酪總產(chǎn)量的1／3［5］.目前，在我國利用畢赤酵母表達(dá)牛凝乳酶的報道較少，在畢赤酵母宿主菌中分泌表達(dá)的凝乳酶的結(jié)構(gòu)以及酶學(xué)性質(zhì)在相應(yīng)的報道中研究的并不全面，并且微生物中表達(dá)得到凝乳酶代替屠殺小牛來提取小牛凝乳酶更具有現(xiàn)實(shí)意義.因此，凝乳酶基因在畢赤酵母中表達(dá)這一研究值得我們進(jìn)一步考究.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料 菌種和質(zhì)粒：Escherichia.coli XL10－Gold，畢赤酵母GS115由本實(shí)驗(yàn)保存.

1.2 試劑與培養(yǎng)基 限制性內(nèi)切酶：SfiⅠ、MunⅠ、NotⅠ、XbaⅠ、EcoRⅠ，T4DNA連接酶，EX TaqDNA聚合酶，DNA markers購自TaKaRa公司.

實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基主要有：LB、YPD、MD、BMGY、BMMY培養(yǎng)基的組成和配制參見Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊.

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 TaKaRa梯度PCR儀購自TaKaRa公司；冰凍離心機(jī)購自Sigma公司低溫冰箱合肥美菱股份有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；UV－2550分光光度計上海棱光技術(shù)有限公司.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 載體pPIC9K－prochy構(gòu)建 GenBank中找到凝乳酶的基因編號為：NM＿180994.1.由上海捷瑞生物工程有限公司基因合成，合成基因克隆于質(zhì)粒pUC19.將pUC19－prochy用EcoRⅠ和NotⅠ酶切，得到prochy基因片段.用質(zhì)粒pPIC9k分別EcoRⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切，分別回收載體和目的基因的雙酶切產(chǎn)物，用T4DNA連接酶在16度下連接，構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9K－prochy.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL10－Gold，用LB瓊脂平板（Amp 25mg／mL）篩選，抽提質(zhì)粒DNA.SalⅠ和EcoRⅠ雙酶切驗(yàn)證.

1.4.2 構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9K－prochyQ（去掉凝乳酶基因中的信號肽序列） 根據(jù)對酵母表達(dá)載體pPIC9K的限制性酶切位點(diǎn)分析，并參考本實(shí)驗(yàn)室已克隆的凝乳酶基因序列（GenBank Accession No.NM＿180994.1），在基因上下游設(shè)計特異引物，序列見表1，引物由上海英駿生物工程有限公司完成.這對引物主要用于去掉凝乳酶原前端信號肽序列，凝乳酶原的氨基酸序列中前16個氨基酸為信號肽.Prochymosin－EcoR1－F這段引物從49位堿基開始.將得到的PCR產(chǎn)物膠回收后用EcoRⅠ和NotⅠ酶切，即得到prochy－Q（去掉凝乳酶原基因前端的48個信號肽的堿基序列）［6］.用質(zhì)粒pPIC9K分別EcoRⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切.將分別回收載體和目的基因的雙酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶在16度下連接，構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9K－prochyQ.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)中，用LB瓊脂平板（Amp25mg／mL）篩選，抽提質(zhì)粒DNA.SalⅠ和EcoRⅠ雙酶切驗(yàn)證.

表1 本實(shí)驗(yàn)中使用的引物

1.4.3 電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115 使用SalⅠ酶切重組質(zhì)粒pPIC9K－prochy以及pPIC9K－prochyQ使其線性化.通過電脈沖法將線性化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115中，MD平板篩選轉(zhuǎn)化子［7］.

1.4.4 陽性克隆的功能鑒定 將篩選得到的陽性克隆分別接種于含50mL BMGY液體培養(yǎng)基的500mL的三角瓶中，于28℃搖床上培養(yǎng)待OD值達(dá)到2～6時，再分別將其接種于含50mL BMMY液體培養(yǎng)基的1 000mL的三角瓶中.每24h加一次甲醇使其終體積參數(shù)為0.5%，培養(yǎng)4d后，收集培養(yǎng)液上清.采用Arima K的方法對上清進(jìn)行凝乳活力（milk clotting activity，MCA）的測定［8］.

用0.01mol／L的CaCl2溶液配制10%脫脂乳，此溶液配制后在室溫下放置40min后使用，取5mL10%脫脂乳于35℃保溫10min，加入適量稀釋的酶液，震蕩均勻并開始計時，觀察管壁上開始出現(xiàn)凝乳顆粒為終點(diǎn)，記錄凝乳時間（t／min），在上述條件下，40min凝結(jié)1mL10%脫脂乳的酶量定義為一個Soxhlet單位（SU）.

1.4.5 重組凝乳酶的酶學(xué)特性的研究 收集BMMY培養(yǎng)基上清，將其保存在4℃冰箱，隨后我們對重組凝乳酶進(jìn)行一系列的酶學(xué)特性的分析.如凝乳酶反應(yīng)的最適pH，凝乳酶的pH值穩(wěn)定性，凝乳酶的熱穩(wěn)定性，反應(yīng)的最適溫度［9］.

1.4.5.1 凝乳酶反應(yīng)的最適pH值 用1mol／L的H2SO4和2mol／L的NaOH將脫脂奶粉的pH值調(diào)到5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在37℃下測定重組凝乳酶的活性.將最高活力定義為100%，分別計算不同pH值條件下凝乳酶的相對酶活力.

1.4.5.2 凝乳酶的pH值穩(wěn)定性 用1mol／L的H2SO4和2mol／L的NaOH將酶液的pH值調(diào)到2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在4℃下放置l h后，再用1mol／L的H2SO4和2mol／L的NaOH將酶液的pH值調(diào)到6.0，在37℃下測定重組凝乳酶的殘余酶活，將最高活力定義為100%，分別計算不同pH值條件下凝乳酶的相對酶活力.

1.4.5.3 凝乳酶的熱穩(wěn)定性 將酶液分裝于試管中，分別在40、50、55℃水浴中溫育，每隔10min取樣，迅速冷卻，在37℃下測定殘余重組凝乳酶的活性.將未處理酶液的酶活力定義為100%，分別計算不同溫度條件下凝乳酶的相對酶活力.

1.4.5.4 重組凝乳酶的最適反應(yīng)溫度 將酶反應(yīng)體系在20、25、30、35、40、45、50℃等溫度下檢測重組凝乳酶的活性，將最高的酶活力定義為100%，分別計算不同溫度條件下凝乳酶的相對酶活力.

2 結(jié)果部分

2.1 載體pPIC9K－prochy和載體pPIC9K－prochyQ構(gòu)建圖譜與酶切鑒定 根據(jù)以上的構(gòu)建方法，得到重組載體質(zhì)粒pPIC9K－prochy、pPIC9K－prochyQ.其構(gòu)建圖譜和酶切鑒定如圖1～3所示.pPIC9K、pPIC9K－prochy、pPIC9K－prochyQ經(jīng)過SalⅠ和EcoRⅠ雙酶切后理論上會分別得到大小為1 900bp，3 100bp，3 100bp小片段，這與我們實(shí)際得到的（如圖3所示）片段相符.

圖1 載體pPIC9K－prochy構(gòu)建過程

圖2 載體pPIC9K－prochyQ構(gòu)建過程

圖3 pPIC9k和pPIC9k－prochy pPIC9k－prochyQ的酶切檢測結(jié)果M為λ－EcoT14Ⅰdigest DNA marker；9K、Y、Q分別對應(yīng)為pPIC9K、pPIC9K－prochy、pPIC9K－prochyQ質(zhì)粒經(jīng)過SalⅠ和EcoRⅠ雙酶切后的電泳圖.

2.2 陽性克隆的功能鑒定 通過構(gòu)建成功的表達(dá)載體pPIC9K－prochy，pPIC9K－prochyQ線性化后使用電脈沖法將線性化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115中，MD平板篩選轉(zhuǎn)化子.我們使用搖瓶誘導(dǎo)的方法共篩選了120株重組菌，得到3株菌株表達(dá)的凝乳酶有明顯的凝乳活性，分別命名為GS115／pPIC9K－chy1（表達(dá)載體為pPIC9K－prochy，保留凝乳酶基因中的信號肽），GS115／pPIC9K－chy20（表達(dá)載體為pPIC9K－prochy，保留凝乳酶基因中的信號肽），GS115／pPIC9K－chy8Q（表達(dá)載體為pPIC9K－prochyQ，去掉凝乳酶基因中的信號肽）.如圖4，將這3株菌株搖瓶誘導(dǎo)得到的上清粗酶液進(jìn)行功能鑒定，從左至右分別是GS115／pPIC9K－chy1，GS115／pPIC9K－chy20，GS115／pPIC9K－chy8Q，GS115／pPIC9K（對照）.

2.3 重組凝乳酶的活力曲線 將篩選得到的3株酵母重組菌株分別接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY中，每24 h加一次甲醇至終濃度為0.5%并取1mL培養(yǎng)液測其凝乳酶的活力以繪出凝乳酶的活力曲線.重組凝乳酶（來自于GS115／pPIC9K－chy1菌株）的活力曲線如圖5，144h時有較大幅度的增長，在168h時有最大酶活，另外兩種菌株表達(dá)的凝乳酶的酶活也在144h后有較大幅度的增長.

2.4 重組凝乳酶的最適反應(yīng)pH值 將篩選得到的3株酵母重組菌株分別接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY中，每24h加一次甲醇至終濃度為0.5%并取1mL培養(yǎng)液測其凝乳酶的活力以繪出凝乳酶的相對酶活.重組凝乳酶（來自于GS115／pPIC9K－chy1菌株）的相對酶活曲線如圖6.圖中可以看到重組凝乳酶在pH值為6.0時酶活最高.

圖4 陽性克隆的功能鑒定

圖5 重組凝乳酶的酶活特性

圖6 重組凝乳酶的最適反應(yīng)pH

2.5 重組凝乳酶的pH穩(wěn)定性 將酶在不同pH梯度下處理1h后，結(jié)果如圖7所示.隨著pH值的增加，重組凝乳酶的活性隨著增加，當(dāng)pH為4～7時，凝乳酶有較好的穩(wěn)定性.在pH為7.0時，重組凝乳酶有最大酶活，當(dāng)pH大于7.0時，隨著酶的變性導(dǎo)致酶活力迅速下降.在pH等于9.0時，凝乳酶幾乎沒有活性，推測是由于酶發(fā)生不可逆變性導(dǎo)致，可認(rèn)為酶活為0.

2.6 凝乳酶的熱穩(wěn)定性 如圖8所示，重組凝乳酶在50℃以下可以保持相對穩(wěn)定的活性，當(dāng)溫度超過55℃時，凝乳酶的活性迅速下降.

圖7 重組凝乳酶的pH穩(wěn)定性

圖8 凝乳酶的熱穩(wěn)定性

2.7 重組凝乳酶的最適反應(yīng)溫度 如圖9所示，當(dāng)溫度低于30℃時，由于溫度太低，凝乳反應(yīng)幾乎不能發(fā)生，隨著溫度的升高，凝乳酶的活性逐漸增加，達(dá)到45℃時有最大反應(yīng)活性，隨著溫度繼續(xù)升高，酶的活性迅速下降.

圖9 溫度對重組凝乳酶活性的影響

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)篩選到了3株重組菌株——GS115／pPIC9K－chy1、GS115／pPIC9K－chy20、GS115／pPIC9K－chy8Q.通過Arima K酶活測試方法，確定了這3種菌株表達(dá)的凝乳酶都具 有一定的凝乳特性，其中GS115／pPIC9K－chy1的活性最高為1.905SU／mL，GS115／pPIC9K－chy20其次，GS115／pPIC9K－chy8Q表達(dá)得到的凝乳酶的酶活相對最小.前兩株重組菌為沒有去掉凝乳酶基因中的信號肽，GS115／pPIC9K－chy8Q為去掉了凝乳酶基因中的信號肽.據(jù)此我們有兩種推測，一是凝乳酶本身含有的前導(dǎo)肽可能對凝乳活性產(chǎn)生有利影響；二是由于GS115－pPIC9K－chy1和GS115－pPIC9K－chy20這兩種菌株中所含的目的基因的拷貝數(shù)多于GS115－pPIC9K－chy8Q，推測二可以通過Southern－blot來檢測這3種菌株中所含的目的基因的拷貝數(shù)，從而證實(shí)其正確與否.

重組凝乳酶的最適反應(yīng)溫度為45℃，在50℃以下可以保持相對穩(wěn)定的活力，當(dāng)溫度高于55℃時酶的活力迅速下降，重組凝乳酶的最適pH值為6.0.當(dāng)酶液的pH為4～7時，凝乳酶有較好的穩(wěn)定性，在pH為7.0時，重組凝乳酶最穩(wěn)定，當(dāng)pH大于7.0時，隨著酶的變性導(dǎo)致酶活力迅速下降.通過重組凝乳酶的活力曲線得出，144h后凝乳酶的酶活有明顯的提高.通過酶學(xué)特性的研究，證明了重組凝乳酶與商品凝乳酶的酶學(xué)特性相近，至于將其應(yīng)用到工業(yè)化食品奶酪的加工［10］生產(chǎn)還需要我們進(jìn)一步研究.

［1］李璐，張旭，李杰.農(nóng)桿菌介導(dǎo)凝乳酶基因轉(zhuǎn)化黑曲霉載體的構(gòu)建［J］.生物技術(shù)，2011，21（4）：8－12.

［2］Cardoza R E，Gutierrez S，Ortega N，et al.Expression of a synthetic copy of the bovine chymosin gene in Aspergillus Awamori from constitutive and pH－regulated promoters and secretion using two different pre－pro sequences［J］.Biotechnol Bioeng，2003，83（3）：249－259.

［3］Moller K K，Rattray F P，Sorensen J C，et al.Comparison of the hydrolysis of bovineκ－casine by camel and bovine chymosin：a kinetic and specificity study［J］.Journal of Agriculture Food Chemistry，2012，60（21）：54－60.

［4］徐波，張莉，王景會，等.干酪加工專用凝乳酶及其基因工程酶的研究［J］.中國乳品工業(yè)，2009，37（4）：46－50.

［5］劉佟，崔艷華，張?zhí)m威，等.凝乳酶的研究進(jìn)展［J］.中國乳品工業(yè)，2011，39（8）：40－43.

［6］張健，張莉，李玉秋，等.重組畢赤酵母產(chǎn)凝乳酶發(fā)酵條件研究［J］.中國釀造，2011，10（235）：55－58.

［7］Valleio J A，Ageitos J M，Poza M，et al.Short communication：A comparative analysis of recombinant chymosin［J］.Journal of dairy science，2012，95（2）：609－613.

［8］Arima K，Shinjiro I，Gakuzo T.Milk－clotting enzymes from microorganism（PartⅠ）：screening test and identification of potent fungus［J］.Agricultural and Biological Chemistry，1967，31（5）：540－545.

［9］Maria C V，Alicia G C，Villar J，et al.Molecular cloning and expression in yeast of Caprine Prochymosin［J］.Journal of Biotechnology，2004，114：69－79.

［10］Marx H，Mecklenbr Uker A，Gasser B，et al.Directed gene copy number amplification in pachia pastoris by vector integration into the ribosomal DNA locus［J］.FEMS Yeast Reseach，2009，9（8）：1260－1270.