朱立娜，陳士華，吳興泉

（河南工業(yè)大學 生物工程學院，河南 鄭州 450001）

0 引言

近年來，食品安全問題引起人們的廣泛關注，頻頻爆發(fā)的食品安全事件也使其成為亟需解決的問題.在食用植物油脂領域同樣存在安全問題，例如地溝油、摻偽摻劣油、食用調和油標識混亂、轉基因油脂標識等.在食用植物油脂生產消費過程中出現(xiàn)的這些安全問題不僅對消費者的身體健康造成威脅，同時也損害了消費者的合法權益，破壞消費者的消費信心，影響了食用油市場的良性發(fā)展.

以DNA 為靶標的分子生物學檢測技術可應用于食用植物油脂的純度測定、摻偽檢測、轉基因檢測等，與以脂肪酸、特定代謝物等為靶標的其他檢測方法相比，分子生物學檢測技術更加穩(wěn)定、可靠.因為脂肪酸、特定代謝物等會隨著油料作物的生長環(huán)境、栽培條件等因素的改變而發(fā)生變化，其含量并不恒定，以此為靶標會給檢測結果帶來偏差.而DNA 作為生物遺傳物質其含量穩(wěn)定不會受到外界環(huán)境條件的影響，以此為靶標的檢測方法更具有穩(wěn)定性.

DNA 的富集與有效提取是分子生物學檢測技術在食用植物油脂檢測中應用的前提.由于DNA在食用植物油脂的加工過程中受破壞嚴重，且含量很低，因此提取難度很大.目前，關于食用油DNA 的提取方法，已有很多報道［1-4］，但大多為壓榨油脂.與精煉油有所不同，初級壓榨油不經過特殊的加工工藝處理，DNA 保存相對完整，殘留量相對較多，因此DNA 提取較精煉油更容易.如Pauli等[5]于粗制的大豆油中提取到DNA，Matteo Busconi等[6]從壓榨橄欖油中提取到DNA 并利用其對生產品種進行了鑒定，覃文等[7]早在2002 年就從市售的食用油中提取到了DNA 并檢測到了植物內源基因.盡管應用于植物油脂DNA 提取的方法已有較多報道，但目前尚未見到對植物油脂DNA 提取方法進行綜合評價、全面評述的文章.

將現(xiàn)有的油脂DNA 提取技術進行比較，選擇更高效快速的提取技術以及對現(xiàn)有的提取技術進行適當?shù)膬?yōu)化以提高DNA 提取效果已成為當前研究的重點.筆者全面介紹了目前應用于植物油脂DNA 提取的方法，并進行了綜合評價，以期為開展深入研究提供參考.

1 植物油脂DNA 提取方法

1.1 十六烷基三乙基溴化銨（CTAB）法

1.1.1 CTAB 法原理

CTAB 法是油脂DNA 提取中應用最為普遍的方法，CTAB 不僅可以裂解細胞，同時又能很好地去除多酚類、糖類等物質.CTAB 是一種陽離子去污劑，能夠與核酸形成復合物，該復合物在低鹽條件下溶解度降低而沉淀，在高鹽條件下解離，從而使DNA 與多糖等物質分開，最后用乙醇沉淀DNA，除去CTAB，獲得純化DNA.

所用緩沖溶液為Tris-HCl（pH 8.0），緩沖溶液可提供一個緩沖環(huán)境防止核酸被破壞；EDTA 螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase 活性；NaCl 提供一個高鹽環(huán)境，使DNP 充分溶解于液相中；CTAB 可溶解細胞膜并結合核酸，使核酸便于分離.PVP（聚乙烯吡咯烷酮）能與多酚形成一種不溶的絡合物，也能與多糖結合，從而有效地去除多酚、多糖類物質，降低DNA 的污染.

1.1.2 CTAB 法在植物油脂DNA 提取中的應用

CTAB 提取法能夠有效地去除多糖及酚類物質，更適用于提取富含酚類及糖類物質的植物材料的DNA.為了縮短提取流程，提高提取質量，更適合于植物油脂中DNA 的提取，研究人員對CTAB 法進行了改良[8].通過向CTAB 提取緩沖液中加入PVP 和巰基乙醇，經酚/三氯甲烷抽提，最后用異丙醇和醋酸銨沉淀油脂中的DNA，取得了不錯的效果[9].Innocenzo Muzzalupo 等[4]利用改良CTAB 法從橄欖油中提取出了純度較高的DNA，其改良方法中添加了蛋白酶K，并且在緩沖液中加入2%的β-巰基乙醇，這樣可使蛋白質充分降解，也可去除殘留的酚類物質，保護DNA 的完整性，使其能夠成功應用到后續(xù)的PCR 檢測技術當中.Matteo Busconi 等[6]采用提高CTAB 濃度的方法，并使用三氯甲烷/辛醇代替三氯甲烷/異戊醇來抽提，提高了橄欖油中DNA 的提取效率.

1.1.3 CTAB 法的特點

CTAB 法操作相對于其他DNA 手提方法簡單，且成本較低，所使用的試劑及儀器很容易操作和獲得，實驗室普遍適用.但是此方法耗時較長，容易在提取過程中對DNA 造成破壞及損失，而且提取過程中所用試劑部分有毒，例如：三氯甲烷、酚等，因此，在食用油DNA 提取方面，CTAB 法存在一定的缺陷，具有局限性.

1.2 十二烷基磺酸鈉（SDS）法

1.2.1 SDS 法原理

SDS 是一種陰離子去污劑，高溫條件下可以裂解細胞、使蛋白質變性、染色體離析，同時可與多糖、蛋白質等物質形成復合物，使核酸釋放出來.通過降低溫度，提高鹽濃度，使SDS-蛋白質復合物溶解度減小，以此來實現(xiàn)蛋白質、多糖物質的沉淀，進而用酚/氯仿抽提上清液，乙醇沉淀DNA.

常規(guī)SDS 提取液由Tris-HCl、EDTA、NaCl、SDS和巰基乙醇配制而成.最初SDS 法主要應用在植物DNA 的提取上，后來經過改進，現(xiàn)在其應用范圍更廣，且DNA 的提取質量和效率也在不斷提高.

1.2.2 SDS 方法在植物油脂DNA 提取中的應用

依據(jù)植物油脂特殊的性質及特點，對SDS 方法進行改良，可以提取到質量較高的DNA.Maja Hellebrand 等[10]應用SDS 法從菜籽油中成功地提取到DNA，他們在預處理過的菜籽油中加入SDS 緩沖液的同時加入蛋白酶K，經酚/氯仿抽提后用乙醇沉淀DNA，取得了良好的效果.姚菲等[11]也運用改良的SDS 法在茶籽油中成功提取到了茶籽DNA，在預熱的巰基乙醇和SDS 緩沖液中加入鉀鹽提高鹽濃度，以便使SDS-蛋白質復合物溶解度更小，以此來沉淀蛋白質、多糖等物質，最后用氯仿/異戊醇抽提，乙醇漂洗、TE 溶解富集DNA.

1.2.3 SDS 法的特點

SDS 法操作相對溫和簡單，也可以提取到較完整的DNA，但所提DNA 雜質較多，質量不高，也有報道稱CTAB 法所提DNA 的品質要高于SDS 法[12-14].

1.3 高鹽低pH 法

1.3.1 高鹽低pH 法原理

高鹽低pH 法利用高鹽沉淀蛋白質，低pH 介質能夠有效防止細胞破碎及沉淀大量材料時的電離化作用及酚化合物的進一步氧化，從而保證所提DNA 的質量.

高鹽低pH 法的緩沖液通常由NaAC、EDTA、NaCl、PVP、SDS、β-巰基乙醇組成，pH 值為5.5.其酸性條件可避免多酚類物質電離化及進一步氧化，PVP 可結合酚類物質防止DNA 褐化；高濃度Na+有利于SDS 與蛋白質及多糖形成復合物，然后經離心除去，從而徹底去除蛋白質和多糖.DNA 存于上層水相，最后用異丙醇抽提去除殘留酚類、蛋白質物質，乙醇漂洗TE 溶解回收DNA.

1.3.2 改良的高鹽低pH 法

高鹽低pH 法所提的DNA 相對分子質量較高，不但適用于PCR 反應，且可用于RLFP 分析.姚菲等[11]在2012 年利用高鹽低pH 法從茶籽油中成功提取到了茶籽DNA.很多研究針對該方法進行改良，通過改變提取緩沖液中β-硫基乙醇的終濃度，增加用酚、氯仿快速抽提的過程，獲得了良好的提取效果[15-16]，得到的DNA 可滿足酶切、PCR等分子生物學分析.

1.3.3 高鹽低pH 法的特點

高鹽低pH 法在DNA 提取中應用也較廣泛，此方法所用的試劑僅有無機鹽和異丙醇，而醋酸鉀等又是常用的無機鹽試劑.而且高鹽低pH 法無需反復抽提，因此所需材料相對較少.但高鹽低pH 法無法在多糖物質或者次級代謝產物含量高的組織中提取到高質量的DNA，所提取的DNA 中蛋白質污染嚴重、重復性也不好，因此其應用也存在局限性.

1.4 異硫氰酸胍（GuSCN）法

1.4.1 異硫氰酸胍（GuSCN）法原理

異硫氰酸胍是一種蛋白質變性劑，它可以迅速破壞細胞結構，釋放核酸，高濃度的異硫氰酸胍溶液還會使核酸酶變性，防止核酸降解.異硫氰酸胍裂解液（GuSCN 5 mol/L，Tris-HCl 0.1 mol/L，EDTA 0.02 mol/L，pH 8.0）可裂解細胞，釋放核酸，Tris-HCl 提供緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞，EDTA 結合二價金屬離子，抑制核酸酶活性.

1.4.2 異硫氰酸胍法在植物油脂DNA 提取中的應用

異硫氰酸胍法不但適用于普通動植物DNA 提取，還適用于經過加工的食用油DNA 提取.Simona Pafundo 等[17]使用Nucleospin Plant 試劑盒（該試劑盒的裂解液中的主要成分之一為異硫氰酸胍）提取橄欖油中的DNA，并將提取的DNA 成功用于AFLP 分析.聞偉剛等[18]在2005 年運用此方法從市售的大豆油中提取DNA，他們用異硫氰酸胍裂解液與大豆油混勻乳化，取水相，加蛋白質沉淀劑離心沉淀蛋白質，氯仿抽提，異丙醇去酚類雜質，離心棄上清，乙醇漂洗收集DNA，但結果發(fā)現(xiàn)異硫氰酸胍裂解液與大豆油互溶，因此，其不能用于大豆油DNA 的提取.

1.5 試劑盒法

試劑盒法提取油脂DNA 已經越來越普遍，也是操作最簡便、最省時省力的方法.例如油類DNA提取試劑盒，核酸共沉劑法[19]等，特別是QIamp DNA stool kit（QIagen）、Gene Elute Plant Kit（Sigma）、Nucleospin Food 和Nucleospin Plant（Macherey Nagel）已經獲得了很好的應用效果.Wizard Genomic DNA Purification Kit（Promega 公司）試劑盒方法，其主要成分為異硫氰酸胍.金紅等[20]在2004 年采用DNA 提取試劑盒（中國農科院生物技術研究所）提取大豆色拉油DNA，結果證明充分乳化、反復沉淀以富集小片段DNA、延長醇沉淀時間等措施是從精煉食用油中提取DNA 的關鍵.通過采取上述措施，可有效地從大豆色拉油中提取到DNA，以此為模板可通過PCR 擴增得到大豆特異內源基因（Lectin 基因）.

1.6 其他方法

食用油DNA 提取方法中，除以上比較傳統(tǒng)的、應用最為廣泛的幾種方法外，還有一些針對實驗情況，綜合各種改進的提取方法，也具有很好的提取效果.

1.6.1 離心柱法及手提法

離心柱法是將樹脂或硅膠膜固定在離心管中，在高鹽低pH 值條件下，DNA 選擇性吸附于離心柱內的樹脂或膜上，通過漂洗、離心等步驟，去除蛋白和多糖雜質，最后用低鹽高pH 值的洗脫緩沖液將DNA 從樹脂或硅膠膜上洗脫.Joana Costa 等[21]使用以離心柱法為原理的Nucleospin DNA 提取試劑盒從精煉油中提取到大豆DNA.

程紅梅等[22]在2007 年利用人工手提法和離心柱法提取精煉大豆油中的DNA，研究證明利用人工手提法從500 mL 大豆油中或利用離心柱法從10 mL 大豆油中均可提取獲得0.4 μg 高純度DNA.他們采用的手提法是將正己烷與油脂充分混勻乳化，沉淀離心取水相，硫酸銨沉淀過夜使蛋白質鹽析.離心取沉淀，用酚和氯仿抽提，因DNA存在于上清液中，用乙醇漂洗上清液，富集回收DNA.

1.6.2 冷凍干燥法

姚菲等[11]利用冷凍干燥法從茶籽油中提取到茶籽DNA，他們將20 mL 茶籽油與20 mL 無菌水混勻，使DNA 充分溶于水相，取水相-80 ℃冷凍過夜，然后轉至真空干燥機干燥至水分完全蒸發(fā)，加入CTAB 緩沖液沖洗，與線性丙烯酰胺、NaAc、無水乙醇混勻沉淀DNA，線性丙烯酰胺作為擔體提高DNA 提取效率，棄上清液乙醇漂洗DNA，無菌水溶解收集DNA.

1.6.3 磁珠法

磁珠法的原理是將細胞中游離的核酸分子吸附到磁性顆粒表面，蛋白質等雜質留在溶液中.在磁場作用下，磁性顆粒與液體分開，回收顆粒（即磁珠-DNA 混合物），再用洗脫液洗脫即可以得到純凈的DNA.

利用磁珠法提取的DNA 質量高、純度好，已經被應用于多種復雜及深加工食品的DNA 提取.Wu等[1]比較了Wizard 磁珠純化試劑盒和CTAB 法對大豆油DNA 的提取效率，發(fā)現(xiàn)磁珠法提取DNA 的lectin 基因擴增效率更高.Catherine 等[23]對比Wizard 試劑盒磁珠、硅膠和羥基磷灰石3 種材料吸附提取橄欖油中的DNA，結果發(fā)現(xiàn)Wizard 磁珠試劑盒法對橄欖油DNA 提取效果最好，提取的DNA 可用于微衛(wèi)星分析.磁珠法提取的DNA 相對分子質量高、純度好、質量可靠，且不需要離心、操作簡單、試劑簡單，基本達到核酸自動化提取的要求，也是未來核酸提取的發(fā)展方向.

1.6.4 擔體法

在食用油DNA提取過程中，加入適量的DNA或者RNA等物質作為擔體，可以提高DNA的提取效率，且所加擔體一般要選擇與目的DNA物種關系較遠的物種的DNA或者RNA.

覃文等[7]在用異丙醇沉淀油脂DNA 之前加入植物基因組DNA 作為擔體，獲得良好的提取效果.白立群等[24]在大豆油DNA 富集過程中，比較了以線性丙烯酰胺和鮭魚精DNA 為擔體的效果，發(fā)現(xiàn)前者富集的DNA 擴增效率更高.Giménez 等[25]在提取橄欖油DNA 過程中，也使用了線性丙烯酰胺作為擔體，且提取效果顯著.王澎等[26]在提取大豆油中DNA 過程中，在用無水乙醇沉淀DNA 時加入少量東北大豆黑衣33 號DNA 作為擔體，不僅能夠提高大豆油中DNA 的得率，而且不會影響轉基因檢測的結果，從而為轉基因深加工產品檢測過程中的DNA 提取提供了新的手段.

2 植物油脂DNA 提取方法的綜合評價

應用于植物油脂DNA 的提取方法很多，對這些方法的提取效果、成本、復雜度等方面進行全面的綜合評價可為今后的研究工作提供指導.姚菲等[11]對高鹽低pH 法、改良SDS 法、冷凍干燥法、試劑盒法、手提法進行了對比分析，欒鳳俠等[27]比較了CTAB 法和離心柱法提取精煉大豆油DNA 的效果，結果表明離心柱法操作簡單快速，提取的DNA質量高，效果顯著優(yōu)于CTAB 法.Andreas Zimmermann 等[28]比較了SDS 法、離心柱法、CTAB 法等9種DNA 提取方法在提取大豆深加工產品中的效果，并從DNA 質量和產量兩個方面進行評價.他們發(fā)現(xiàn)，離心柱法提取的DNA 質量高、易進行PCR擴增，但提取量相對較低；與之相比，CTAB、SDS 等方法雖然提取的DNA 質量低，含有PCR 抑制劑，但其提取量卻較高.Angela Di Pinto 等[29]也發(fā)現(xiàn)，試劑盒中采用的磁珠法和離心柱法與CTAB 法和SDS 法相比，含有相對較少的污染物和PCR 抑制劑.對上述植物油脂DNA 提取方法進行綜合評價，結果見表1.

雖然CTAB 法和SDS 法提取的DNA 可以滿足后續(xù)試驗要求，但其提取耗時、費力，提取過程中DNA 損失較大，且所提DNA 質量不高，有些提取試劑例如：酚、三氯甲烷有毒，損害操作者的身體健康.因此，其使用有一定的缺陷.磁珠法和離心柱法多被應用于提取試劑盒，除去了三氯甲烷、酚等有毒試劑，操作安全可靠，且提取的DNA 質量較好，用時較短、操作簡便、但成本高.冷凍干燥法及乳化法操作步驟簡單，提取過程中DNA 損失量少，富集程度較好.

表1 植物油脂DNA提取方法的綜合比較

［1］Wu Yajun，Chen Ying，Ge Yiqiang，et al.Detection of olive oil using the Evagreen realtime PCR method［J］.Eur Food Res Technol，2008，227:1117-1124.

［2］Rayda Ben Ayed，Naziha Grati-Kamoun，F(xiàn)abienne Moreau，et al.Comparative study of microsatellite profiles of DNA from oil and leaves of two Tunisian olive cultivars［J］.Eur Food Res Technol，2009，229:757-762.

［3］Innocenzo Muzzalupo，Massimiliano Pellegrino，Enzo Perri.Detection of DNA in virgin olive oils extracted from destoned fruits［J］.Eur Food Res Technol，2007，224:469-475.

［4］Innocenzo Muzzalupo，Enzo Perri.Recovery and characterisation of DNA from virgin olive oil［J］.Eur Food Res Technol，2002，214:528-531.

［5］Pauli U，Liniger M，Zimmermann A.Detection of DNA in soybean oil ［J］.Z Lebensm Unters Forsch A，1998，207:264-267.

［6］Matteo Busconi，Chiara Foroni，Massimiliano Co-rradi，et al.DNA extraction from olive oil and its use in the identification of the production cultivar［J］.Food Chemistry，2003，83:127-134.

［7］覃文，董潔，鄧鴻鈴，等.PCR 法定性檢測食用油脂中轉基因成分［J］.中國油脂，2002，27（2）：4-6.

［8］張海亮，吳亞君，陳銀基，等.食用油中DNA提取方法的研究進展［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2010（11）：128-132.

［9］王亞.食用油DNA 提取方法及轉基因成分檢測技術的研究［D］.合肥:安徽大學，2007.

［10］Hellebrand M，Nagy Marion，Morsel Jorg -Thomas.Determination of DNA traces in rapeseed oil［J］.Z Lebensm Unters Forsch A，1998，206:237-242.

［11］姚菲，周慧，吳蘇喜.茶籽油DNA 提取方法的比較［J］.糧油食品科技，2012，20（3）:17-19.

［12］易干軍，于曉英，霍合強，等.香蕉種質資源的AFLP 鑒別與分類中DNA 模板的制備［J］.果樹學報，2001，18（6）:345-348.

［13］王彩虹，王倩，戴洪義，等.蘋果基因組AFLP分析的DNA 模板的制備及技術體系的建立［J］.山東農業(yè)大學學報:自然科學版，2001，32（2）:197-200.

［14］周明芹.SDS 法和CTAB 法提取蠟梅DNA 質量的比較［J］.長江大學學報:自然科學版，2009，6（3）:42-44.

［15］裴黎，?；坻拢空?，等.改良高鹽低pH 方法提取陳舊大麻DNA 初探［J］.中國法醫(yī)學雜志，2009，24（3）：145.

［16］劉少林，靖深蓉，郭立平，等.用改進的高鹽低pH 法分離和純化棉花葉綠體及葉綠體DNA［J］.棉花學報，1997，9（5）∶239-241.

［17］Simona Pafundo，Matteo Busconi，Caterina Agrimonti，et al.Storage-time effects on olive oil DNA assessed by Amplified Fragments Length Polymorphisms［J］.Food Chemistry，2010，123:787-793.

［18］聞偉剛，崔俊霞，趙秀玲.大豆油中轉基因成分的Nested PCR 和Semi-nested PCR 檢測方法研究［J］.生物技術通報，2005（6）:84-87.

［19］鄧鴻鈴，覃芳芳，郭新東，等.食用大豆油中轉基因成分的檢測［J］.中國油脂，2007，32（8）:79-81.

［20］金紅，程奕，趙昕，等.大豆色拉油中轉基因成分檢測技術研究［J］.華北農學報，2004，19（1）：24-27.

［21］Joana Costa，Isabel Mafra，Joana S Amaral，et al.Detection of genetically modified soybean DNA in refined vegetable oils［J］.Eur Food Res Technol，2010，230:915-923.

［22］程紅梅，彭于發(fā)，金蕪軍，等.一種快速、簡便提取大豆油DNA 的方法及轉基因大豆油的檢測［J］.中國農業(yè)科學，2007，40（5）：1069-1072

［23］Breton C，Claux D，Metton I，et al.Comparative study of methods for DNA preparation from olive oil samples to identify cultivar SSR alleles in commercial samples:possible forensic applications［J］.J Agric Food Chem，2004，52:531-537.

［24］白立群，吳亞君，韓建勛.一種有效的大豆精煉油DNA 提取新方法—冷凍干燥法［J］.食品與工業(yè)發(fā)酵，2009，35（12）：155-159.

［25］Maria J Giménez，F(xiàn)ernando Pistón，Antonio Martín，et al.Application of real-time PCR on the development of molecular markers and to evaluate critical aspects for olive oil authentication［J］.Food Chemistry，2010，118:482-487.

［26］王澎，金麗晨，耿志明，等.食用大豆油中DNA 的快速提取和轉基因成分定性檢測［J］.江蘇農業(yè)學報，2008，24（6）:940-943.

［27］欒鳳俠，張洪祥，白月.食用油脂中DNA 高效快速提取方法及實時熒光PCR 檢測技術的研究［J］.中國油脂，2005，30（7）:41-43.

［28］Andreas Zimmermann，Jürg Lüthy，Urs Pauli.Quantitative and qualitative evaluation of nine different extraction methods for nucleic acids on soya bean food samples ［J］.Z Lebensm Unters Forsch A，1998，207:81-90.

［29］Angela Di Pinto，Vito Tony Forte，Maria Corsignano Guastadisegni，et al.A comparison of DNA extraction methods for food analysis［J］.Food Control，2007，18:76-80.