楊子巖+梁平+汪欽+雷小英+盧茲凡+郭晏海+向安

[摘 要] 目的：了解微體系辣根過氧化物酶（HRP）催化化學(xué)發(fā)光與其濃度的相關(guān)性。方法：將HRP經(jīng)核酸序列偶聯(lián)于毛細(xì)管微腔內(nèi)，通入微量反應(yīng)底物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)；分析HRP催化化學(xué)發(fā)光反應(yīng)與其濃度的相關(guān)性。結(jié)果：毛細(xì)管內(nèi)HRP催化1.5μL底物的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)可分成急速衰減區(qū)（3.5×10-4～1.3×10-4μg/μL）、衰減延緩區(qū)（9.7×10-5～3.3×10-5μg/μL）和發(fā)光平穩(wěn)區(qū)（1.0×10-5～6.7×10-7μg/μL）；濃度為3.5×10-4～6.7×10-6μg/μL的HRP催化化學(xué)發(fā)光衰減率RLUs/T>0且兩者線性相關(guān)（R2=0.967）。結(jié)論：分析微體系HRP濃度與化學(xué)發(fā)光衰減率（RLUs/T）的線性相關(guān)性，為微體系HRP化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)生物分子提供新策略。

[關(guān)鍵詞] 微反應(yīng)體系；辣根過氧化物酶；化學(xué)發(fā)光衰減；線性相關(guān)性

中圖分類號(hào)：R331 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2055-5200（2014）01-001-05

Doi： 10.11876/mimt201401001

Linear relationship between concentration of HRP and its chemoluminescence decays in the micro-channel system YANG Zi-yan1，LIANG Ping2，WANG Qin2，LEI Xiao-ying2，LU Zi-fan2，GUO Yan-hai2，XIANG An2.（1. The second cadets team of Pharmacy School， the Fourth Military Medical University，710032；2. Department of Pharmacogenomics， School of Pharmacy， the Fourth Military Medical University；Institute of Gene diagnosis， PLA 710032）

[Abstract] Objective： Research the relationship between the concentration of horseradish peroxidase（HRP） and its chemiluminescence （CL） decays in micro-channel system. Method： Immobilize the HRP-streptavidin into a hydroxylation capillary， the micro-channel reaction system model in this study， with a single-stranded deoxyribonucleic acid （ssDNA） sequences that modify with biotin and amidogen. The relative luminescence units （RLUs） were being detected by a portable detector after injecting micro liter scale reaction substrates. Then the relationship between concentration of HRP and RLUs was been analysis through linear regression. Result： There were three RLUs characteristic regions， content rapidly decay in 3.5×10-4～1.3×10-4μg/μL， slowly decay in 9.7×10-5～ 3.3×10-5μg/μL and steady region of 1.0×10-5～ 6.7×10-7μg/μL， basic on the rate of decay of RLUs for different HRP concentration. Most important， the rate of decay of RLUs （RLUs/T） was linearly related to the concentration of HRP （3.5×10-4～6.7×10-6μg/μL， R2=0. 967）. Conclusion： The research of the linear relationship between concentration of HRP and RLUs/T afforded novel strategy for quantitative determination of biomolecules through chemiluminescent analysis in micro-channel system.

[Key words] micro-channel system； horseradish peroxidase （HRP）； chemiluminescence decays； linear relativity

前 言

微/納米反應(yīng)體系[1-2]辣根過氧化物酶（HRP）催化化學(xué)發(fā)光檢測(cè)所需試劑/樣品用量少、反應(yīng)快且高效靈敏，在核酸[3]、抗原/抗體[4-6]等生物分子檢測(cè)中應(yīng)用廣泛。由于微體系比表面積大、反應(yīng)效率高、底物容量有限等因素，即使暉光型底物也會(huì)被快速消耗[7]。由此導(dǎo)致的化學(xué)發(fā)光衰減增加了微體系HRP濃度與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的量效關(guān)系分析難度。新型反應(yīng)底物/穩(wěn)定劑[8]、流動(dòng)注射進(jìn)樣[9]和快敏檢測(cè)器[10-13]等研究雖在一定程度上提高了微體系HPR催化化學(xué)發(fā)光穩(wěn)定性，但也增加了檢測(cè)試劑成本和儀器價(jià)格。

為研究毛細(xì)管微體系內(nèi)偶聯(lián)HRP催化化學(xué)發(fā)光衰減趨勢(shì)隨HPR濃度的變化，首先將不同濃度HRP通過核酸序列偶聯(lián)于毛細(xì)管微體系內(nèi)；再加入反應(yīng)底物后進(jìn)行HRP催化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，檢測(cè)其化學(xué)發(fā)光相對(duì)強(qiáng)度值（RLUs）；進(jìn)而分析微體系內(nèi)不同濃度HRP催化化學(xué)發(fā)光相對(duì)強(qiáng)度，及其衰減率（RLUs/T）與HRP濃度的相關(guān)性。最終為微體系化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)生物分子提供新的分析策略。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料及儀器

鏈霉親和素標(biāo)記辣根過氧化物酶（碧云天生物技術(shù)有限公司，上海），化學(xué)發(fā)光反應(yīng)底物（賽默飛世爾科技有限公司，美國），玻璃毛細(xì)管（華西醫(yī)科大學(xué)（現(xiàn)四川大學(xué)醫(yī)學(xué)院）儀器廠，成都），毛細(xì)管化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀 （天隆科技有限公司/第四軍醫(yī)大學(xué)，西安），核苷酸連接臂（NH2-5-T10-3-biotin（生工生物工程有限公司，上海），3-氨基丙基三甲氧基硅烷、戊二醛等硅烷化試劑、硝酸溶液、氫氧化鈉等化學(xué)試劑（SIGMA中國有限公司，北京），超純水（Milli-Q Century超純水系統(tǒng)，美國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法和步驟

1.2.1 毛細(xì)管微體系內(nèi)辣根過氧化物酶的固定 玻璃毛細(xì)管內(nèi)壁羥基化、氨基化、醛基化處理后，經(jīng)核苷酸序列（NH2-5-T10-3-biotin）將鏈霉親和素-HRP固定于毛細(xì)管內(nèi)壁。詳細(xì)方法參照[14， 15]。1. 玻璃毛細(xì)管（長10.0cm，內(nèi)徑300μm）經(jīng)HCl、NaOH處理進(jìn)行羥基化；2. 經(jīng)10%的3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTES）/甲苯溶液處理進(jìn)行氨基化；3. 經(jīng)10%戊二醛的磷酸緩沖液（PBS，pH7.0）進(jìn)行醛基化處理；4. 檢測(cè)端吸入20μM的5氨基/3生物素修飾寡核苷酸1.5μL（完成毛細(xì)管2cm區(qū)段標(biāo)記），室溫/避光水平放置24h；5. 以0.1%十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液和水溶液清洗，毛細(xì)管浸入5%脫脂牛奶磷酸緩沖液（PBS， pH7.2）于37℃封閉2h；6. 以1.5μL不同濃度鏈霉親和素-HRP磷酸緩沖液（PBS， pH7.2）吸入毛細(xì)管標(biāo)記端，放置30min，PBS清洗，48h內(nèi)使用。

1.2.2 毛細(xì)管微體系內(nèi)固定HRP催化化學(xué)發(fā)光 將偶聯(lián)有不同濃度（3.5×10-4～6.7×10-7μg/μL）HRP的毛細(xì)管檢測(cè)端吸入1.5μL現(xiàn)配化學(xué)發(fā)光底物A、B液等體積混合物，檢測(cè)化學(xué)發(fā)光相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度，并分析一定時(shí)期內(nèi)RULs衰減率[（RLUs1-RLUs2）/（T1-T2），簡寫為RLUs/T]。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件、Origin7.0科學(xué)繪圖軟件完成實(shí)驗(yàn)中相對(duì)發(fā)光值（RLUs）， RLUs/T分析，數(shù)據(jù)作圖處理。

2 結(jié)果與討論

毛細(xì)管微體系內(nèi)不同濃度（3.5×10-4～6.7×10-7 μg/μL）HRP催化1.5μL底物化學(xué)發(fā)光相對(duì)強(qiáng)度（RLUs）可分成急速衰減區(qū)、緩慢衰減區(qū)和平穩(wěn)區(qū)，具有不同RLUs衰減特征。

2.1 急速衰減區(qū)化學(xué)發(fā)光分析

2.2 衰減延緩區(qū)化學(xué)發(fā)光分析

毛細(xì)管微體系內(nèi)濃度處于9.7×10-5～3.3×10-5μg/μL的HRP催化化學(xué)發(fā)光相對(duì)強(qiáng)度（RLUs）特征如圖2。初始RLUs接近檢測(cè)上限（9999 RLUs），經(jīng)6min或更長時(shí)間衰減為零。與急速衰減區(qū)類似，無法從某時(shí)間點(diǎn)RLUs定量HRP濃度（圖2a）。HRP濃度與化學(xué)發(fā)光衰減率（RLUs/T）明顯線性相關(guān)（R2=0.948），如圖2b。隨著HRP濃度下降，單位時(shí)間消耗底物量開始下降，導(dǎo)致此區(qū)化學(xué)發(fā)光初始RLUs下降，反應(yīng)期延長。為此出現(xiàn)不同濃度HRP化學(xué)發(fā)光RLUs變化出現(xiàn)交錯(cuò)。但HRP濃度與發(fā)光衰減率（RLUs/T）仍線性相關(guān)。

2.3 發(fā)光平穩(wěn)區(qū)化學(xué)發(fā)光分析

毛細(xì)管微體系內(nèi)濃度處于1.0×10-5～6.7×10-7μg/μL的HRP催化化學(xué)發(fā)光相對(duì)強(qiáng)度（RLUs）特征如圖3。各濃度HRP初始RLUs和整個(gè)反應(yīng)期的RLUs水平已有明顯差異，發(fā)光反應(yīng)6.5min后的RLUs并未如急速衰減區(qū)和延緩衰減區(qū)衰減為零，各濃度HRP的RLUs也未發(fā)生交錯(cuò)（圖3a）。各濃度HRP化學(xué)發(fā)光衰減率（RLUs/T）如圖3b， HRP>6.7×10-6μg/μL時(shí)，HPR催化化學(xué)發(fā)光衰減率（RLUs/T）與其濃度仍然具有線性相關(guān)性（R2=0.948）。HRP>6.7×10-6μg/μL，即RLUs/T>0，HRP催化化學(xué)發(fā)光RLUs具有衰減趨勢(shì)（初始值 RLUsT0>反應(yīng)期T1時(shí)RLUsT1）。RLUs/T≤0，HRP催化化學(xué)發(fā)光RLUs無變化或是有上升趨勢(shì)，此時(shí)的RLUs/T與HRP濃度間無線性相關(guān)性。

2.4 全程化學(xué)發(fā)光衰減率分析

3 結(jié)論

微體系HRP化學(xué)發(fā)光分析具有試劑/樣品用量少，反應(yīng)迅速，檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)勢(shì)。在生物分子檢測(cè)方面具有廣闊應(yīng)用前景。但受腔道容量限制，所能容納的底物量十分有限。其化學(xué)發(fā)光反應(yīng)衰減迅速，特別是較高濃度HRP情況下很難直接以發(fā)光強(qiáng)度值進(jìn)行HRP定量分析。在前期研究基礎(chǔ)上，本研究以毛細(xì)管微通道為微反應(yīng)體系模型，模擬微體系HRP酶促化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)偶聯(lián)核酸序列濃度，通過分析毛微體系內(nèi)不同濃度HRP催化化學(xué)發(fā)光衰減特征，發(fā)現(xiàn)HRP濃度與化學(xué)發(fā)光衰減率（RLUs/T）在較寬濃度范圍具有線性相關(guān)性。 通過化學(xué)發(fā)光衰減率（RLUs/ T）定量檢測(cè)HRP濃度，可有效解決直接基于化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行微體系HRP定量檢測(cè)范圍窄，檢測(cè)期短等缺點(diǎn)。其不足在于，如高濃度HRP催化化學(xué)發(fā)光RLU后期波動(dòng)較大；化學(xué)發(fā)光衰減率需基于一定時(shí)期的RLUs差值與時(shí)間比值，因而增加了檢測(cè)的復(fù)雜度，也降低了檢測(cè)的時(shí)效性。但作為一種新的分析策略，它為微體系HRP化學(xué)發(fā)光分析在核酸、抗原/抗體等生物大分子定量檢測(cè)方面提供新思路。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] LIU Y，LI Y.An antibody-immobilized capillary column as a bioseparator/bioreactor for detection of escherichia colio157：h7 with absorbance measurement[J].Analytical che mistry.，2001，73（21）：5180-5183.

[2] 王瑛.核酸的非同位素化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)[J].生物工程進(jìn)展，1995，（3）：18-24.

[3] Tracy Jordan，Lee Walus，Alex Velickovic，et al.A competitive chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of rmp-7 in human blood[J].J Pharm Biomed Anal，1996，14（12）：1653-1662.

[4] Bert Gold，DANIELA Radu，Alla Balanko，et al.Diagnosis of fragile x syndrome by southern blot hybridization using a chemiluminescent probe： a laboratory protocol[J].Molecular Diagnosis，2000，5（3）：169-178.

[5] NAKANO K，NAKAO T，SCHRAM K H，et al.Urinary excretion of modified nucleosides as biological marker of rna turnover in patients with cancer and aids.[J].Clin Chim Acta，1993，218（2）：169-83.

[6] DUFFY M J.Can molecular markers now be used for early diagnosis of malignancy？[J].Clin Chem，1995，41（10）：1410-3.

[7] Girotti S， Ferri E， Ghini S， et al. Direct quantitative chemiluminescent assays for the detection of viral DNA[J]. Analytica Chimica Acta， 1991， 255（2）：387-394.

[8] TSUKAGOSHI K，JINNO N，NAKAJIMA R.Development of a micro total analysis system incorporating chemiluminescence detection and application to detection of cancer markers[J].Analytical chemist ry.，2005，77（6）：1684-1688.

[9] BOWIE R A，ACHTERBERG P E，MANTOURA F C R，et al.Determination of sub-nanomolar levels of iron in seawater using flow injection with chemiluminescence detection[J].Anal Chim Acta，1998，361（3）：189-200.

[10] HUANG bo，LI Jianjun，ZHANG le，et al.On-line chemiluminescence detection for capillary ion analysis[J]. Anal Chem，1996，68（14）：2366-2369.

[11] Friesel， Milan，Baranowski， Bogdan，Lunden， Arnold. Pressure dependence of the transition to the proton conducting phase of cshso 4 ， cshseo 4 and rbhseo 4 studied by differential scanning calorimetry[J].Solid State Ionics，1989，35（1-2）：85-89.

[12] 李紅梅，陳佳，徐斐，等.ELISA測(cè)定中TMB顯色體系的優(yōu)化及其穩(wěn)定性研究[J].生物技術(shù)通報(bào)，2010，（2）：126-130.

[13] Manfred Renz ， Christina Ku.A colorimetric method for dna hybridization[J].Nucleic Acids Res.，1984，8（12）：3435-3444.

[14] Thomas P. Whitehead，Gary H. G. Thorpe，Timothy J. N. Carter，et al.Enhanced luminescence procedure for sensitive determination of peroxidase-labelled conjugates in immunoassay[J].Nature，1983，3（05）：158-159.

[15] Zhen Guo， Richard A. Guilfoyle， Andrew J. Thiel，et al.Direct fluorescence analysis of genetic polymorphisms by hybridization with oligonucleotide arrays on glass supports[J].Nucleic Acids Res.，1994，24（22）：5456-5465.

[16] 楊維平，章竹君. 固體表面發(fā)光法測(cè)定辣根過氧化物酶的研究[J]. 陜西師大學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1995，23（2）：59-61.

參 考 文 獻(xiàn)

[1] LIU Y，LI Y.An antibody-immobilized capillary column as a bioseparator/bioreactor for detection of escherichia colio157：h7 with absorbance measurement[J].Analytical che mistry.，2001，73（21）：5180-5183.

[2] 王瑛.核酸的非同位素化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)[J].生物工程進(jìn)展，1995，（3）：18-24.

[3] Tracy Jordan，Lee Walus，Alex Velickovic，et al.A competitive chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of rmp-7 in human blood[J].J Pharm Biomed Anal，1996，14（12）：1653-1662.

[4] Bert Gold，DANIELA Radu，Alla Balanko，et al.Diagnosis of fragile x syndrome by southern blot hybridization using a chemiluminescent probe： a laboratory protocol[J].Molecular Diagnosis，2000，5（3）：169-178.

[5] NAKANO K，NAKAO T，SCHRAM K H，et al.Urinary excretion of modified nucleosides as biological marker of rna turnover in patients with cancer and aids.[J].Clin Chim Acta，1993，218（2）：169-83.

[6] DUFFY M J.Can molecular markers now be used for early diagnosis of malignancy？[J].Clin Chem，1995，41（10）：1410-3.

[7] Girotti S， Ferri E， Ghini S， et al. Direct quantitative chemiluminescent assays for the detection of viral DNA[J]. Analytica Chimica Acta， 1991， 255（2）：387-394.

[8] TSUKAGOSHI K，JINNO N，NAKAJIMA R.Development of a micro total analysis system incorporating chemiluminescence detection and application to detection of cancer markers[J].Analytical chemist ry.，2005，77（6）：1684-1688.

[9] BOWIE R A，ACHTERBERG P E，MANTOURA F C R，et al.Determination of sub-nanomolar levels of iron in seawater using flow injection with chemiluminescence detection[J].Anal Chim Acta，1998，361（3）：189-200.

[10] HUANG bo，LI Jianjun，ZHANG le，et al.On-line chemiluminescence detection for capillary ion analysis[J]. Anal Chem，1996，68（14）：2366-2369.

[11] Friesel， Milan，Baranowski， Bogdan，Lunden， Arnold. Pressure dependence of the transition to the proton conducting phase of cshso 4 ， cshseo 4 and rbhseo 4 studied by differential scanning calorimetry[J].Solid State Ionics，1989，35（1-2）：85-89.

[12] 李紅梅，陳佳，徐斐，等.ELISA測(cè)定中TMB顯色體系的優(yōu)化及其穩(wěn)定性研究[J].生物技術(shù)通報(bào)，2010，（2）：126-130.

[13] Manfred Renz ， Christina Ku.A colorimetric method for dna hybridization[J].Nucleic Acids Res.，1984，8（12）：3435-3444.

[14] Thomas P. Whitehead，Gary H. G. Thorpe，Timothy J. N. Carter，et al.Enhanced luminescence procedure for sensitive determination of peroxidase-labelled conjugates in immunoassay[J].Nature，1983，3（05）：158-159.

[15] Zhen Guo， Richard A. Guilfoyle， Andrew J. Thiel，et al.Direct fluorescence analysis of genetic polymorphisms by hybridization with oligonucleotide arrays on glass supports[J].Nucleic Acids Res.，1994，24（22）：5456-5465.

[16] 楊維平，章竹君. 固體表面發(fā)光法測(cè)定辣根過氧化物酶的研究[J]. 陜西師大學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1995，23（2）：59-61.

參 考 文 獻(xiàn)

[1] LIU Y，LI Y.An antibody-immobilized capillary column as a bioseparator/bioreactor for detection of escherichia colio157：h7 with absorbance measurement[J].Analytical che mistry.，2001，73（21）：5180-5183.

[2] 王瑛.核酸的非同位素化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)[J].生物工程進(jìn)展，1995，（3）：18-24.

[3] Tracy Jordan，Lee Walus，Alex Velickovic，et al.A competitive chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of rmp-7 in human blood[J].J Pharm Biomed Anal，1996，14（12）：1653-1662.

[4] Bert Gold，DANIELA Radu，Alla Balanko，et al.Diagnosis of fragile x syndrome by southern blot hybridization using a chemiluminescent probe： a laboratory protocol[J].Molecular Diagnosis，2000，5（3）：169-178.

[5] NAKANO K，NAKAO T，SCHRAM K H，et al.Urinary excretion of modified nucleosides as biological marker of rna turnover in patients with cancer and aids.[J].Clin Chim Acta，1993，218（2）：169-83.

[6] DUFFY M J.Can molecular markers now be used for early diagnosis of malignancy？[J].Clin Chem，1995，41（10）：1410-3.

[7] Girotti S， Ferri E， Ghini S， et al. Direct quantitative chemiluminescent assays for the detection of viral DNA[J]. Analytica Chimica Acta， 1991， 255（2）：387-394.

[8] TSUKAGOSHI K，JINNO N，NAKAJIMA R.Development of a micro total analysis system incorporating chemiluminescence detection and application to detection of cancer markers[J].Analytical chemist ry.，2005，77（6）：1684-1688.

[9] BOWIE R A，ACHTERBERG P E，MANTOURA F C R，et al.Determination of sub-nanomolar levels of iron in seawater using flow injection with chemiluminescence detection[J].Anal Chim Acta，1998，361（3）：189-200.

[10] HUANG bo，LI Jianjun，ZHANG le，et al.On-line chemiluminescence detection for capillary ion analysis[J]. Anal Chem，1996，68（14）：2366-2369.

[11] Friesel， Milan，Baranowski， Bogdan，Lunden， Arnold. Pressure dependence of the transition to the proton conducting phase of cshso 4 ， cshseo 4 and rbhseo 4 studied by differential scanning calorimetry[J].Solid State Ionics，1989，35（1-2）：85-89.

[12] 李紅梅，陳佳，徐斐，等.ELISA測(cè)定中TMB顯色體系的優(yōu)化及其穩(wěn)定性研究[J].生物技術(shù)通報(bào)，2010，（2）：126-130.

[13] Manfred Renz ， Christina Ku.A colorimetric method for dna hybridization[J].Nucleic Acids Res.，1984，8（12）：3435-3444.

[14] Thomas P. Whitehead，Gary H. G. Thorpe，Timothy J. N. Carter，et al.Enhanced luminescence procedure for sensitive determination of peroxidase-labelled conjugates in immunoassay[J].Nature，1983，3（05）：158-159.

[15] Zhen Guo， Richard A. Guilfoyle， Andrew J. Thiel，et al.Direct fluorescence analysis of genetic polymorphisms by hybridization with oligonucleotide arrays on glass supports[J].Nucleic Acids Res.，1994，24（22）：5456-5465.

[16] 楊維平，章竹君. 固體表面發(fā)光法測(cè)定辣根過氧化物酶的研究[J]. 陜西師大學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1995，23（2）：59-61.