駱光波 蘇國(guó)旗 胡 亮 羅 毅 玄 玥 方正鋒林 燕 徐盛玉 車煉強(qiáng) 吳 德

酵母細(xì)胞壁(yeast cell wall，YCW)是將啤酒酵母提取內(nèi)容物后，經(jīng)過音波震碎，多次清洗過濾，并在高溫和酸、堿處理后離心分離提取，且在特定的溫度和壓強(qiáng)下進(jìn)行噴霧干燥而得。YCW占整個(gè)細(xì)胞干重的20%～30%，其主要成分有:β－葡聚糖、甘露寡糖、糖蛋白和幾丁質(zhì)等［1］。近年來在畜禽上的研究表明，YCW及其成分不僅能促進(jìn)動(dòng)物胃腸道中有益微生物的增殖和吸附病原菌，而且能通過提高動(dòng)物機(jī)體先天性或獲得性免疫及增強(qiáng)疫苗效價(jià)等途徑來改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能［1－3］。Che等［4］研究發(fā)現(xiàn)，豬繁殖和呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染的斷奶仔豬飼糧中添加甘露寡糖能顯著降低仔豬血清中促炎性因子腫瘤壞死因子－α(TNF-α)含量，且增加抗炎性因子白細(xì)胞介素－10(IL-10)含量和血清中淋巴細(xì)胞數(shù)量，從而保障豬只健康和生產(chǎn)性能;研究還表明，YCW能通過緩解斷奶仔豬細(xì)菌感染，調(diào)節(jié)先天性免疫力以促進(jìn)仔豬斷奶后生長(zhǎng)［5］;家禽上的研究也發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加YCW能有效促進(jìn)肉雞早期腸黏膜生長(zhǎng)，提高肉雞體增重和飼料報(bào)酬［6］，且能改善肉雞免疫器官發(fā)育［7］，并降低肉雞大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量，緩解球蟲感染后的炎癥反應(yīng)［8］。母豬上的研究表明，從妊娠后期至哺乳期飼喂母豬YCW的成分改善了乳中免疫球蛋白含量和免疫細(xì)胞數(shù)量，甚至降低了木乃伊胎數(shù)［9－10］;Czech 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，妊娠后期和哺乳期飼糧中添加甘露寡糖可提高母豬抗氧化能力。盡管如此，YCW及其成分對(duì)母豬繁殖性能影響的報(bào)道仍然較少，且在整個(gè)繁殖周期(妊娠期和哺乳期)添加YCW對(duì)母豬繁殖性能、乳成分和免疫指標(biāo)尤其是胎盤免疫的影響，還未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過在母豬妊娠期和哺乳期飼糧中添加YCW，考察YCW對(duì)母豬繁殖性能、乳成分和免疫指標(biāo)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用YCW是采用新鮮啤酒酵母泥脫水分離、定向酶解、噴霧干燥等工藝生產(chǎn)而成。YCW成分及含量:甘露寡糖 24%、β－葡聚糖39%、粗蛋白質(zhì)30%、水分6%和粗灰分1%(檢測(cè)機(jī)構(gòu):中國(guó)科學(xué)院廣州化學(xué)研究所測(cè)試分析中心)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將80頭妊娠1 d的PIC母豬根據(jù)胎次、體況相近原則隨機(jī)分為2組，每組40個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭母豬，單欄飼養(yǎng)。對(duì)照組母豬飼喂基礎(chǔ)飼糧，YCW組母豬飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加0.2%YCW的試驗(yàn)飼糧。妊娠期飼糧從母豬配種后第1天開始飼喂，直至妊娠第90天，然后換喂哺乳期飼糧至哺乳期第21天試驗(yàn)結(jié)束。飼糧是參考NRC(1998)標(biāo)準(zhǔn)和《中國(guó)飼料成分及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值表》(第20版)配制成粉狀全價(jià)料的玉米－豆粕型飼糧。母豬妊娠期和哺乳期的基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。為了避免商業(yè)預(yù)混料中功能性寡糖及其類似物對(duì)試驗(yàn)的干擾，預(yù)混料由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所定制。為保證飼糧的新鮮性，所有飼糧每批次在2周內(nèi)全部飼喂完。

1.3 飼養(yǎng)管理

母豬飼養(yǎng)試驗(yàn)在四川省遂寧市高金丹育生態(tài)牧業(yè)豬場(chǎng)進(jìn)行。試驗(yàn)開始時(shí)，將在空懷舍配種后的母豬轉(zhuǎn)入妊娠舍的半漏縫地板限位欄中，舍內(nèi)保持清潔干燥，通風(fēng)良好，舍內(nèi)溫度保持恒定(25℃左右)。每天飼喂2次，分別在08:00和17:30投料，妊娠前期(妊娠1～30 d)飼喂量為2.0 kg/d，妊娠中期(妊娠 31～ 90 d)飼喂量為2.5 kg/d，妊娠后期(妊娠91 d至分娩)飼喂量為3.0 kg/d，母豬自由飲水;預(yù)產(chǎn)期前1周將試驗(yàn)?zāi)肛i轉(zhuǎn)入徹底消毒的產(chǎn)仔舍，飼養(yǎng)于全漏縫地板限位欄中，舍內(nèi)保持清潔干燥，通風(fēng)良好，舍內(nèi)溫度保持恒定(25℃左右)，母豬自由飲水。臨產(chǎn)前用0.1%的高錳酸鉀水溶液將其外陰和乳房清洗消毒，并將每個(gè)乳頭疏通。分娩當(dāng)天不喂料，分娩后第 1 天喂 2.0 kg，以后每天增加 0.5 kg，直到第 7天后讓母豬自由采食。自由采食階段每天4次飼喂并保持食槽內(nèi)飼糧略有剩余。哺乳仔豬采用紅外保溫?zé)舯Ｅ?，?天開始教槽，每天清洗母豬和仔豬食槽。母豬分娩后仔豬在組內(nèi)交叉寄養(yǎng)，保證每窩仔豬數(shù)基本一致(10或11頭)，其他飼養(yǎng)管理遵循豬場(chǎng)管理制度;每天記錄溫度、濕度，觀察并記錄母豬健康狀況。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets(air-dry basis) %

續(xù)表1

1.4 樣品采集與制備

1.4.1 血清

分別于母豬妊娠第1和90天及分娩當(dāng)天24 h內(nèi)、哺乳第10和21天08:00空腹采血。每頭母豬耳緣靜脈采血10 mL于一次性真空采血管中，靜置 10～15 min，離心 15 min(3 000 r/min)，取血清分裝于1.5 mL離心管中，于－20℃冷凍保存待測(cè)。

1.4.2 乳樣

分別于母豬分娩當(dāng)天24 h內(nèi)、哺乳第10和21天08:00從空腹母豬前、中、后乳頭均等收集乳樣30 mL左右，裝于帶蓋離心管內(nèi)，采集常乳時(shí)每頭母豬耳緣靜脈注射1～2個(gè)單位催乳素，樣品迅速在－20℃冰箱保存待測(cè)。

1.5 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.5.1 母豬繁殖性能測(cè)定

在母豬分娩12 h之內(nèi)，記錄每頭母豬的總產(chǎn)仔數(shù)、活產(chǎn)仔數(shù)、死胎數(shù)、木乃伊胎數(shù)、仔豬初生個(gè)體重、活產(chǎn)仔豬窩重以及宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩仔豬發(fā)生率等;宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩仔豬發(fā)生率定義為出生體重低于900 g的仔豬數(shù)與該組所有活產(chǎn)仔豬數(shù)的比值。哺乳第21天時(shí)記錄每窩仔豬數(shù)和個(gè)體重。

1.5.2 母豬常乳成分測(cè)定

母豬哺乳第10和21天常乳中的乳蛋白、乳脂、乳糖、粗灰分以及非脂固形物的含量用MILK YWAY－CP2快速乳成分自動(dòng)分析儀檢測(cè)。

1.5.3 母豬分娩時(shí)血清和初乳中的免疫球蛋白含量測(cè)定

母豬分娩時(shí)血清及初乳中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白 G(IgG)、免疫球蛋白 M(IgM)含量采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法，通過BIORAD Model 680酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定，試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.5.4 母豬胎兒胎盤組織先天性免疫基因表達(dá)測(cè)定

母豬胎兒胎盤組織樣品的總RNA的提取操作流程根據(jù)Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen)的使用說明書進(jìn)行。樣品總RNA的質(zhì)量和純度檢測(cè)方法分別用1%的瓊脂糖凝膠電泳和Beckman DU－800核酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)。目的基因和內(nèi)參基因采用SYBR一步法反應(yīng)試劑盒(DRR086A，日本TaKa-Ra)在ABI 7900HT實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)儀上進(jìn)行測(cè)定。目的基因和內(nèi)參基因引物序列見表2。反應(yīng)體系為10μL:一步法反應(yīng)試劑混合液(含酶)5.6μL，上下游引物各 0.4 μL 以及含100 ng DNA模板的水溶液4μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參數(shù):42℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s，95℃變性5 s，60℃退火34 s。反應(yīng)共40個(gè)循環(huán):包括95℃變性15 s，60℃退火60 s，95℃反應(yīng)15 s。擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線特異性擴(kuò)增分析。采用－△△Ct(2－△△Ct)法［12］，以內(nèi)參基因 β－肌動(dòng)蛋白的擴(kuò)增效率來校正目的基因的表達(dá)。

1.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2007進(jìn)行初步整理，并采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)母豬繁殖性能、常乳成分以及母豬胎兒胎盤基因表達(dá)量結(jié)果進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析;宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩仔豬發(fā)生率采用卡方檢驗(yàn)(χ2)分析;以 P＜0.05 表示差異顯著，0.05＜P＜0.10為差異趨勢(shì)性判斷標(biāo)準(zhǔn);結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

表2 目的基因和內(nèi)參基因引物序列Table 2 The primer sequences of target and reference genes

2 結(jié) 果

2.1 飼糧中添加YCW對(duì)母豬繁殖性能的影響

由表3可知，飼喂含YCW飼糧的母豬分娩時(shí)死胎數(shù)(P=0.03)和宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩仔豬發(fā)生率(P=0.01)顯著低于對(duì)照組，仔豬斷奶窩重和窩增重提高(P=0.05);其他繁殖性能指標(biāo)(總產(chǎn)仔數(shù)、活產(chǎn)仔數(shù)、活產(chǎn)仔豬窩重、仔豬初生重、斷奶仔豬數(shù))在2組間差異不顯著(P＞0.05);但是，飼喂含YCW飼糧的仔豬斷奶體重和仔豬體增重均有改善的趨勢(shì)(P＜0.10)。

表3 飼糧中添加YCW對(duì)母豬繁殖性能的影響Table 3 Effects of dietary YCW on reproductive performance of sows

2.2 飼糧中添加YCW對(duì)母豬常乳成分的影響

由表4可知，相比對(duì)照組，YCW組母豬哺乳第10天乳中乳蛋白和非脂固形物含量均顯著提高(P＜0.05)，乳糖含量提高了 13.06%(P=0.01);哺乳第21天乳中乳糖含量仍有提高的趨勢(shì)(P=0.08)。

表4 飼糧中添加YCW對(duì)母豬常乳成分的影響Table 4 Effects of dietary YCW on milk composition of sows %

2.3 飼糧中添加 YCW 對(duì)母豬分娩時(shí)初乳和血清中免疫球蛋白含量的影響

由表5可知，YCW組母豬分娩時(shí)血清和初乳中IgA、IgG和IgM含量均與對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05)。

表5 飼糧中添加YCW對(duì)母豬分娩時(shí)初乳和血清中免疫球蛋白含量的影響Table 5 Effects of dietary YCW on immunoglobulin contents in colostrum and serum of sows ng/mL

2.4 飼糧中添加 YCW 對(duì)妊娠母豬胎兒胎盤先天性免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖1可知，飼喂含YCW飼糧的母豬胎兒胎盤中 Toll樣受體－2(TLR-2)(P=0.05)和白細(xì)胞介素－1β(IL-1β)(P=0.05)基因表達(dá)量均低于對(duì)照組，且腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子－6(TRAF-6)基因表達(dá)量有降低的趨勢(shì)(P=0.10)。

3 討論

隨著選育和配種技術(shù)的提高，母豬的繁殖性能明顯改善，但集約化飼養(yǎng)條件下的母豬健康問題已成為影響繁殖性能的重要因素。妊娠母豬產(chǎn)仔數(shù)提高的同時(shí)，死胎數(shù)、木乃伊胎數(shù)和宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩仔豬發(fā)生率也隨之增加。引起死胎和仔豬發(fā)育受阻的原因有非傳染性因素(如產(chǎn)程長(zhǎng)、產(chǎn)仔數(shù)多、產(chǎn)仔較大、母豬胎次較高、體況較差等)［13－14］和傳染性因素(如 PRRSV、弓形體感染等)［15］，而這些原因或多或少均與母豬自身免疫力有關(guān)。本試驗(yàn)中飼喂含YCW飼糧的母豬死胎數(shù)和宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩仔豬發(fā)生率顯著低于對(duì)照組，這可能與YCW通過改善腸道免疫屏障功能促進(jìn)母體健康有關(guān)，而維持母豬的健康水平對(duì)于胎兒和初生仔豬的存活十分重要［16］。哺乳動(dòng)物腸黏膜主要通過物理屏障和免疫屏障阻止或降低有害菌進(jìn)入腸上皮細(xì)胞進(jìn)而影響機(jī)體健康，且腸道結(jié)構(gòu)的完整性也與機(jī)體健康密不可分。過去的研究表明，YCW可通過甘露寡糖特異結(jié)合含有甘露寡糖受體的1型菌毛的致病菌(如大腸桿菌和沙門氏菌等)，避免或降低這類致病菌黏附腸道上皮細(xì)胞進(jìn)入機(jī)體誘發(fā)疾病［1，10］;YCW 也可通過維持或改善腸道結(jié)構(gòu)的完整性，增強(qiáng)黏膜免疫能力和抗感染能力［6，17－20］。有意思的是，Ryan等［3］給斷奶仔豬飼喂β－葡聚糖時(shí)發(fā)現(xiàn)β－葡聚糖改善了脂多糖刺激下的仔豬肝臟細(xì)胞因子(Toll樣受體－4、白細(xì)胞介素－6和白細(xì)胞介素－10)基因表達(dá)模式，認(rèn)為β－葡聚糖能通過影響腸道先天性免疫延伸至全身免疫系統(tǒng);這些結(jié)果為本試驗(yàn)考察YCW影響母豬胎兒胎盤免疫提供了理論依據(jù)。

母豬胎兒胎盤既是胎兒生長(zhǎng)發(fā)育必需的營(yíng)養(yǎng)和廢物交換的重要器官，也是抵抗外界有毒有害物質(zhì)侵襲胎兒的免疫屏障［21－22］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加YCW影響了胎盤先天性免疫相關(guān)Toll樣受體信號(hào)途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)，從而影響母豬胎兒胎盤先天性免疫反應(yīng)。Toll樣受體是固有免疫中一類重要的病原體模式識(shí)別受體，在先天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，可識(shí)別一種或多種特定的微生物病原體或病毒。TRAF-6是TLR-2、4和9共享的胞內(nèi)下游信號(hào)分子，Toll樣受體受到外源病原菌或病毒刺激后，通過TRAF-6將胞外刺激信號(hào)傳遞給核因子－κB，并啟動(dòng)細(xì)胞核內(nèi)炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［23－24］。本試驗(yàn)中，TLR-2 和TRAF-6基因的低表達(dá)，提示了YCW具有改善先天性免疫反應(yīng)，抑制炎癥發(fā)生的能力;同時(shí)，對(duì)母豬胎兒胎盤促炎癥因子IL-1β基因的檢測(cè)也表明，YCW組母豬胎兒胎盤IL-1β基因表達(dá)顯著低于對(duì)照組，抑制炎癥過度發(fā)生。因此，胎兒胎盤免疫力的改善有利于維持胎兒正常的生長(zhǎng)發(fā)育，從而降低死胎和木乃伊胎的產(chǎn)生。盡管如此，本試驗(yàn)飼糧中添加YCW并沒有影響母豬體液免疫，母豬血清IgA、IgG和IgM的含量在2組間沒有顯著差異。Zhao等［18］在仔豬上的研究也表明，飼糧中添加YCW成分并沒有顯著改善仔豬斷奶后第1、14和28天血清IgG含量和淋巴細(xì)胞數(shù)量，這可能與YCW的組成、β－葡聚糖和甘露寡糖的分子質(zhì)量、構(gòu)象、聚合度、添加劑量、動(dòng)物等因素有關(guān)。

圖1 飼糧中添加YCW對(duì)母豬胎兒胎盤先天性免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.1 Effects of dietary YCW on fetal placental innate immunity-related gene expression of sows

本試驗(yàn)中，母豬妊娠期和哺乳期飼喂含YCW飼糧還顯著提高了仔豬斷奶窩重和窩增重。哺乳開始時(shí)各組之間仔豬數(shù)及仔豬體重均一致，在斷奶仔豬數(shù)一致的前提下，仔豬斷奶窩重的增加與體增重的提高密切相關(guān)。然而，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，YCW組較高的仔豬斷奶窩重和體增重可能與母豬乳成分的改善有關(guān)。Bradley［25］在妊娠母豬和哺乳母豬飼糧中添加YCW成分甘露寡糖時(shí)就發(fā)現(xiàn)，甘露寡糖能改變母豬初乳和常乳中白細(xì)胞比例，也能改善母豬后代仔豬的免疫系統(tǒng)，提高仔豬斷奶后第1周的生長(zhǎng)性能，提示了YCW在提高斷奶仔豬成活率和體增重方面的應(yīng)用效果。事實(shí)上，本試驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，飼喂含YCW飼糧的母豬常乳中乳蛋白、乳糖和非脂固形物含量顯著高于對(duì)照組，說明YCW組的仔豬能攝入較高質(zhì)量的母乳，從而有利于仔豬生長(zhǎng)潛力的發(fā)揮。盡管如此，飼糧中添加YCW改善母豬乳成分的具體機(jī)制還不清楚，我們認(rèn)為可能與乳腺健康的改善有關(guān)。Newman［26］研究發(fā)現(xiàn)，YCW 來源的甘露寡糖能增加腸絨毛膜表面杯狀細(xì)胞的擴(kuò)散，并通過刺激肝臟分泌甘露糖結(jié)合蛋白來影響免疫系統(tǒng)，這種蛋白能結(jié)合細(xì)菌和引起宿主免疫系統(tǒng)的補(bǔ)體產(chǎn)生，以增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答能力，降低致病菌等感染母豬乳房的幾率，維持乳腺健康。

4 結(jié)論

母豬妊娠期和哺乳期飼糧中添加YCW能顯著降低母豬死胎數(shù)和宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩仔豬發(fā)生率，這可能與YCW改善母豬胎兒胎盤先天性免疫力有關(guān);同時(shí)，妊娠期和哺乳期飼糧中添加YCW還能通過改善母豬乳成分，提高哺乳期仔豬生長(zhǎng)性能，但具體作用機(jī)理仍有待研究。

致謝:感謝唐山拓普生物科技有限公司為本試驗(yàn)提供YCW樣品。

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