朱旭燦，盧 毅，張朝鳳，許翔鴻，張 勉

(中國(guó)藥科大學(xué) 生藥學(xué)研究室，江蘇 南京 211198)

紫菀為菊科紫菀屬植物紫菀(AstertataricusL.)的干燥根和根莖，為常用中藥材，又名青菀、紫菀草、還魂草根等，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，主產(chǎn)于河北安國(guó)和安徽亳州。具有潤(rùn)肺下氣、消痰止咳之功效，主治痰多喘咳、新久咳嗽、勞嗽咳血等癥[1]。紫菀化學(xué)成分豐富，主要為萜及其苷，其中三萜皂苷是其主要特征性成分，環(huán)肽astins是該屬比較有特色的一類化學(xué)成分，是紫菀抗腫瘤活性的主要成分。2006年，譚寧華[2]等對(duì)植物環(huán)肽進(jìn)行了詳細(xì)的綜述并進(jìn)行了分類，紫菀中的環(huán)肽歸為菊科類型環(huán)肽，至今此類型環(huán)肽只在該種中發(fā)現(xiàn)。目前已從紫菀中分離得到的環(huán)肽類化合物共有17個(gè)，其中主要為15個(gè)環(huán)五肽astins A-I[3-8]和astins K-P[10]，兩個(gè)環(huán)四肽tataricins A-B[11]；直連肽7個(gè)，其中6個(gè)直鏈五肽為asterinin A-F[12,13]，1個(gè)直鏈二肽aurantiamide acetate[14]。為了更好地理解及開(kāi)發(fā)此類化合物，本文以紫菀astins為主要對(duì)象，對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)、生物活性、構(gòu)效關(guān)系方面的研究綜述如下。

1 化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.1 紫菀肽類的氨基酸組成

紫菀肽類主要為環(huán)五肽或直鏈五肽，氨基酸組成較固定，為脯氨酸(Pro)、L-α-氨基丁酸(Abu)、L-絲氨酸(Ser)、L-β-苯丙氨酸(β-Phe)和L-allo-蘇氨酸(allo-Thr)；環(huán)四肽仍由以上5個(gè)氨基酸組成，只是環(huán)合的部分為4個(gè)氨基酸；astin P中出現(xiàn)L-Ava，這也是Ava殘基首次在菊科類型環(huán)肽中出現(xiàn)[10]。直鏈二肽為苯丙氨酸衍生的肽酰胺類物質(zhì)。

1.2 紫菀環(huán)肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)

迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的紫菀環(huán)肽共17個(gè)，15個(gè)為環(huán)五肽，即astins A-I[3-8]和astins K-P[10]；2個(gè)為環(huán)四肽tataricins A-B[11]，其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1、圖2，氨基酸序列見(jiàn)表1。

1.3 紫菀直鏈肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)

已發(fā)現(xiàn)的直鏈肽數(shù)量較少，含量也較低，其中6個(gè)為五肽asterinin A-F[12-13](astin J[9]與asterinin D結(jié)構(gòu)相同，圖3)，1個(gè)直鏈二肽aurantiamide acetate[14-15]。氨基酸序列見(jiàn)表2。直鏈五肽可能是環(huán)五肽的水解產(chǎn)物。

圖1 紫菀中15個(gè)環(huán)五肽化合物的結(jié)構(gòu)

圖2 紫菀中2個(gè)環(huán)四肽類化合物Tataricins A和B的結(jié)構(gòu)

表1 紫菀中環(huán)肽的氨基酸序列

圖3 紫菀直鏈肽類化合物的結(jié)構(gòu)

表2 紫菀中的直鏈肽的氨基酸序列

1.4 已檢測(cè)到但尚未分離得到的紫菀肽類

劉曉東等[16]運(yùn)用HPLC/DAD/ESI-MS方法對(duì)紫菀毒性組分Fr-2進(jìn)行了成分分析。檢測(cè)并鑒定了其中35個(gè)成分，其中包括28個(gè)五肽類物質(zhì)(18個(gè)環(huán)肽，10個(gè)直鏈肽)，其中10個(gè)環(huán)肽(astin K和astin L后被分離得到[10])和2個(gè)直鏈肽結(jié)構(gòu)為首次報(bào)道。紫菀中環(huán)肽類成分結(jié)構(gòu)多樣，值得進(jìn)一步的探究。

2 生物活性

2.1 抗腫瘤活性

Allo蘇氨酸雖然在自然界中罕見(jiàn)，卻是生物活性肽的重要組成部分。Astins A-C都含有氯原子和allo Thr，并具有一個(gè)特征的反式肽鍵。采用計(jì)算細(xì)胞總體積的方法對(duì)astins抗小鼠腹水腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了研究發(fā)現(xiàn)其顯示出中等強(qiáng)度的抗腫瘤活性，Astin A、B的活性約強(qiáng)過(guò)astin C 10倍[3]。astin B對(duì) BGC-823細(xì)胞(IC50 19.2 μg/mL)、astin C對(duì)HCT-116和BGC-823細(xì)胞也顯示出細(xì)胞毒活性，IC50分別為13.4 μg/mL 、3.3 μg/mL[10]。用勞森試劑(Lawesson’s reagents)對(duì)astin B和astin C的骨架進(jìn)行修飾[17]，得到的硫代的衍生物均比相應(yīng)的astins表現(xiàn)出更高的抗腫瘤活性。

2.2 抗氧化

Ng T B[19]等在對(duì)紫菀中的紫菀酮、表木栓醇、槲皮素、山萘酚、Aurantiamide acetate等進(jìn)行抗氧化研究時(shí)發(fā)現(xiàn)， Aurantiamide acetate對(duì)超氧自由基的生成有一定的媒介抑制活性，對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用則稍弱。

2.3 免疫抑制

2011年，沈燕、徐會(huì)敏[20]等首次發(fā)現(xiàn)環(huán)肽astin C在1×10-5mg/mL時(shí)無(wú)細(xì)胞毒作用，卻有強(qiáng)烈的免疫抑制活性，可觸發(fā)線粒體凋亡通路，選擇性誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，和環(huán)孢菌素A作用強(qiáng)度相似而作用機(jī)制不同。

2.4 肝毒性

紫菀在臨床應(yīng)用中一直被認(rèn)為是安全的，也沒(méi)有任何關(guān)于紫菀副作用的報(bào)道。然而，張建偉[21]等研究紫菀、款冬配伍規(guī)律時(shí)，發(fā)現(xiàn)小鼠口服紫菀水煎液顯示出一定毒性，包括肝毒性和急性毒性，較大劑量下能夠引起嚴(yán)重的肝損傷。

王蕾等[22]對(duì)紫菀的毒性部位進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其Fr-2部位對(duì)大鼠可造成急性肝損傷并致死。對(duì)Fr-2部位進(jìn)行分析，主要化學(xué)成分為萜類及其皂苷、肽類、香豆素、蒽醌及黃酮類有機(jī)酸及酚類等[14,23-24]，asitns是紫菀中一類特色成分，其中astin C由于和環(huán)氯素具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為是肝毒性成分之一[4]。環(huán)氯素可導(dǎo)致嚴(yán)重的肝毒并作用迅速[25]。astin C和環(huán)氯素都具有雙氯脯氨酸結(jié)構(gòu)，具有相同的氨基酸序列，主要的區(qū)別在于astin C的Abu殘基和順式脯氨酸鍵在環(huán)氯素中被替換成Ser和一個(gè)反式的脯氨酸鍵[26]。從這個(gè)角度上來(lái)說(shuō)，astins可能是紫菀中主要的毒性成分。

為了進(jìn)一步了解紫菀的毒性成分，劉曉東等[16]運(yùn)用HPLC/DAD/ESI-MS方法對(duì)紫菀毒性組分Fr-2進(jìn)行了成分分析。檢測(cè)并鑒定了其中35個(gè)成分，其中包括28個(gè)五肽類物質(zhì)(18個(gè)環(huán)肽，10個(gè)直鏈肽)，占到了總成分的87%(環(huán)肽為71.2%，直鏈肽為15.8%)，其他7個(gè)化合物為酚類物質(zhì)。這個(gè)結(jié)果提示，肽類，尤其是環(huán)肽可能是Fr-2部位及紫菀的主要毒性成分。是否astins就是引起肝毒性的主要成分及其損傷機(jī)制，目前正在研究當(dāng)中。

3 構(gòu)效關(guān)系

3.1 Astin的環(huán)狀骨架結(jié)構(gòu)

環(huán)肽Astin A、B、C等具有抗腫瘤活性[3]，而直鏈astins在體外實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有顯示對(duì)S180細(xì)胞的抑制活性[9]，這提示astins的天然環(huán)狀骨架對(duì)其抗腫瘤活性的發(fā)揮具有重要作用。為了闡釋Astins環(huán)狀結(jié)構(gòu)與抗腫瘤的關(guān)系，F(xiàn)ilomena Rossi[28]等選擇性地合成了一系列Astins類似物并用人類NPA 細(xì)胞(乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞)進(jìn)行活性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中環(huán)狀的peptideⅡ和peptideⅢ顯示出了抗腫瘤活性，并且，peptideⅢ的IC50值與Astins A 、 B相當(dāng)，而它們水解開(kāi)環(huán)后的產(chǎn)物及其他合成出的直鏈肽未表現(xiàn)出抗腫瘤的活性。這進(jìn)一步證實(shí)了Astins的環(huán)狀結(jié)構(gòu)對(duì)抗腫瘤活性起著關(guān)鍵性的作用。

3.2 雙氯脯氨酸結(jié)構(gòu)

在發(fā)現(xiàn)的15種環(huán)肽Astins中，只有具順式3,4雙氯脯氨酸結(jié)構(gòu)的Astin A、B、C具有抗癌活性[3]。在很多文獻(xiàn)中，許多學(xué)者把具有雙氯脯氨酸結(jié)構(gòu)作為抗腫瘤活性的重要因素納入考慮范圍。為了闡明astins A、B、C的抗腫瘤活性和雙氯脯氨酸結(jié)構(gòu)存在的關(guān)系，對(duì)astins A、B、C進(jìn)行脫氯，并用S180細(xì)胞對(duì)其脫氯的衍生物進(jìn)行活性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有的脯氨酸脫氯的衍生物在10.0 mg/(kg·d)的劑量下均未表現(xiàn)出抗腫瘤活性[29]。另外，Itokawa H[30]等通過(guò)體外抗KB細(xì)胞(鼻咽癌細(xì)胞)及小鼠體內(nèi)抗S180細(xì)胞和P388淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了雙氯脯氨酸結(jié)構(gòu)在astins抗腫瘤活性的發(fā)揮中起到了重要作用。

3.3 肽環(huán)骨架的柔順性

肽環(huán)骨架的柔順性也是影響抗腫瘤活性的一大因素。為了增加肽環(huán)的柔順性，常常采用硫化的方法。將Astin B的肽鍵進(jìn)行硫化可削弱分子內(nèi)氫鍵的影響，增強(qiáng)肽環(huán)骨架的柔順性，硫化的Astin B顯示出了更強(qiáng)的抗癌活性[29]。為了進(jìn)一步解釋構(gòu)象的柔順性對(duì)活性的影響， Cozzolino R等[27]合成了一系列Astins類似物并對(duì)其進(jìn)行活性研究，其中脯氨酸脫氯并硫化的peptideⅢ抗NPA細(xì)胞的活性與Astins A 、B相當(dāng)。這也是首次發(fā)現(xiàn)的不具順式雙氯脯氨酸結(jié)構(gòu)的卻和astin A、B活性相當(dāng)?shù)腶stins類似物。

3.4 肽環(huán)中Thr2和Ser3殘基間氫鍵的影響

通過(guò)對(duì)Astin B晶體的結(jié)構(gòu)分析，Cozzolino R 等[27]發(fā)現(xiàn)Astin B 肽環(huán)中Thr2和Ser3殘基間的分子內(nèi)氫鍵作用是促使Astin B結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的原因，并提出這種結(jié)構(gòu)與抗腫瘤活性密切相關(guān)。然而，該說(shuō)法只是假設(shè)，缺乏有效實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)佐證。

4 結(jié)語(yǔ)和展望

近年來(lái)植物環(huán)肽的研究取得長(zhǎng)足進(jìn)展，但目前主要的研究目的還是從中尋找具有生物活性的先導(dǎo)物。紫菀中的環(huán)肽作為其特有的一類成分，以其新穎的結(jié)構(gòu)和所具有的生物活性引起了人們極大的興趣。對(duì)其進(jìn)行深入的研究，不論是從分類學(xué)意義上、還是尋找活性先導(dǎo)物及紫菀的用藥安全性上都具有重要的意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典:一部[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:322.

[2] Tan N H, Zhou J. Plant cyclopeptides[J]. Chemical reviews,2006,106(3):840-895.

[3] Morita H, Nagashima S, Takeya K, et al. Astins A and B, antitumor cyclic pentapeptides fromAstertataricus[J]. Chemical & pharmaceutical bulletin,1993,41(5):992.

[4] Kosemura S, Ogawa T, Totsuka K. Isolation and Structure of Asterin, a new halogenated cyclic penta-peptide fromAstertataricus[J]. Tetrahedron letters,1993,34(8):1291-1294.

[5] Morita H, Nagashima S, Takeya K, et al. Structures and conformation of antitumour cyclic pentapeptides, astins A, B and C, fromAstertataricus[J].Tetrahedron,1995,51(4):1121-1132.

[6] Morita H, Nagashima S, Shirota O, et al. Two novel monochlorinated cyclic pentapeptides, astins D and E fromAstertataricus[J].Chemistry Letters,1993(11):1877-1880.

[7] Morita H, Nagashima S, Takeya K, et al. Cyclic Peplides from Higher Plants. Part 8. Three Novel Cyclic Pentapeptides, Astins F, G and H fromAstertataricus[J].Heterocycles-Sendai Institute of Heterocyclic Chemistry,1994,38(10):2247-2252.

[8] Morita H, Nagashima S, Takeya K, et al. Cyclic peptides from higher plants. II. A novel cyclic pentapeptdie with a β-hydroxy-γ-chloroproline fromAstertataricus[J].Chem Lett,1994,42:2009-2010.

[9] Morita H, Nagashima S, Takeya K, et al. Structure of a new peptide, astin J, fromAstertataricus[J].Chemical & pharmaceutical bulletin,1995,43(2):271-273.

[10] Xu H M, Zeng G Z, Zhou W B, et al. Astins K-P, six new chlorinated cyclopentapeptides fromAstertataricus[J].Tetrahedron,2013,69(37):7964-7969.

[11] Xu H M, Yi H, Zhou W B, et al. Tataricins A and B, two novel cyclotetrapeptides fromAstertataricus, and their absolute configuration assignment[J].Tetrahedron Letters,2013,54(11):1380-1383.

[12] Dongliang C, Yu S, Hartman R, et al. Oligopeptides fromAstertataricus[J].Phytochemistry,1994,36(4):945-948.

[13] Cheng D L,Shao Y,Hartmann R,et al.New pentapeptides fromAstertataricus[J].Phytochemistry,1996,41(1):225-227.

[14] 盧艷花,舒躍中.紫菀化學(xué)成分的研究[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),1998,29(2):97-99.

[15] Wang ZT, Lu YH, Ye WC, et al. A dipeptide isolated fromAstertataricus[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences,1999,8:171-172.

[16] Liu XD, Cao PP, Zhang CF, et al. Screening and analyzing potential hepatotoxic compounds in the ethanol extract of Asteris Radix by HPLC/DAD/ESI-MS technique[J].Journal of pharmaceutical and biomedical analysis,2012,67:51-62.

[17] Morita H, Nagashima S, Takeya K, et al. Solution forms of antitumor cyclic pentapeptides with 3,4-dichlorinated proline residues, astins A and C, fromAstertataricus[J].Chemical & pharmaceutical bulletin,1995,43(8):1395-1397.

[18] Morita H, Nagashima S, Takeya K, et al. Thionation of an antitumour cyclic pentapeptide, astin B, fromAstertataricus[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,1995,5(7):677-680.

[19] Ng T B, Liu F, Lu Y, et al. Antioxidant activity of compounds from the medicinal herbAstertataricus[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology,2003,136(2):109-115.

[20] Shen Y, Luo Q, Xu H, et al. Mitochondria-dependent apoptosis of activated T lymphocytes induced by astin C, a plant cyclopeptide, for preventing murine experimental colitis[J].Biochemical pharmacology,2011,82(3):260-268.

[21] 張建偉,竇昌貴,張勉,等.紫菀、款冬及其配伍的毒性及藥效學(xué)研究[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2007,12(4):405-411.

[22] 王蕾,張勉,金晶,等.紫菀的毒性部位及對(duì)小鼠的急性肝損傷作用研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2010,21(10):2526-2529.

[23] 侯海燕,陳立,董俊興.紫菀化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)[J].中國(guó)藥學(xué)雜志.2006,41(3):161.

[24] 王國(guó)艷,吳弢,林平川,等.紫菀酚類化學(xué)成分的研究[J].中國(guó)中藥雜志,2004,28(10):946-948.

[25] Terao K, Ito E, Tatsuno T. Liver injuries induced by cyclochlorotine isolated from Penicillium islandicum[J]. Archives of toxicology,1984,55(1):39-46.

[26] Schumacher K K, Hauze D B, Jiang J, et al. First total synthesis of astin G[J].Tetrahedron letters,1999,40(3):455-458.

[27] Cozzolino R, Palladino P, Rossi F, et al. Antineoplastic cyclic astin analogues kill tumour cells via caspase-mediated induction of apoptosis[J].Carcinogenesis,2005,26(4):733-739.

[28] Rossi F, Zanotti G, Saviano M, et al. New antitumour cyclic astin analogues: synthesis, conformation and bioactivity[J].Journal of Peptide Science,2004,10(2):92-102.

[29] Morita H, Nagashima S, Takeya K, et al. Cyclic peptides from higher plants. Part 21 . Thionation of the antitumour cyclic pentapeptides, astins A, B and C, fromAstertataricus[J].J Chem Soc,Perkin Trans 1,1995(18):2327-2331.

[30] Saviano G, Benedetti E, Cozzolino R, et al. Influence of conformational flexibility on biological activity in cyclic astin analogues[J].Peptide Science,2004,76(6):477-484.