段愛紅 孫志強(qiáng) 吳小華 楊麗萍 馮軍玲

卵巢上皮性癌(epithelial ovarian cancer，EOC)占卵巢惡性腫瘤的90%，是生殖道惡性腫瘤中死亡率最高的疾病。EOC屬于對化療中-高度敏感腫瘤，目前的標(biāo)準(zhǔn)治療是徹底的細(xì)胞減滅術(shù)和術(shù)后6～8個療程的含鉑類藥物的聯(lián)合化療。常用鉑類藥物是順鉑(cisplatin，DDP)屬重金屬類化療藥物，與DNA結(jié)合形成雙鏈交叉聯(lián)接，形成DNA加合物。70%的患者停止化療后逐漸復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)后的卵巢癌以化療治療為主，但多數(shù)病人呈現(xiàn)化療耐藥，晚期患者5年生存率長期徘徊在30%左右［1］。通常認(rèn)為EOC起源于正常卵巢的表面上皮(normal ovarian surface epithelium，NOSE)，NOSE每月隨卵子排出進(jìn)行上皮的更新和修復(fù)，但其干細(xì)胞至今尚未分離鑒定［14］。EOC的治療含多療程化療，通常采用間斷的DDP最大可耐受劑量(maximum tolerated dose，MTD)方式。所以，復(fù)發(fā)腫瘤本身就是化療藥物選擇后的瘤細(xì)胞群，以CSC繁殖形成的細(xì)胞為主?；熕幬锏淖饔每蓪?dǎo)致敏感腫瘤死亡，并使殘存腫瘤細(xì)胞的繁殖特性發(fā)生改變，理解化療藥物隊敏感腫瘤細(xì)胞的殺傷效率和對殘存腫瘤細(xì)胞的繁殖力的影響，對改善預(yù)后、延緩復(fù)發(fā)、提高腫瘤治療效果意義重大。本課題通過免疫組化方法檢測卵巢癌組織中 CD117，Nestin，CD133和Ki67的表達(dá)，探索其臨床意義，結(jié)合臨床資料加以分析，為卵巢癌的診斷、預(yù)后及治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 卵巢癌患者60例，所有患者術(shù)前均未接受放療、化療或激素治療，初次手術(shù)方式為卵巢癌分期手術(shù)或腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)，病理診斷確診為上皮性卵巢癌，術(shù)后輔以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療。年齡31～66歲;其中漿液性腺癌25例，宮內(nèi)膜樣癌24例，粘液性腺癌11例。根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO，2009年)［2］手術(shù)-病理分期:Ⅰ ～ Ⅱ期13例，Ⅲ ～ Ⅳ期 37例。組織分化程度低級別相當(dāng)于FIGO高中分化(G1/G2)38例、高級別相當(dāng)于低分化(G3)22例。參照2010年版 NCCN(national comprehensive cancer network)卵巢癌臨床實踐指南對鉑耐藥和鉑敏感的定義，60例卵巢癌患者中19例鉑耐藥患者(即在初次接受含鉑化療停藥6個月內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā))41例為鉑敏感患者(即在初次接受含鉑化療停藥6個月及以上出現(xiàn)復(fù)發(fā))。20例卵巢正常組織來源:因子宮肌瘤等子宮良性病變行手術(shù)，術(shù)中取正常卵巢組織。

1.2 方法 采用免疫組化方法 S-P，檢測 CD117、CD133及Nestin的表達(dá)，按試劑盒說明書操作。以PBS代替一抗為陰性對照，陽性對照片由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司提供。生存期及標(biāo)準(zhǔn):隨訪終止日期為2014年2月1日?？偵嫫?over all survival)指從手術(shù)確診卵巢癌當(dāng)日起至患者死亡日或隨訪終止日仍存活或失訪的患者為統(tǒng)計學(xué)上的截尾數(shù)據(jù)(censored data)。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn) CD117陽性細(xì)胞為胞膜或胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，Nestin陽性細(xì)胞為胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，CD133陽性細(xì)胞為胞核或胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，Ki67主要表達(dá)于細(xì)胞核中。判定標(biāo)準(zhǔn)［3］:無棕黃色顆粒為(－);染色弱、染色范圍＞50%或染色強(qiáng)、染色范圍25% ～50%者為(+);染色強(qiáng)，染色范圍 ＞75%者為(+++);(+)和(+++)之間為(++)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗及Spearman檢驗，不同生存曲線的顯著性用Log-rank統(tǒng)計學(xué)方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD117、Nestin、CD133 和 Ki67 在卵巢癌及正常卵巢組織中的表達(dá) CD117的染色陽性為胞膜內(nèi)或胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，CD133陽性細(xì)胞為胞核或胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，Nestin的染色陽性為胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，Ki67主要表達(dá)于細(xì)胞核中。CD117、Nestin、CD133和Ki67在卵巢癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于正常卵巢組織(P＜0.05)。見圖1、表1。

圖1 CD117，Nestin，CD133和Ki67在卵巢癌組織中的表達(dá)

表1 不同卵巢組織中CD117，Nestin，CD133和Ki67的表達(dá)例(%)

2.2 CD117、Nestin、CD133 和 Ki67 的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 CD117、Nestin、CD133和Ki67在漿液性、粘液性、子宮內(nèi)膜樣卵巢癌中的陽性表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。在不同的卵巢癌組織分化程度中，低分化組CD117、Nestin、CD133表達(dá)的陽性率明顯高于高中分化組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);在FIGOⅠ期～Ⅱ期卵巢癌中CD117、Nestin、CD133表達(dá)的陽性率明顯低于Ⅲ～Ⅳ期，兩者相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，CD117、Nestin、CD133 在化療耐藥組的陽性表達(dá)率明顯高于化療敏感組，二者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，Ki67在卵巢癌組織分化程度、殘余病灶及CA125水平中陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 CD117、Nestin、CD133和Ki67表達(dá)與卵巢上皮性癌臨床病理關(guān)系 例(%)

2.3 CD117、Nestin、CD133 的表達(dá)與卵巢癌患者生存率的關(guān)系 55例卵巢癌患者有詳細(xì)的隨訪資料，5例失訪，平均隨訪時間39個月。以CD117表達(dá)量的中位值(0.648)為界將卵巢癌患者分為高、低表達(dá)2組，繪制 Kaplan-Meier曲線，比較2組生存率的差異。Log-rank檢驗顯示，CD117高表達(dá)組(＞0.648)患者生存率低，低表達(dá)組(＞0.648)患者生存率高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。同樣方法，分析Nestin、CD133的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系，得到類似的結(jié)果(P＜0.05)。見圖2 ～4。

圖2 CD117在低表達(dá)和高表達(dá)組的生存曲線

圖3 Nestin在低表達(dá)和高表達(dá)組的生存曲線

圖4 CD133在低表達(dá)和高表達(dá)組的生存曲線

3 討論

卵巢上皮性癌為女性生殖器官常見的惡性腫瘤，死亡率居各類婦科腫瘤之首，成為嚴(yán)重威脅婦女生命和健康的惡性腫瘤［4］。近年來隨著對腫瘤生物學(xué)特性的研究進(jìn)展，腫瘤干細(xì)胞理論越來越被重視，該理論認(rèn)為腫瘤組織中存在一小群具有自我更新、無限增殖和多項分化潛能的腫瘤干細(xì)胞，這些特異性的細(xì)胞促使腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和惡性轉(zhuǎn)移。因此腫瘤干細(xì)胞的存在直接影響腫瘤治療的敏感性和臨床預(yù)后。由于對卵巢癌所起源的正常卵巢表面上皮中干細(xì)胞表型相關(guān)信息的缺乏，研究人員只能依靠已知的與卵巢表面上皮相關(guān)的干細(xì)胞標(biāo)志物去鑒定及分離卵巢癌干細(xì)胞。目前，用于分離和鑒定卵巢癌干細(xì)胞較多的標(biāo)志物有CD133、CD44/CD117、CD44/MYD88、Lgr5 和 ALDH1［5］。本研究選取其中的 CD117、Nestin 和 CD133作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，同時結(jié)合Ki67觀察其在卵巢癌中的表達(dá)，探討與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的關(guān)系。

CD117(又名c-kit)，原癌基因kit的受體，是造血干細(xì)胞的標(biāo)志物，其表達(dá)異?？纱碳つ[瘤細(xì)胞的持續(xù)增殖和抗凋亡信號的失控，有利于腫瘤的惡性增殖［6］。在惡性黑色素瘤，肥大細(xì)胞性白血病，精元細(xì)胞瘤，胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤，乳腺癌等疾病的發(fā)生過程中均起到了非常重要的作用，作為腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物越來越受到重視。

本研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌中CD117的表達(dá)明顯高于正常卵巢組織，而且隨臨床期別的增加CD117表達(dá)率也逐漸增加，提示CD117可能參與卵巢癌的發(fā)展過程，其可能的機(jī)制是由于CD117的過度激活，觸發(fā)其下游信號途徑的活化，最終誘導(dǎo)細(xì)胞的異常增殖、分化和抗凋亡信號的失控，從而導(dǎo)致了卵巢癌的發(fā)生。本研究同時探討了CD117對于卵巢癌患者術(shù)后生存時間的影響，通過Kaplan-Meier生存曲線分析CD117高表達(dá)組患者生存率較低表達(dá)組生存率低(P＜0.05)，由此我們推測卵巢癌組織中CD117高表達(dá)的患者可能為化療耐藥型，生存率下降，影響預(yù)后;CD117低表達(dá)患者可能為化療敏感型，生存率較CD117高表達(dá)組明顯升高。這些結(jié)果為進(jìn)一步深入研究卵巢癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物均有重要意義，對臨床深入研究卵巢癌的靶向治療可能有重要的參考價值。

Nestin是第Ⅵ類中間絲蛋白，目前被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定，最新研究發(fā)現(xiàn)Nestin在多種惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，如惡性膠質(zhì)瘤［7］，胃腸道間質(zhì)腫瘤［8］，睪丸間質(zhì)腫瘤［9］，惡性黑色素瘤［10］，Nestin 表達(dá)強(qiáng)度和腫瘤惡性程度和預(yù)后呈正相關(guān)。例如在黑色素瘤中，惡性度越高Nestin表達(dá)越強(qiáng)，在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的腫瘤中Nestin表達(dá)更強(qiáng);惡性度低的大腦膠質(zhì)瘤Nestin表達(dá)強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于惡性度高的。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法首次檢測了Nestin在不同惡性程度卵巢癌中的表達(dá)。徐亮等［11］研究Nestin和CD133作為干細(xì)胞標(biāo)志物在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)中顯示:隨著膠質(zhì)瘤腫瘤級別增加，腫瘤標(biāo)記物Nestin表達(dá)也增加，Kaplan-Meier生存曲線分析表明:Nestin高表達(dá)組患者生存率低，低表達(dá)組生存率高，表明Nestin表達(dá)越高，這與本研究結(jié)論一致。提示Nestin可作為判斷卵巢癌惡性程度及預(yù)后的一種指標(biāo)，Nestin表達(dá)越高，腫瘤組織中CSCs的數(shù)量越多，腫瘤的惡性程度就越高，在卵巢癌疾病發(fā)展過程中表現(xiàn)出耐藥，其預(yù)后越差，生存率越低，從而預(yù)測腫瘤的惡性程度及患者的生存率，為卵巢癌的診斷和預(yù)后判斷提供幫助。

CD133是一種細(xì)胞膜糖蛋白，由CD133/prom-1基因編碼，目前是卵巢癌腫瘤干細(xì)胞最常見的標(biāo)志物，是造血干細(xì)胞、多種正常組織和腫瘤干細(xì)胞的的標(biāo)志物。

在卵巢癌的研究中，F(xiàn)errandina等［12］觀察了CD133在正常卵巢組織、卵巢癌組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示原代卵巢癌CD133+CK7+細(xì)胞的克隆形成能力均高于CD133+CK7+細(xì)胞，而正常卵巢組織中CD133的表達(dá)顯著低于卵巢癌組織。同時也有研究證實CD133+的卵巢癌腫瘤細(xì)胞與CD133－細(xì)胞比較具有較強(qiáng)的體內(nèi)成瘤能力，且CD133+細(xì)胞對于化療藥物的敏感性顯著低于CD133細(xì)胞［13］。本實驗結(jié)果顯示CD133在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)高于正常卵巢組織，提示CD133可能在腫瘤惡性表型的轉(zhuǎn)化中發(fā)揮了重要作用。同時，我們進(jìn)一步分析了CD133在卵巢上皮性癌中的表達(dá)，結(jié)果表明CD133蛋白的表達(dá)隨著FIGO分期的進(jìn)展而顯著升高，提示CD133可能參與了卵巢癌的進(jìn)展;低分化組的CD133蛋白的表達(dá)顯著高于高分化組，即腫瘤組織學(xué)分級越高，分化越差，CD133蛋白的表達(dá)越高，提示檢測CD133蛋白可能用于判斷腫瘤的惡性程度。

綜上所述，CD117、Nestin和CD133作為卵巢癌腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物可能參與了卵巢癌的發(fā)生發(fā)展，其在不同分期卵巢癌中的差異性表達(dá)可作為評判腫瘤惡性程度的指標(biāo)，利用CD117、Nestin和CD133在卵巢癌組織中的表達(dá)與腫瘤惡性程度病理級別及患者生存率之間的關(guān)系，可為臨床提供診治依據(jù)，聯(lián)合監(jiān)測Ki67可為預(yù)測卵巢癌療效及預(yù)后的指標(biāo)。

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