李 月，李 喆

(1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，遼寧 沈陽 110001;2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院藥品管理部，吉林 長春 130041)

款冬花為菊科植物款冬花(TussilagofarfaraL.)的花蕾。味辛、微苦，性溫。具有潤肺下氣、止咳化痰的功效，主治新久咳嗽、喘咳痰多、勞嗽咳血[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，款冬花有支氣管解痙、中樞興奮、鎮(zhèn)痛抗炎、抗血小板聚集等作用，款冬二醇、蘆丁、槲皮素等黃酮類化合物為其有效成分[2]。大孔吸附樹脂用于中藥制藥技術(shù)已日趨成熟，在中藥材有效部位的富集方面具有明顯優(yōu)勢。作者在此進行了大孔吸附樹脂富集款冬花總黃酮的研究。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

款冬花藥材購于沈陽天益堂，經(jīng)鑒定為菊科植物款冬花(TussilagofarfaraL.)的花蕾，粉碎過40目篩，80 ℃烘干，備用。

蘆丁對照品(批號：100080-200306),中國食品藥品檢定研究院；D101、HPD300、HPD600型大孔吸附樹脂，河北滄州寶恩化工有限公司；X-5、AB-8型大孔吸附樹脂，天津南開大學(xué)化工廠；其它試劑均為分析純；水為純化水。

紫外可見分光光度計，恒溫水浴振蕩器，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 方法

1.2.1 樣品液制備與總黃酮含量測定

取款冬花粉于錐形瓶中，用60%乙醇按液料比20∶1(mL∶g，下同)浸泡10 min，微波處理(微波功率300 W，處理時間9 min)，過濾，減壓濃縮，用石油醚萃取至醚層無色(除去葉綠素)，即得款冬花樣品液(其中總黃酮含量為2.76 mg·mL-1)，備用。

用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH系統(tǒng)發(fā)生顯色反應(yīng)，用分光光度計在500 nm波長處測定款冬花總黃酮含量[3]。以蘆丁為對照品繪制標準曲線，回歸方程為：A=9.7511c+0.0065(R=0.9993)，線性范圍為13.2～66.0 μg·mL-1。

1.2.2 樹脂的篩選

將15 mL預(yù)處理過的不同型號濕樹脂置于具塞錐形瓶中，各加樣品液30 mL，置于25 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩24 h，過濾，測定濾液中總黃酮含量，計算靜態(tài)吸附量。再將已吸附款冬花總黃酮的樹脂置于具塞錐形瓶中，各加入60%乙醇30 mL，置于25 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩2 h，過濾，測定解吸液中總黃酮含量，計算解吸率。

式中：m0為吸附前樣品液的總黃酮含量；m1為吸附后濾液的總黃酮含量；V為樹脂體積；m2為解吸液的總黃酮含量。

1.2.3 AB-8大孔吸附樹脂富集款冬花總黃酮的工藝參數(shù)優(yōu)化

將4 BV的款冬花樣品液以3 BV·h-1的上樣流速通過樹脂柱(1 BV約為20 mL)，動態(tài)吸附40 min；用4 BV純化水以1 BV·h-1的速度沖洗至幾乎無色，再用4 BV 60%乙醇以4 BV·h-1的速度洗脫至幾乎無色，收集洗脫液，回收乙醇，計算洗脫液中款冬花總黃酮的純度及回收率。

通過單因素實驗，依次考察上樣量(上樣速度為1 BV·h-1)、上樣速度、吸附時間、純化水用量、純化水沖洗速度、乙醇體積分數(shù)、乙醇用量對總黃酮純度和回收率的影響，確定優(yōu)化的富集工藝。

2 結(jié)果與討論

2.1 樹脂篩選結(jié)果(表1)

表1 5種大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附、解吸參數(shù)

由表1可見，AB-8型大孔吸附樹脂對款冬花總黃酮的靜態(tài)吸附量和解吸率均最高。因此，選用AB-8型大孔吸附樹脂富集款冬花總黃酮。

2.2 AB-8型大孔吸附樹脂富集款冬花總黃酮的影響因素

2.2.1 上樣量

實驗發(fā)現(xiàn)，上樣量為2 BV、3 BV、4 BV、5 BV、6 BV時，總黃酮的純度分別為70.5%、71.3%、72.1%、68.7%、65.8%，回收率分別為88.0%、89.2%、92.8%、74.3%、66.1%?？梢?，上樣量為4 BV時，AB-8型大孔吸附樹脂對款冬花總黃酮的富集效果最好，且避免了樹脂過飽和造成的黃酮成分流失。因此，確定適宜的上樣量為4 BV。

2.2.2 上樣速度

實驗發(fā)現(xiàn)，上樣速度為1 BV·h-1、2 BV·h-1、3 BV·h-1、4 BV·h-1時，總黃酮的純度分別為72.0%、72.3%、72.5%、64.5%，回收率分別為92.3%、91.3%、92.0%、79.8%?？梢?，上樣速度過快，款冬花總黃酮成分流失較多；上樣速度過慢，操作時間又太長。因此，確定適宜的上樣速度為3 BV·h-1。

2.2.3 吸附時間

實驗發(fā)現(xiàn)，吸附時間為20 min、40 min、60 min時，總黃酮的回收率分別為77.6%、89.3%、84.4%?？梢?，吸附時間過短，黃酮成分未充分吸附；吸附時間過長，出現(xiàn)“死吸附”現(xiàn)象。因此，確定適宜的吸附時間為40 min。

2.2.4 純化水用量

實驗發(fā)現(xiàn)，純化水用量為2 BV、4 BV、6 BV時，總黃酮的純度分別為56.2%、72.2%、72.4%，回收率分別為87.7%、90.6%、79.3%?？梢?，水用量過少，雜質(zhì)未完全除去，影響洗脫液中總黃酮的純度；水用量過多，易造成黃酮成分損失。因此，綜合考慮富集效果、總黃酮的回收率和節(jié)約用水等因素，確定適宜的純化水用量為4 BV。

2.2.5 純化水沖洗速度

實驗利用黃酮類化合物與氯化鋁反應(yīng)生成黃色熒光絡(luò)合物的性質(zhì)[4]，對水洗液進行薄層檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純化水沖洗速度為2 BV·h-1、4 BV·h-1、6 BV·h-1時，薄層檢測均無異常，但沖洗速度達8 BV·h-1時，水洗液的薄層檢測呈淡黃色熒光，說明出現(xiàn)了黃酮成分的流失。因此，為了既保證總黃酮的回收率又節(jié)約操作時間，確定適宜的純化水沖洗速度為6 BV·h-1。

2.2.6 洗脫劑乙醇體積分數(shù)

實驗發(fā)現(xiàn)，洗脫劑乙醇的體積分數(shù)為40%、50%、60%、70%、80%時，總黃酮的回收率分別為51.1%、78.1%、91.4%、90.1%、89.3%，乙醇體積分數(shù)為60%～80%時無明顯差異。因此，確定適宜的洗脫劑為60%乙醇。

2.2.7 洗脫劑乙醇用量

實驗發(fā)現(xiàn)，洗脫劑乙醇用量為3 BV、4 BV、5 BV時，總黃酮的回收率分別為77.3%、92.6%、93.2%。綜合考慮生產(chǎn)成本與生產(chǎn)周期，確定適宜的洗脫劑乙醇用量為4 BV。

2.3 AB-8型大孔吸附樹脂的穩(wěn)定性

將處理好的AB-8型大孔吸附樹脂濕法裝柱，取4 BV的款冬花樣品液以3 BV·h-1的流速上柱吸附40 min，用4 BV的純化水以6 BV·h-1的速度沖洗雜質(zhì)，再用4 BV的60%乙醇洗脫，收集洗脫液，測定總黃酮的純度和回收率，重復(fù)進行以上操作。結(jié)果，進行到第7次實驗時，總黃酮的純度和回收率均大幅下降，分別為48.7%和70.3%。表明，AB-8型大孔吸附樹脂可以連續(xù)使用6次，之后需要進行再生處理。

2.4 討論

1)預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)，洗脫劑的洗脫速度不同時的富集效果無統(tǒng)計學(xué)差異。

2)有文獻報道，樹脂柱的徑高比也是影響富集效果的因素之一。但受實驗室儀器安裝等具體條件的限制，本實驗未能對樹脂柱徑高比進行考察。

3 結(jié)論

通過靜態(tài)吸附、解吸的篩選實驗，確定富集款冬花總黃酮的樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。通過單因素實驗，以富集后總黃酮的純度和回收率為指標，確定款冬花總黃酮適宜的富集工藝為：將4 BV款冬花樣品液以3 BV·h-1的速度上樣，吸附40 min，用4 BV的純化水以6 BV·h-1的速度沖洗雜質(zhì)，再用4 BV的60%乙醇洗脫總黃酮。該樹脂穩(wěn)定性良好，可連續(xù)使用6次。此富集工藝簡單、可行，富集所得款冬花總黃酮的純度和回收率均較高，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：312.

[2] 呂培霖，李成義，翟麗芳.款冬花化學(xué)成分和藥理作用研究進展[J].中國藥房，2007，18(12)：948-949.

[3] 宋宏新，楊芳.大孔吸附樹脂分離貫葉連翹中黃酮類化合物[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2012，31(5)：645-647.

[4] 騰坤，阮洪生，武子敬，等.大孔吸附樹脂純化藤梨根中總黃酮工藝優(yōu)選[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2013,32(1)：63-65.