魏大為連總強(qiáng)吳旭東王發(fā)新肖 偉張利平

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 蘭州 730070; 2. 寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)研究所, 銀川 750001; 3. 寧夏漁業(yè)工程技術(shù)研究中心, 銀川 750001)

磁珠富集法篩選蘭州鲇微衛(wèi)星分子標(biāo)記

魏大為1,2,3連總強(qiáng)1,2,3吳旭東1,2,3王發(fā)新1,3肖 偉2,3張利平1

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 蘭州 730070; 2. 寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)研究所, 銀川 750001; 3. 寧夏漁業(yè)工程技術(shù)研究中心, 銀川 750001)

蘭州鲇(Silurus lanzhouensis)又名黃河鯰, 隸屬于鲇形目(Siluriformes)、鲇科(Siluridea)、鲇屬(Silurus), 是我國黃河中上游特有的大型經(jīng)濟(jì)魚類。肉質(zhì)細(xì)嫩、少刺、味道鮮美, 具有很高的營養(yǎng)價(jià)值, 俗有“黃河鯰魚活人參”之稱[1]。但由于過度捕撈、水利工程等因素, 蘭州鲇野生種群數(shù)量日益減少, 已被《中國物種紅色名錄》列為瀕危物種[2]。

微衛(wèi)星(Microsatellite)是一類廣泛存在于真核生物基因組中具有高度變異性的簡單重復(fù)DNA序列[3], 它們多以2—6個(gè)堿基序列為核心單位, 串聯(lián)排列, 序列長度為幾十至幾百個(gè)堿基[4]。由于微衛(wèi)星具有共顯性、多態(tài)性豐富、雜合度高、基因型可快速簡便檢測等優(yōu)點(diǎn)[5], 目前廣泛應(yīng)用于物種遺傳結(jié)構(gòu)研究[6,7]、遺傳多樣性分析[8]、遺傳圖譜構(gòu)建[9]和QLT定位分析[10]等領(lǐng)域。

2003年寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)研究所攻克蘭州鲇人工繁育技術(shù)難題, 已是具有規(guī)?；m州鲇繁育能力的國家級(jí)現(xiàn)代種業(yè)示范場, 促進(jìn)了這一特有、珍稀魚類資源保護(hù)和大面積養(yǎng)殖。但目前所養(yǎng)殖的蘭州鲇絕大部分是未經(jīng)選育的自然群體, 遺傳分化較大, 個(gè)體生長差異大, 對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境適應(yīng)性差。因此, 充分了解蘭州鲇種群結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性現(xiàn)狀, 開展種質(zhì)資源保護(hù)和人工選育工作十分必要。目前, 關(guān)于蘭州鲇的研究主要集中在苗種繁殖、生理生化、營養(yǎng)需求、毒理抗性等方面[11—13], 利用分子標(biāo)記方法對(duì)其種群結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性的研究較少。本研究應(yīng)用磁珠富集法篩選蘭州鲇微衛(wèi)星分子標(biāo)記, 旨在為開展蘭州鲇種質(zhì)資源保護(hù)、遺傳圖譜構(gòu)建及人工選育等工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

采集寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)研究所全國現(xiàn)代漁業(yè)種業(yè)示范場(106°22′2″ E, 38°34′ 47″ N)30尾蘭州鲇尾鰭樣本, 無水乙醇–20℃保存。接頭序列(MseI A: 5′-TACTCAGGACTC AT-3′; MseI B: 5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′)、MseI-N引物(5′-GATGAGTCCTGAGTAA (N) -3′)、生物素標(biāo)記探針(AC)12、(AG)12、(ATC)8、(AAAC)8、(AGAT)8均由上海生物工程有限公司合成, pMD19-T載體、鏈霉親和素磁珠購自promega公司, 感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α為寧夏水產(chǎn)研究所實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 特定大小DNA片斷篩選

采用苯酚-氯仿法提取蘭州鲇基因組DNA, 取20 μL 100 ng/μL基因組DNA加入5 U的內(nèi)切酶MseI 37℃、酶切3.5h, 1.8%瓊脂糖凝膠電泳回收200—800 bp DNA片段。將終濃度為20 μmol/L的MseI A和MseI B接頭等比例混合, 94℃變性8min, 緩慢降至室溫制備成連接接頭; 連接酶切回收片段, 16℃過夜, 連接混合液稀釋1/10倍, 以MseIN為引物PCR預(yù)擴(kuò)增, 獲取特定大小DNA片段。

1.3 生物素探針雜交

取上述PCR產(chǎn)物24 μL, 94℃下變性8min, 加入70 μL 65℃雜交緩沖液6×SSC+0.1%SDS和6 μL生物素標(biāo)記探針, 65℃反應(yīng)30min, 冷卻至室溫加入300 μL TEN100buffer混勻, 4℃保存。

1.4 磁珠富集

取1—2 mg鏈霉親和素磁珠, 加入300 μL TEN100buffer室溫洗滌3次, 每次3min。磁力架固定磁珠棄去上清液,用60 μL TEN100buffer重懸磁珠后加入雜交液, 室溫反應(yīng)30min, 待磁珠吸附完畢, 固定磁珠移去雜交混合液。300 μL TEN1000室溫洗滌3次, 洗去與磁珠非特異性結(jié)合的DNA片段, 再用300 μL的0.2×SSC+0.1%SDS室溫洗滌磁珠3次。最后加入80 μL TE, 94℃變性8min, 固定磁珠吸取上清液, 獲取單鏈目的DNA片段。

1.5 單鏈DNA片段PCR擴(kuò)增

以單鏈目的DNA片段為模板, PCR擴(kuò)增獲得雙鏈目的DNA片段。PCR反應(yīng)體系20 μL: MseI-N引物

(10 μmol/L) 1 μL, 10×Buffer(含Mg2+) 2 μL, dNTPs

(10 μmol/L) 1.6 μL, 模板DNA 20 ng, Taq聚合酶(5 U/μL) 0.2 μL, 去離子水10.2 μL。PCR反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性3min, 94℃變性1min, 53℃退火1min, 72℃延伸1min, 經(jīng)N(N=25、30、34、36)個(gè)循環(huán), 確定最佳循環(huán)次數(shù)。72℃延伸5min, 擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存。

1.6 T-載體連接、轉(zhuǎn)化與陽性克隆篩選

PCR產(chǎn)物回收純化, 連接到pMD19-T載體中, 轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α菌株, 涂布于含Amp的LB固體培養(yǎng)基上, 構(gòu)建蘭州鲇微衛(wèi)星富集文庫。富集文庫經(jīng)藍(lán)白斑篩選, 挑取陽性克隆至含有Amp的LB液體培養(yǎng)基37℃過夜。以菌液為模板, 以M13(+)、M13(–)通用引物和不含有生物素的探針序列作為雙引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測, 挑取目的條帶(100—800 bp)中含有兩條或兩條以上條帶的陽性克隆測序。

1.7 引物設(shè)計(jì)、篩選與多態(tài)性分析

測序結(jié)果用軟件 MEGA4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹去掉同源序列; 用 SSRHunter設(shè)定參數(shù)(重復(fù)元件的核苷酸數(shù)最多為6個(gè), 最少重復(fù)次數(shù)為4次), 查找微衛(wèi)星序列, 并人工檢查核對(duì)后提交 GenBank; 挑選兩側(cè)翼區(qū)均足夠長的微衛(wèi)星序列, 設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μL: 10×Buffer(含Mg2+)3.0 μL, dNTPs(10 μmol/L)2.0 μL, 模板DNA 20 ng, 上游、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL, Taq聚合酶(5 U/μL)0.2 μL, 無菌超純水補(bǔ)足總體積至25 μL。PCR反應(yīng)程序: 94℃預(yù)變性5min, 94℃變性30s, 退火30s,退火溫度依引物而異, 72℃延伸1min, 34個(gè)循環(huán); 72℃延伸10min, 4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物先經(jīng)瓊脂糖凝膠法檢驗(yàn), 再用8%聚丙烯酰胺凝膠銀染法檢測, 利用pBR322顯示微衛(wèi)星條帶的大小。利用Popgene version1.32(http//genepop. curtin.edu.au/)統(tǒng)計(jì)各微衛(wèi)星標(biāo)記等位基因的數(shù)目、基因雜合度和多態(tài)信息含量。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星片段富集

本研究選用內(nèi)切酶 MseI對(duì)基因組 DNA進(jìn)行酶切,酶切片段均勻彌散, DNA已完全被酶切。PCR預(yù)擴(kuò)增特定DNA片段在30個(gè)循環(huán)后電泳檢測, 結(jié)果顯示在200—800 bp處出現(xiàn)Smear區(qū)域(圖1), 說明可滿足構(gòu)建微衛(wèi)星DNA文庫的需要。

圖1 基因組DNA、酶切與預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 The electrophoresis of genomie DNA, digested by enzyme MseI and PCR amplification

圖2 PCR擴(kuò)增單鏈目的片段不同循環(huán)次數(shù)電泳結(jié)果Fig. 2 The electrophoresis by different PCR cycles

以MseI-N為引物, 分別設(shè)置單鏈目的DNA片段25、30、34和 36個(gè)循環(huán)擴(kuò)增, 結(jié)果顯示 36個(gè)循環(huán)獲得雙鏈目的片段效果最佳。親和捕捉的目的片段主要集中在200—500 bp左右, 而800 bp以上的較少, 與酶切回收片段基本相符(圖2)。將富集的微衛(wèi)星DNA片段與pMD19-T載體連接, 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α菌株進(jìn)行克隆, 經(jīng)藍(lán)白斑初步篩選獲得含有微衛(wèi)星序列(電泳結(jié)果是兩條或者兩條以上的條帶)的500個(gè)陽性克隆(圖3), 隨機(jī)選取300個(gè)克隆測序分析。

圖3 微衛(wèi)星序列陽性克隆電泳檢測結(jié)果Fig. 3 Representing recombined positive clones containing microsatellite sequence

2.2 微衛(wèi)星富集文庫鑒定

測序結(jié)果依據(jù) Linda，et al.[14]關(guān)于微衛(wèi)星劃定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行微衛(wèi)星文庫鑒定, 結(jié)果顯示 158個(gè)(52.7%)克隆符合微衛(wèi)星界定標(biāo)準(zhǔn), 序列比對(duì)去掉同源序列共獲得 121個(gè)微衛(wèi)星序列(GenBank 中序列登錄號(hào): KJ008462-KJ008582)。依據(jù)Weber[5]制定的標(biāo)準(zhǔn), 121個(gè)微衛(wèi)星序列中完美型62個(gè)(51.2%)、非完美型27個(gè)(22.3%)、混合型為 32個(gè)(26.5%)(圖 4); 重復(fù)次數(shù)主要分布在 16—20次,重復(fù)30次以下的比例為80.16%(圖5)。

圖4 蘭州鲇微衛(wèi)星序列特征分布Fig. 4 Characteristic of microsatellite types in S. lanzhouensis

圖5 蘭州鲇微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)的頻率分布Fig. 5 Percentage of microsatellite repeat numbers in S. Lanzhouensis

2.3 微衛(wèi)星標(biāo)記篩選與多態(tài)性分析

根據(jù)側(cè)翼序列長短, 在 121個(gè)微衛(wèi)星序列中共設(shè)計(jì)出90對(duì)引物。隨機(jī)選取其中 30對(duì), 進(jìn)行蘭州鲇微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)篩選與多態(tài)性分析。30個(gè)蘭州鲇試驗(yàn)樣本中篩選出 17對(duì)多態(tài)性引物, 每對(duì)引物等位基因數(shù)(Na) 2—6個(gè)(平均 3.47), 觀測雜合度(Ho) 0.0972—0.7326(平均 0.4118), 期望雜合度(He)0.1862—0.8483(平均0.6103), 多態(tài)信息含量(PIC) 0.1638—0.7945(平均0.5345), 詳見表1。

3 討論

磁珠富集法制備微衛(wèi)星文庫具有快速、便捷、效率高、成本低、所獲微衛(wèi)星質(zhì)量高等特點(diǎn), 是一種值得推薦的微衛(wèi)星制備方法[15]。但是操作過程中的一些因素會(huì)影響篩選微衛(wèi)星的效率, 優(yōu)化親和素磁珠與生物素探針-微衛(wèi)星復(fù)合體的吸附條件, 使其高效捕捉是構(gòu)建文庫的關(guān)鍵。磁珠的平衡、洗滌時(shí)間和洗滌溫度都要嚴(yán)格控制, 整個(gè)操作過程要輕柔, 以達(dá)到最佳的分離效率。

Kruglyak, et al.[16]的研究發(fā)現(xiàn), 在大多數(shù)真核生物中微衛(wèi)星重復(fù)單元主要是二核苷酸(AC/TG)n, 兩堿基重復(fù)序列類型的多態(tài)性最高, 其次為三堿基, 再次為四堿基。李齊發(fā)等[17]選擇(CA)12、(CAG)8、(CCG)8和(TTTC)8探針富集牦牛(Bos grunniens)微衛(wèi)星, Barker, et al.[18]以(CT)n、(AG)n、(CA)n、(AAT)n和(ATT)n探針富集黃花柳(Salix burjatica)微衛(wèi)星, 魯翠云等[19]選擇(CA)15、(AG)12、和(AAG)8探針富集鳙魚(Aristichthys nobilis)微衛(wèi)星, 劉臻等[20]以(AC)8、(CT)8、(AT)7、(GATA)8和(GATT)7探針富集黃顙魚(Pseudobagrus fulvidraco)微衛(wèi)星, 本研究用(AC)12、(AG)12、(ATC)8、(AAAC)6和(AGAT)6混合探針富集蘭州鲇微衛(wèi)星, 均成功篩選到各種類型的多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記。因此在今后的研究中使用多種探針來篩選增加微衛(wèi)星種類是可行的。

本研究篩選到的微衛(wèi)星序列, 除探針使用的 AC、AG、ATC、AAAC和AGAT重復(fù)單元外, 還發(fā)現(xiàn)GTCT、TTCT、TTCC、TGTC、CTCA、TTTC重復(fù)序列的微衛(wèi)星類型。121個(gè)微衛(wèi)星序列中完美型62個(gè)(51.2%)、非完美型 27個(gè)(22.3%)、混合型為 32個(gè)(26.5%); 這一結(jié)果與白鰱(Hypophthalmichtys molitrix)[21]、哲羅魚(HuchotaiMen Pallas)[22]、黃顙魚(Pseudobagrus fulvidraco)[20]以及大黃魚(Pseudosciaena croce)[23]的微衛(wèi)星序列特點(diǎn)基本相符, 其中蘭州鲇微衛(wèi)星中, 非完美型和混合型比例略高; Santibanez, et al.[24]研究表明生物生存環(huán)境的變化會(huì)導(dǎo)致其微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)和長度發(fā)生變化, 當(dāng)生態(tài)環(huán)境適宜于其生存發(fā)展時(shí),復(fù)制滑移(Replication slippage)頻率較高, 使微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)增加、長度變長, 完美型比列較高。當(dāng)生態(tài)環(huán)境不適宜于其生存發(fā)展時(shí), 點(diǎn)突變頻率較高, 使微衛(wèi)星重復(fù)序列中斷, 阻礙長度增加, 非完美型比列增加。本次研究篩選到的蘭州鲇非完美型和混合型微衛(wèi)星序列較為豐富,造成這一結(jié)果的原因可能與蘭州鲇的進(jìn)化及環(huán)境變遷有關(guān); 有學(xué)者認(rèn)為鯰類祖先為早白堊紀(jì)時(shí)鼠目(Gonorynchiformes), 經(jīng)晚白堊紀(jì)復(fù)雜的地理變遷, 鼠目衍生出原始的鯉類和鯰類, 并獨(dú)立分化形成了若干不同的類群,逐漸從非洲向歐亞大陸擴(kuò)展, 經(jīng)過很長的一段時(shí)間后, 新的類群和新種又不斷分化出來。在較近的地質(zhì)時(shí)期, 鯰科的鯰屬似乎在我國的西南地區(qū)發(fā)生過更次級(jí)的分化[25,26]。這一系列自然環(huán)境的變遷及人為因素, 使蘭州鲇棲息范圍越來越窄, 迫使其基因組在復(fù)制傳遞過程中造成更多的變異, 增加其遺傳多樣性, 以緩解生存壓力。

本研究中獲得17對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的平均等位基因數(shù)為3.47, 與吳旭東等[27]利用12對(duì)大口鲇微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行蘭州鲇個(gè)體遺傳結(jié)構(gòu)分析所得平均等位基因數(shù)7.92相比較小。蔣鵬等[28]研究表明等位基因的數(shù)目反映了該位點(diǎn)在進(jìn)化過程中積累的遺傳變異程度, 等位基因數(shù)越多說明進(jìn)化歷程這個(gè)位點(diǎn)突變?cè)交钴S, 物種在自然選擇中發(fā)展的取向越大, 對(duì)生活環(huán)境的適應(yīng)潛能越大。這一結(jié)果說明不同的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn), 檢測到的等位基因數(shù)目不同, 代表的遺傳信息量也有所差異。本次篩選到的17對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)在蘭州鲇進(jìn)化過程中積累的遺傳變異程度較小, 在進(jìn)化歷程中這些位點(diǎn)突變較活躍。

多態(tài)信息含量(PIC)是衡量微衛(wèi)星多態(tài)性的重要指標(biāo)[3]。Bacon, et al.[29]研究發(fā)現(xiàn), 微衛(wèi)星的多態(tài)性(或變異性)與其長度有關(guān), 不完美型微衛(wèi)星的變異性應(yīng)比完美型低。本次檢測17對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)中, 7對(duì)完美型平均多態(tài)信息含量為0.6613, 2對(duì)不完美型平均多態(tài)信息含量為0.4623, 8對(duì)混合型平均多態(tài)信息含量為0.4313, 三種類型的多態(tài)信息含量平均值差異極顯著(P＜0.01), 完美型多態(tài)信息含量顯著的高于不完美型和混合型。這一結(jié)果說明蘭州鲇完美型微衛(wèi)星標(biāo)記比不完美型微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)性高,與鄭燕等[30]在水稻(Oryza sativa)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)的研究結(jié)果一致。但是研究發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)植物上五核苷酸重復(fù)完整型的多態(tài)性略低于不完整型, 表現(xiàn)出獨(dú)有特殊性[34]。在水產(chǎn)動(dòng)物是否也存在這種現(xiàn)象, 有待深入研究。

蘭州鲇是名貴黃河魚類, 具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值, 人工馴養(yǎng)已取得成功, 推廣應(yīng)用前景廣闊。本研究構(gòu)建了蘭州鲇基因組微衛(wèi)星文庫, 獲得了大量可利用的微衛(wèi)星序列。隨機(jī)設(shè)計(jì)的30對(duì)微衛(wèi)星引物中17對(duì)在蘭州鲇中具有多態(tài)性, 多態(tài)性引物占 56.7%, 觀測雜合度為 0.0972—0.7326, 期望雜合度為 0.1862—0.8483, 說明微衛(wèi)星文庫構(gòu)建較好, 可為下一步進(jìn)行蘭州鲇種質(zhì)資源保護(hù)、遺傳圖譜構(gòu)建、標(biāo)記輔助育種提供大量候選微衛(wèi)星標(biāo)記, 并將為蘭州鲇種系評(píng)估、經(jīng)濟(jì)性狀的QTL定位等研究奠定基礎(chǔ)。

致謝:

中國科學(xué)院院士、中國科學(xué)院水生生物研究所研究員桂建芳老師對(duì)本課題試驗(yàn)研究給予指導(dǎo)和幫助, 在此表示誠摯的謝意。

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MICROSATELLITE ENRICHMENT BY MAGNETIC BEADS IN SILURUS LANZHOUENSIS

WEI Da-Wei1,2,3, LIAN Zong-Qiang1,2,3, WU Xu-Dong1,2,3, WANG Fa-Xin1,3, XIAO-Wei2,3
and ZHANG Li-Ping1
(1. College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 2. Ningxia Fisheries Research Institute, Yinchuan 750001; 3. Ningxia Engineering Research Center for Fisheries, Yinchuan 750001, China)

蘭州鲇; 微衛(wèi)星標(biāo)記; 磁珠富集; 篩選及特征

Silurus lanzhouensis; Microsatellites; Magnetic bead enriched; Isolation and characterization

Q173

A

1000-3207(2014)04-0791-06

10.7541/2014.110

2014-02-25;

2014-04-19

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360633); 國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD25B09)資助

魏大為(1989—), 男, 甘肅通渭人; 碩士研究生; 主要從事動(dòng)物遺傳與生物技術(shù)研究。E-mail: weidaweiwdw@163.com

吳旭東(1967—), 男, 博士, 研究員; 主要從事水生動(dòng)物分子生物學(xué)及種質(zhì)資源保護(hù)與增養(yǎng)殖研究。E-mail: amy95@126.com