趙依妮 李 怡 胡 鯤 阮記明 葉 鑫 楊先樂

(上海海洋大學(xué), 國家水生動物病原庫, 上海 201306)

劑型作為漁藥的應(yīng)用形式, 可改變漁藥的作用性質(zhì), 調(diào)節(jié)藥物作用速度, 決定藥物的穩(wěn)定性, 降低藥物的毒副作用, 對漁藥的療效起著極其重要的作用[1]。當(dāng)前漁藥市場上主要的劑型有水劑、粉劑、顆粒劑、微囊劑等。近年來, 隨著一些用量大、殘留多、毒性高的漁藥舊劑型對環(huán)境污染日益嚴(yán)重,以及人們的環(huán)保意識的不斷增強(qiáng), 市場對經(jīng)濟(jì)、安全、方便的漁藥新劑型的需求量也與日俱增[2]。相關(guān)研究表明, 不同劑型的漁藥有不同的釋放性, 從而影響了藥物的吸收和消除速率, 進(jìn)而影響了生物利用度[2]。近年來, 諾氟沙星在水產(chǎn)動物細(xì)菌性疾病的防治上也逐漸成為重點(diǎn)研究對象和重要藥品之一[3]?？紤]到水產(chǎn)養(yǎng)殖動物簡單的消化系統(tǒng)以及主要采用群體給藥方式, 因此大大降低了藥物生物利用度。因此, 如何有效提高漁藥的生物利用度已成為目前漁藥研發(fā)和創(chuàng)新的難題之一。高分子載藥微球即微膠囊是近年來發(fā)展起來的新劑型, 藥物經(jīng)其包囊后, 不僅可以提高藥物穩(wěn)定性, 控制其釋放,延長在胃腸內(nèi)的滯留時間, 還可以大大提高藥物的生物利用度[4]。近年來對藥物緩釋載體的一系列研究表明, 藥物緩釋載體在維持血藥濃度, 減少給藥量和給藥次數(shù), 通過不同方法延緩藥物在體內(nèi)的釋放、吸收、代謝等方面具有重要作用[5]。其中, 殼聚糖作為一種資源豐富的天然高分子化合物, 因其不僅具有良好的生物相容性且毒副作用小、易降解吸收, 同時還具有抗菌、消炎、止血等大多數(shù)聚合物所不具有的功能[6], 成為藥物緩釋劑的研究熱點(diǎn)之一[7]。目前, 有關(guān)各類常用漁藥的藥物動力學(xué)研究國內(nèi)外皆有報道, 但利用藥物緩釋載體, 開發(fā)漁藥新劑型, 從而減少給藥次數(shù)、提高藥物穩(wěn)定性和療效、降低藥物毒副作用等方面的研究尚屬空白。

諾氟沙星(Norfloxacin, NFLX)是氟喹諾酮類代表藥物之一[8,9], 被廣泛用于動物和人類多種細(xì)菌性疾病的防治中[9]。本文利用諾氟沙星為模式藥物,利用天然高分子化合物殼聚糖作為諾氟沙星緩釋劑載體, 采用冷凍干燥法制備諾氟沙星—?dú)ぞ厶俏⒛抑苿? 同時將其與諾氟沙星原料藥在草魚體內(nèi)的代謝參數(shù)進(jìn)行對比分析, 據(jù)此評價殼聚糖作為藥物緩釋載體的緩釋效果, 對通過藥物新劑型提高藥物生物利用度、降低藥物使用量、保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全具有實(shí)踐價值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和試劑

草魚(Ctenopharyngodon idellus), 購自江蘇省南通國營農(nóng)場, 平均體重(100 ± 10) g, 體表以及解剖觀察健康。運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室后, 用 2%NaCl溶液浸泡10min, 然后放置于高錳酸鉀消毒后的水族箱(100 cm×80 cm×80 cm)中暫養(yǎng)1周, 試驗(yàn)用水為充分曝氣的自來水, 水溫控制在(23 ± 2)℃下, 自然光照, 并使用增氧泵 24h充氧; 暫養(yǎng)期間飼喂不含任何藥物的全價飼料; 每兩天換 1次水, 每次換水量 1/3; 及時清除水底殘餌和排泄物。所有實(shí)驗(yàn)草魚經(jīng)抽查表明組織中均不含NFLX。

NFLX 標(biāo)準(zhǔn)品(純度 99.50%), 由中國獸藥監(jiān)察所提供; NFLX原料藥(含量 97.8%), 由軍事獸醫(yī)研究所提供; 四丁基溴化銨和乙腈為 HPLC級; 其他試劑均為分析純。

殼聚糖-諾氟沙星微囊制劑, 由本實(shí)驗(yàn)室制備。按照質(zhì)量比(w/w)分別為1︰5和1︰10兩種比例, 將NFLX與殼聚糖混合, 加入少許2%鹽酸溶解, 并配制成 40%的水溶液, 振蕩 15min, 分裝于冷凍瓶中,在–50℃下, 抽真空, 冷凍干燥, 制備 1/5和 1/10的NFLX微膠囊樣品, 以下分別以 1/5 NFLX和 1/10 NFLX表示。

1.2 儀器及色譜條件

Aglient-1100型高效液相色譜儀配二極管陣列檢測器、旋渦混合器、氮?dú)獯蹈蓛x、精密電子天平(METTLER AB104-N)和高速冷凍離心機(jī)等。

色譜柱為: ZORBAX SB2C-18分析住(150 mm×4.6 mm, 5 μm)。流動相為: 乙腈: 四丁基溴化銨(0.030 mol/L、pH 3.1)=5︰95(v/v); 檢測波長 276 nm;流速1.5 mL/min; 柱溫40℃; 進(jìn)樣量為10 μL。以常規(guī)方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計及采樣

實(shí)驗(yàn)用魚162尾, 隨機(jī)分為3組, 每組54尾, 每一時間點(diǎn)取 6條魚, 另取數(shù)尾未給藥的草魚作為空白對照組。所有實(shí)驗(yàn)用魚均以40 mg/kg魚體重的劑量口灌各劑型的諾氟沙星, 確保各組諾氟沙星在魚體內(nèi)的含量相同, 無回吐者保留試驗(yàn)。其中第一組僅為諾氟沙星; 第二組為 1︰5殼聚糖包埋的諾氟沙星; 第三組口灌1︰10殼聚糖包埋的諾氟沙星。給藥前5h禁食, 給藥后5h投料, 并于給藥后0.25、0.5、1、3、6、12、24、48、96、196h圍心腔取血,肝素鈉抗凝; 每個時間點(diǎn)6條魚的血漿合并成一個樣品后于–80℃保存?zhèn)溆谩Ｃ拷M均設(shè)一個重復(fù)。

1.4 血液處理及HPLC測定

樣品檢測前, 準(zhǔn)確吸取1 mL樣品加入5 mL酸化乙腈(乙 腈 ︰ 鹽酸 ︰水的體積比為250︰1︰1), 旋渦混合10min, 4℃條件下8000 r/min離心10min, 取上清夜, 45℃恒溫氮?dú)鈼l件下吹干, 加1 mL流動相溶解, 經(jīng) 0.45 μm 微孔濾膜過濾后取 300 μL進(jìn)行HPLC測定。以上樣品處理及測定均參照阮記明等[10]的兩種水溫條件下異育銀鯽體內(nèi)雙氟沙星藥代動力學(xué)比較中使用的方法。

1.5 諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線制備; 以干燥恒重的諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品制成 0.00、0.025、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、15.00、20.00 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)濃度系列, 以 HPLC儀分別測定其峰面積, 然后作標(biāo)準(zhǔn)曲線, 并求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

各組織中藥代動力學(xué)模型擬合及參數(shù)計算采用藥動學(xué)程序軟件 DAS3.0口服給藥模型對各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行模型嵌合和參數(shù)計算。藥物在不同時間內(nèi)在血漿中的濃度柱形圖和藥物消除的藥時曲線圖則采用Microsoft Excel 2000軟件繪制。

2 結(jié)果

2.1 線性范圍及標(biāo)準(zhǔn)曲線

在設(shè)定的色譜條件下, 以高效液相色譜儀測定血液諾氟沙星含量, 基線走動平穩(wěn), 特異性強(qiáng), 重現(xiàn)性好。

諾氟沙星的標(biāo)準(zhǔn)溶液在(0.025—20) μg/mL濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系, 其回歸方程及相關(guān)系數(shù)分別為Ai=1444.3Ci–212.25。在(0.025—20) μg/mL 內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999), 以引起兩倍極限噪音的藥量為最低檢測限, 本法最低檢測限為 0.01 μg/mL。諾氟沙星血漿平均回收率達(dá)(94.32 ± 6.23)%, 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為(6.28 ± 0.83)%。

2.2 諾氟沙星血漿藥代動力學(xué)規(guī)律

草魚以40 μg/mL的劑量經(jīng)單次口灌給藥后, 藥物在魚體血液中的吸收、分布與消除的動態(tài)如圖 1所示。有關(guān)動力學(xué)數(shù)據(jù)經(jīng)房室模型分析, 藥物濃度與時間關(guān)系數(shù)據(jù)符合開放性二室模型(Two-compartment open model), 其藥動學(xué)參數(shù)詳見表1。

該模型藥物以一級吸收過程進(jìn)入體內(nèi), 并按二室模型分布, 即諾氟沙星口灌進(jìn)入魚體后, 經(jīng)消化道進(jìn)入血液, 其分布和消除情形是, 血藥濃度達(dá)峰時間(Tmax)為 0.494h, 吸收速率常數(shù)(Ka)高達(dá)15.513/h, 分布相較小, 分布相半衰期(t1/2α)為 0.264h,可見NFLX易被魚體吸收。

表1 草魚單劑量口灌諾氟沙星動力學(xué)參數(shù)Tab.1 Pharm-acokinetics parameters following single oral administration of 40 μg/mL of NFLX to Ctenopharyngodon idellus

圖1 諾氟沙星及其在殼聚糖包埋條件下血漿藥時曲線Fig. 1 The concentration-time curves of NFLX and NFLX-embeded in plasma

2.3 NFLX微膠囊藥代動力學(xué)規(guī)律

將諾氟沙星與殼聚糖按1︰5和1︰10的質(zhì)量比進(jìn)行包埋(包埋率為 98.743%), 并按每千克魚體重口灌40 mg諾氟沙星原料藥的劑量給藥后, 藥物在魚體血液中的吸收、分布與消除的動態(tài)如圖1所示。有關(guān)動力學(xué)數(shù)據(jù)經(jīng) MCPKP藥動學(xué)程序軟件處理的結(jié)果表明, 無論何種情況, NFLX在草魚血漿中的藥動學(xué)特征均適合用一次式二室開放模型來描述, 相應(yīng)的藥動學(xué)參數(shù)見表1。

由圖1可知, 在殼聚糖包埋條件下, NFLX在血漿中的吸收、分布以及消除速度明顯降低; 在用 5倍的殼聚糖包埋時, NFLX在第 1.107h達(dá)到峰值6.539 μg/mL, 隨后開始下降, 但降幅較單純口灌NFLX條件下延緩, 在第3、6、12h分別降到3.341、2.493和2.107 μg/mL, 第 48h為1.325 μg/mL, 約為第1h的1/6, 第96h降至0.743 μg/mL, 第196h后仍能檢測到, 濃度為0.573 μg/mL; 而在10倍殼聚糖包埋條件下, NFLX在1.562h達(dá)到最大值6.982 μg/mL, 此后開始下降, 其下降幅度稍小于 5倍殼聚糖包埋,第 24、48、96h 分別為 2.184、1.752、1.084 μg/mL,第196h為0.815 μg/mL, 仍高于5倍殼聚糖包埋第96h的水平。

從表 1可以看出, 在殼聚糖包埋條件下, 吸收相半衰期(T1/2ka)、分布相半衰期(T1/2α)和消除相半衰期(T1/2β)均較低, 達(dá)峰時間(Tp)延長, 峰濃度降低(Cmax)、消除率(CLs)也明顯降低; 此條件下的藥時曲線下面積(AUC)明顯增加, 5倍殼聚糖包埋時為單純口灌NFLX時的1.45倍。諾氟沙星5倍和10倍殼聚糖包埋相比, 10倍殼聚糖包埋條件下NFLX在草魚血漿中的吸收相半衰期(T1/2ka)、分布相半衰期(T1/2α)、消除相半衰期(T1/2β)都稍有延長; 達(dá)峰時間(Tmax)延長, 峰值(Cmax)卻有增加; 二者的清除速率(CLs)和藥時曲線下面積(AUC)則基本相同。

3 討論

利用可生物降解的高分子材料作為藥物載體在醫(yī)藥上的應(yīng)用越來越引人注目, 尤其是將藥物包裹于高分子材料中制備的微膠囊。微膠囊其實(shí)質(zhì)就是把分散的固體顆粒、液體或氣體完全包封在一層膜中, 形成球狀的微球[11]。微膠囊可在體內(nèi)特異性分布, 利用對特定器官、組織的靶向性和藥物的緩釋性來降低藥物的毒副作用, 提高藥物的生物利用度[7]。從20世紀(jì)90年代起, 微膠囊的應(yīng)用研究已經(jīng)涉及藥物控制釋放、細(xì)胞和酶的固定化、動植物細(xì)胞培養(yǎng)以及生化物質(zhì)分離等領(lǐng)域, 成為醫(yī)學(xué)、制藥、材料等多學(xué)科的研究熱點(diǎn), 并產(chǎn)生了廣泛的應(yīng)用前景[11]。目前, 采用合成的或天然的高分子材料已制備出多種微膠囊, 例如: 殼聚糖、明膠、纖維蛋白原、乙基纖維素、蜂蠟等都是良好的微囊膜材料[12]。其中殼聚糖作為一種優(yōu)良、價格便宜的天然高分子材料, 其成膜性能是制作微囊理想材料, 因而備受關(guān)注[13]。

目前, 有關(guān)于殼聚糖應(yīng)用于藥物緩釋、控釋制劑方面的研究已有了相當(dāng)?shù)难芯可疃群蛷V度。諸多實(shí)驗(yàn)結(jié)果都驗(yàn)證了殼聚糖在藥物緩釋、控釋上具有明顯功效[12—15]。如恩諾沙星-殼聚糖納米?？梢燥@著提高恩諾沙星的生物利用程度, 參比恩諾沙星原料藥的相對生物利用度為262%[16]。He, et al.[17]采用噴霧干燥法制備的西米替丁和法莫替丁殼聚糖微囊,緩釋作用明顯, 可明顯提高藥效。楊利芳等[18]采用靜電液滴工藝制備了胰島素海藻酸鈉-殼聚糖微囊,以四氧嘧啶為誘導(dǎo)劑建立糖尿病小鼠模型, 對載藥微囊的口服藥效學(xué)進(jìn)行評價, 結(jié)果表明, 以該微囊為基礎(chǔ)的口服胰島素制劑生物利用度高且緩釋效果明顯。何強(qiáng)芳等[4]以殼聚糖為載體, 通過乳液化學(xué)交聯(lián)法制備了5-氟尿嘧啶(5-fu)殼聚糖微粒, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 殼聚糖微囊對 5-fu的緩釋作用明顯, 釋放周期比較長, 殼聚糖可作為載5-fu的理想載體。

在本次實(shí)驗(yàn)中, 口灌40 μg/mL諾氟沙星原料藥后, 由血液藥動學(xué)參數(shù)可知諾氟沙星在草魚血漿中的吸收較迅速, 在各組織間的分布也較快, 該結(jié)果同郭海燕等[19]、劉莉莉等[20]的相關(guān)諾氟沙星在草魚體內(nèi)的代謝規(guī)律研究結(jié)果相一致; 口灌 40 μg/mL NFLX-殼聚糖微囊制劑后, 由血液藥動學(xué)參數(shù)可知NFLX在草魚體內(nèi)代謝規(guī)律未發(fā)生變化, 進(jìn)而證明殼聚糖包埋對諾氟沙星在草魚體內(nèi)的代謝規(guī)律未發(fā)生影響。而NFLX-殼聚糖微囊制劑同諾氟沙星原料藥的藥代動力學(xué)相比, 在殼聚糖包埋條件下 NFLX在草魚體內(nèi)的達(dá)峰時間(Tmax)平均延長 2—3倍, 藥時曲線下面積(AUC)明顯增加, 消除速率延緩, 表明NFLX-殼聚糖微膠囊的生物利用度明顯增加。因此, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病防治過程中, 有必要根據(jù)臨床應(yīng)用實(shí)際需要, 通過改變劑型以加快或減慢漁藥作用時間, 從而充分發(fā)揮漁藥的療效[2]。

隨著國內(nèi)、外微囊技術(shù)研究的不斷深入, 殼聚糖在微囊體系中的應(yīng)用將會有更加廣闊的應(yīng)用前景[11]。殼聚糖作為純天然的高分子物質(zhì), 因其良好的生物特性, 且來源廣、價格經(jīng)濟(jì)實(shí)惠, 使其成為一種理想的載體材料[21], 在藥物微囊化的過程中占有非常重要的地位。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展, 新型漁藥制劑的研究開發(fā)日益得到廣泛的關(guān)注, 對于殼聚糖如何應(yīng)用于漁藥緩釋、控釋, 利用殼聚糖制得的微膠囊或微球增加藥物穩(wěn)定性、降低毒副作用、延長藥效、提高生物利用率是正在發(fā)展又非常有前景的課題, 也是此領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[13]。利用殼聚糖自身具有的優(yōu)良特性且易被生物體吸收的特點(diǎn)及良好的控釋、緩釋性能, 采用冷凍干燥技術(shù)制備了NFLX-殼聚糖微膠囊, 將其同 NFLX原料藥在健康草魚血漿內(nèi)的藥物代謝規(guī)律進(jìn)行比較分析, 研究結(jié)果表明, 殼聚糖可明顯延長 NFLX在魚體的存留時間, 提高生物利用度, 進(jìn)一步驗(yàn)證了殼聚糖用于漁藥緩釋、控釋制劑研發(fā)的可行性。因此, 發(fā)展以微膠囊為代表的控釋緩釋制劑等第三代制劑是未來漁藥劑型的發(fā)展方向[2]。如果此類產(chǎn)品能夠順利問世,將成為臨床預(yù)防治療水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細(xì)菌性疾病的又一有效方法, 產(chǎn)生很好的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。