鄧曉東 蔡佳佳 費小雯

(1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所, 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物技術重點開放實驗室, 海口 571101;2. 海南醫(yī)學院理學院, ?？?571101)

隨著全球經(jīng)濟飛速發(fā)展, 人類對石油等化石燃料的消耗日益增加, 并且使用化石燃料帶來了嚴重環(huán)境污染問題, 世界各國都在尋找安全的可再生能源。生物能源可以間接或者直接利用植物或微生物的光合作用, 將太陽能固定為化學能, 是可再生能源的首選。生物柴油和燃料乙醇是目前可以作為汽油添加劑進入市場的生物能源, 其中生物柴油的成分更接近汽油, 并且來源廣泛, 是最有可能解決石油危機的可再生能源之一[1]。生物柴油的制備主要是通過三酰甘油(TAG)與甲醇(乙醇)通過酯交換工藝制成。目前生物柴油的原料有餐飲廢棄油、動植物油脂和微藻。利用微藻生產(chǎn)生物柴油具有無可比擬的優(yōu)勢, 已成為制備生物柴油的主要途徑[2]。

利用微藻來生產(chǎn)生物柴油有很多工藝步驟, 其中優(yōu)良藻種的選育是關鍵。最理想的生物柴油生產(chǎn)藻株要求生長迅速、含油量高且脂肪酸組成適宜制備生物柴油。目前的研究工作主要集中在藻種的分離以及微藻大規(guī)模培養(yǎng)上。與高等植物相比, 微藻的油脂生物合成的分子機制研究還很薄弱, 關于油脂代謝網(wǎng)絡中相關基因功能研究報告更為稀少。萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是模式單細胞生物, 基因組測序已經(jīng)完成, 在缺氮條件下油脂可以積累達到胞質的 60%, 是研究油脂代謝基因的理想藻株[2]。

最近研究表明, 植物中從二酰甘油到最終合成三酰甘油存在2條途徑[3]。其一, 以?；o酶A為?；w, 二酰甘油為受體, 由?；?CoA-二酯酰甘油酰基轉移酶催化合成三酰甘油。其二, 在一些植物如向日葵(Helianthus annuus)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)和蓖麻(Ricinus communis)以及酵母中以磷脂作為?；w, 二酰甘油作為受體, 經(jīng)磷脂二脂酰甘油酰基轉移酶(PDAT)催化合成三酰甘油[4—6]。不同植物中 PDAT的底物特異性不同: 在擬南芥和酵母中, 卵磷脂(Phosphatidylcholine, PC)上的脂酰基被轉移到二酰甘油[7]; 在蓖麻種子中, 磷脂上的蓖麻油酸(Ricinoleic acid)則被PDAT整合到三酰甘油中[8]。Stahl, et al.研究發(fā)現(xiàn)擬南芥 PDAT基因(At5g13640)與酵母PDAT的同源率為28%?？梢岳肅10到C22的磷脂作為酰基供體, 并且催化結合到甘油骨架上 sn位上的效率是 sn2位的 3倍。AtPDAT突變體的根部的微粒體(Microsomes)喪失了將磷脂的脂?；D移到二酰甘油上的能力[9]; 同時他們通過在出芽酵母和裂殖酵母中過量表達 PDAT基因, 結果顯示酵母細胞中三酰甘油的含量顯著增加。在微藻研究方面, Merchant, et al.預測了萊茵衣藻中存在多個PDAT的同源基因[10]。Boyle, et al.報道了萊茵衣藻中PDAT同源基因PDAT1基因。通過插入突變得到的pdat1-1、pdat1-2細胞中的三酰甘油含量相對于非轉基因藻株CC425減少25%。這說明PDAT1在萊茵衣藻的油脂合成中起到重要作用[11]。本研究對在萊茵衣藻 PDAT另一個同源基因CrPDAT3進行研究, 通過RNAi干涉的方法將該基因沉默, 研究其在三酰甘油合成中的功能, 為微藻油脂的遺傳改良提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

萊茵衣藻CC425購自中國科學院水生生物研究所, 為細胞壁缺失的藻株。藻株被接種在HSM固體培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng), 而當進行實驗時則被接種到HSM液體培養(yǎng)基中, 在恒溫搖床上培養(yǎng), 培養(yǎng)條件為 220 r/min, 溫度26℃, 全日光照, 光照強度為110 μmol/(m2×s)。大腸桿菌 DH5a 菌株購置于上海生工生物工程有限公司, RNAi干涉載體pMaa7/XIR由購于 Duke大學萊茵衣藻中心保存的質粒。中間載體T282由本實驗室構建。

1.2 萊茵衣藻總RNA的提取及cDNA合成

萊茵衣藻 CC425 在 24℃ 110 μmol/(m2×s)全光照條件下震蕩培養(yǎng), 待生長至對數(shù)生長期, 取藻液50 mL, 10000 r/min 離心1min收集藻體, 液氮速凍后碾磨成粉末, 按照Trizol的方法提取總RNA。取1 μL 提取的總 RNA, 加入 9 μL去離子甲酰胺, 70℃變性 10 min, 加 3 μL 6×Loading Buffer, 1×TBE 電泳緩沖液, 1%瓊脂糖凝膠電泳, 檢測所提取RNA樣品的質量。按照 TAKARA公司 cDNA合成說明書將RNA反轉錄為cDNA[12]。

1.3 CrPDAT3基因干涉片段的克隆

根據(jù) JGI Chlamydomonas database上公布的CrPDAT3部分編碼區(qū)序列為模板, 設計如下特異性引物, 5￠-ATGTGTGAGGCTGAGGCAGT-3￠, 5￠-TCA GCTGATGACCAGCGGTCG-3￠進行PCR擴增。產(chǎn)物連接到 pMD18-T載體上, 轉化大腸桿菌 E.coli DH5α, 挑取單菌落, 提取質粒, 進行酶切分析, 確認有目標插入片段的陽性克隆送上海生工測序, 得到載體pMD-CrPDAT3。

1.4 CrPDAT3 RNAi干涉載體的構建

以HindⅢ和BamHⅡ分別酶切質粒pMDCrP DAT3和中間載體T282, 回收CrPDAT3正向片段與T282連接,連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α, 37℃培養(yǎng)12—16h。挑取單菌落提取質粒, 用HindⅢ和BamHⅡ雙酶切鑒定重組質粒。繼而, 以XbaⅠ和SalⅠ酶切質粒pMDCrPDAT3和CrPDAT3正向片段-T282重組質粒, 回收并連接上述片段, 轉化大腸桿菌, XbaⅠ和 SalⅠ雙酶切鑒定, 得到含 CrPDAT3正反方向插入的中間載體, 并最終插入表達載體pMaa7IR/XIR中, 得到CrPDAT3 RNA干涉載體pMaa7IR/ CrPDAT3IR。

1.5 萊茵衣藻轉化

圖1 CrPDAT3與其他物種中的同源基因聚類分析結果Fig. 1 Clustering analysis of CrPDAT orthologous genes in C.reinhardtii and other species

采用 Glass Beads方法[13], 將 500 μL藻液、400 mg玻璃珠, 100 μL 20%PEG8000和1 μg干涉載體pMaa7IR/CrPDAT3IR共混, 渦旋振蕩器上振蕩 20s。藻細胞隨后轉移至50 mL無菌離心管中, 溫育過夜。收集藻細胞, 涂布于TAP固體培養(yǎng)基(1.5 mmol/L L-色氨酸、5 μg/mL paromomycin)上培養(yǎng)(7—8)d。挑取單克隆, 進行生物量、油脂含量和目標基因表達豐度檢測。

1.6 油脂含量的測定

中性脂含量的測定采用的是酸水解法[14](國家標準GB_T 5009.6-2003)。取適量藻液置于50 mL帶蓋離心管中, 加入滅菌蒸餾水, 混勻后小心加入鹽酸, 置于 80℃水浴中 25min, 然后向管內加入 95%的乙醇混勻。冷卻后加入乙醚, 加蓋振搖 1min, 之后開蓋放出氣體。離心3min(4000 r /min), 將上清液移至恒重的錐形瓶中, 重復洗滌離心管中的殘渣,然后將上清液轉移至原先的錐形瓶中。將錐形瓶置于水浴上蒸干, 再轉移至 100℃烘箱中干燥 2h, 取出冷卻后稱重。

2 結果

2.1 CrPDAT3基因的聚類分析及干涉片段克隆

本研究涉及的萊茵衣藻磷脂二脂酰甘油?；D移酶同源基因CrPDAT3 JGI數(shù)據(jù)庫的蛋白ID:186846;Genbank 序列號: XP_001699748。與已報道的CrPDAT1(Genbank序列號 AFB73928)同源率為41.7%。通過與其他物種的 PDAT聚類分析顯示:CrPDAT3與微藻的PDAT聚為一類, 與酵母和真菌PDAT的關系較近(圖1)。

2.2 CrPDAT3 RNAi干涉載體的構建

RNAi正向和反向片段的獲得 以萊茵衣藻總 RNA反轉錄成的 cDNA為模板, 擴增 CrPDAT3 RNAi干涉片段序列(圖2A), 結果可以擴增出一條約250 bp 的條帶, 與預計大小一致。經(jīng)克隆進pMD18-T后, 得到pMD-CrPDAT3。測序結果顯示, 所克隆的CrPDAT3基因片段與JGI數(shù)據(jù)庫中CrPDAT3基因序列同源性為100%。通過HindⅢ、BamHⅠ雙酶切, 將該 250 bp CrPDAT3基因干涉片段從質粒pMD-CrPDAT3上切下來(圖2B), 然后再進行膠回收純化目的片段, 得到CrPDAT3基因正向片段。同理,通過XbaⅠ和SalⅠ將CrPDAT3基因干涉片段從質粒pMD-CrPDAT3上切下來(圖2B), 得到反向片段。

圖2 CrPDAT3 RNAi干涉載體構建Fig. 2 The construction of CrPDAT3 RNAi interference vector

CrPDAT3基因正向和反向片段與 T282連接利用HindⅢ和BamHⅡ酶切載體T282, 電泳回收大片段, 將其與CrPDAT3基因正向片段連接, 連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌 DH5α, 挑取單克隆進行酶切鑒定,結果如(圖2C)所示。CrPDAT3基因正向片段連接到T282上后。接下來是在此基礎上連接反向片段, 對連接有正向片段的重組質粒進行XbaI和SalI雙酶切,電泳回收目的片段, 將其與CrPDAT3基因反向片段連接, 轉化大腸桿菌, 挑取單菌落, 利用 EcoRⅠ酶切鑒定(圖2D)。得到中間載體T282-CrPDAT3。

反向重復片段插入干涉載體 用 EcoRⅠ對干涉載體pMaa7 IR/XIR和中間載體T282-CrPDAT3進行酶切, 回收目的片段并連接, 連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌,挑取單克隆, 用EcoRⅠ對重組質粒酶切鑒定(圖2E)。構建成功的干涉載體命名為pMaa7 IR/PDAT3IR。

2.3 CrPDAT3 RNAi干涉載體轉化萊茵衣藻CC425及轉基因藻株檢測

各轉基因藻株的生物量隨著時間的增加而增加,其峰值出現(xiàn)在第5天, 與pMaa7 IR/XIR轉基因藻株相比較, pMaa7 IR/PDAT3IR轉基因藻株生物量從第3天開始明顯減少, 其最大降幅出現(xiàn)在第4天, 分別為46.71%(圖3)。這說明對CrPDAT3基因的沉默會造成萊茵衣藻生長減緩。

圖3 CrPDAT3 RNAi干涉載體轉基因藻株連續(xù)培養(yǎng)6d其生物量的變化Fig. 3 The biomass of CrPDAT3 RNAi transgenic C. reinhardtii after 6 days cultivation

CrPDAT3 RNAi干涉載體轉基因藻株油脂含量的檢測顯示(圖4): 相對于對照pMaa7 IR/XIR轉基因藻株, CrPDAT3 RNAi干涉載體轉基因藻株油脂含量顯著下降, 降幅范圍為 14.65%—45.15%, 說明CrPDAT3對油脂合成起到重要的作用。顯微鏡檢結果也顯示(圖5): CrPDAT3 RNAi干涉載體轉基因藻株油脂含量下降。

圖4 CrPDAT3 RNAi干涉載體轉基因藻株油脂含量的變化Fig. 4 Lipid content detected through Nile Red staining method in CrPDAT3 RNAi transgenic C. reinhardtii

圖 5 CrPDAT3 RNAi干涉載體轉基因藻株在培養(yǎng)至第4天的顯微觀察結果(×250倍)Fig. 5 Microscopic observations of CrPDAT3 RNAi transgenic C.reinhardtii after 4 days of cultivation in HSM medium, more oil droplets of CrPDAT3 RNAi transgenic algae had been found

為了檢測CrPDAT3 RNAi干涉載體干涉載體對目標基因的沉默效果, 本實驗采用Realtime PCR方法檢測培養(yǎng)至第4天的轉基因藻株中CrPDAT3基因的豐度[15](圖6)。CrPDAT3 RNAi干涉載體轉基因藻株 CrPDAT3基因 mRNA豐度與對照 CC425和pMaa7 IR/XIR轉基因藻株比較, 豐度下降, 降幅為71.28%—97.92%, 說明CrPDAT3基因被有效沉默。

3 討論

圖6 CrPDAT3 RNAi干涉載體轉基因藻株CrPDAT3 mRNA豐度Fig. 6 Comparison of the mRNA abundance of CrPDAT3 in transgenic C. reinhardtii

微藻三酰甘油的合成途徑相關基因及其同源基因的功能是近期研究的熱點。目前, 已經(jīng)報道的有二酰甘油?；D移酶(DGAT)[16],磷脂酸磷酸酶(PAP)[17]等。它們在微藻油脂合成中起著重要的作用。磷脂二脂酰甘油酰基轉移酶(PDAT)以磷脂作為?；w, 二酰甘油作為受體, 催化形成三酰甘油。與二脂酰甘油?；D移酶酶(DGAT)一樣, 在萊茵衣藻油脂合成中發(fā)揮重要作用。本研究通過對萊茵衣藻CrPDAT3基因的沉默, 檢測到轉基因藻株中油脂含量的降低, 說明對萊茵衣藻磷脂二脂酰甘油?；D移酶同源基因CrPDAT3的表達量的改變, 影響了藻細胞油脂的積累, 從而推斷該基因在萊茵衣藻三酰甘油的代謝中發(fā)揮重要的作用。Boyle, et al.利用插入突變技術, 篩選得到CrPDAT1基因缺陷的突變體[11]。對突變藻株油脂含量檢查顯示: 相對于對照油脂含量減少 25%。本研究通過 RNAi的方法, 對萊茵衣藻CrPDAT3進行沉默。我們分析3個knock down的轉基因藻株, 得到了轉基因藻株中油脂含量降低 14.65%—45.15%的結果。這說明 PDAT1 和PDAT3 基因在油脂合成中均發(fā)揮作用。目前, 在萊茵衣藻JGI數(shù)據(jù)庫中標注的有CrPDAT1、CrPDAT2、CrPDAT3三個同源基因。而同源基因是否都在油脂代謝中發(fā)揮功能, 需要實驗加以證明。今后我們將克隆全長CrPDAT3基因, 進一步確認該基因的重要功能, 為該基因在微藻油脂改良、轉基因良種培育實踐應用中打下基礎。