熊文芳 史建伍 蔣謀炎 陳永玲 彭 扣 盛軍慶 王軍花 洪一江

(南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院, 南昌 330031)

池蝶蚌致雄性化基因fem-1c及其蛋白分子的結(jié)構(gòu)特征分析

熊文芳 史建伍 蔣謀炎 陳永玲 彭 扣 盛軍慶 王軍花 洪一江

(南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院, 南昌 330031)

研究首次獲得淡水珍珠貝池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)的致雄性化基因feminization-1C亞型, 即fem-1c基因, 并進(jìn)行全長克隆及序列分析。從轉(zhuǎn)錄組中Race-PCR擴(kuò)增fem-1c基因全長cDNA序列, 用生物信息學(xué)方法對 fem-1c基因進(jìn)行基因組結(jié)構(gòu)分析、多序列同源性比較、跨膜區(qū)段、親疏水性分析、功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測等。研究結(jié)果如下: 該cDNA序列全長2328 bp, 包含一個(gè)1869 bp的最大開放閱讀框, 編碼622個(gè)氨基酸, 經(jīng)同源比對和進(jìn)化樹分析, fem-1基因c亞型編碼的氨基酸與太平洋牡蠣的同源性最高, 為79%; 疏水性分析顯示該蛋白為親水性蛋白; 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白有大量的 α螺旋和隨機(jī)卷曲, 形成 9個(gè)錨蛋白重復(fù)序列(Ankyrin repeat, ANK), 同時(shí), 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測中可以清楚的看到9個(gè)ANK模體, 跟SMART預(yù)測的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)結(jié)果相近。從無脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物 fem-1c基因的保守性表明它們有共同的起源, 暗示這個(gè)基因家族在功能上具備保守性, 推測池蝶蚌fem-1c基因可能具備與線蟲fem-1基因在性別決定方面上相似的功能。

池蝶蚌; fem-1c基因; 克隆; 序列分析; 結(jié)構(gòu)預(yù)測

fem基因包括fem-1、fem-2和fem-3, 其中fem-1家族包括3個(gè)家庭成員: fem-1a、fem-1b、fem-1c[1]。fem-1是秀麗隱桿線蟲控制性別決定信號(hào)通路上的基因[2], 其編碼的蛋白 FEM-1是一種細(xì)胞內(nèi)蛋白[3],具有錨蛋白重復(fù)序列(ANK)結(jié)構(gòu)域, 介導(dǎo)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用[4]。FEM-2是種絲氨酸/蘇氨酸特異性磷酸酶 PP2C[5,6], 它可通過去磷酸化作用直接與FEM-3的錨定蛋白重復(fù)序列蛋白相互作用[7,8]。秀麗隱桿線蟲有兩種性別, 一種是只有1條X染色體的雄性個(gè)體(XO), 另一種是具有2條X染色體、并能夠自體受精的雌雄同體個(gè)體(XX)[9]。 X染色體與常染色體組的比率提供了初級(jí)遺傳信號(hào), 進(jìn)而影響her-1基因(Hermaphrodization)的活性。從her-1、tra-2[8]、fem-1、fem-2、fem-3基因[6,10]到tra-1基因,需經(jīng)過一系列的負(fù)調(diào)控來控制, 最終由tra-1基因引導(dǎo)個(gè)體性別分化[11]。Her-1蛋白是一種分泌蛋白, 在XX 個(gè)體中, 該蛋白不表達(dá)[12], 導(dǎo)致跨膜蛋白TRA-2抑制FEM蛋白的功能, 從而使TRA-1蛋白參與調(diào)控。其中TRA-2蛋白具有跨膜蛋白接收器的結(jié)構(gòu)特點(diǎn), 能夠跨膜與胞內(nèi)蛋白 FEM 蛋白反應(yīng)。TRA-1是一種具有鋅指結(jié)構(gòu)的 DNA 結(jié)合蛋白[13],也是一種轉(zhuǎn)錄因子, 它能夠抑制有助于雄性性別方向發(fā)展基因的表達(dá), 從而使個(gè)體體細(xì)胞組織性別往雌性發(fā)展。在XO個(gè)體中, 分泌蛋白HER-1抑制了TRA-2A的活性[14,15], 同時(shí)解除了對FEM蛋白的抑制, 這樣FEM蛋白就可以抑制TRA-1A蛋白的活性,使其不能調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄, 最終決定了個(gè)體性別方向是往雄性發(fā)展。不管是在XX個(gè)體還是XO個(gè)體中, fem-1基因?qū)拥纳啥际潜夭豢缮俚腫16,17]。

淡水珍珠蚌池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)為日本引進(jìn)品種, 分泌珍珠質(zhì)能力強(qiáng)[18]。本項(xiàng)目組已對其育珠性能[19]、性腺發(fā)育[20]和選育[21,22]等方面進(jìn)行了研究, 發(fā)現(xiàn)其性腺發(fā)育過程中存在雌雄同體階段,但成熟后的個(gè)體單性, 表明其性別分化可能存在獨(dú)特的調(diào)控機(jī)制。目前, 在低等貝類的性腺發(fā)育過程中有關(guān)性別決定及分化機(jī)制的報(bào)道鮮見。為探討淡水貝類的性別發(fā)育, 本研究對池蝶蚌的 fem-1c基因進(jìn)行克隆, 并運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對其全長cDNA序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析, 為進(jìn)一步揭示池蝶蚌性別決定及分化機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

池蝶蚌取自江西省撫州市洪門水庫開發(fā)公司國家級(jí)池蝶蚌良種場。4齡, 體質(zhì)健壯, 生長線明顯,外套膜厚實(shí), 內(nèi)臟柔軟飽滿, 外腮完整無傷。取回后置于水族箱暫養(yǎng)一周, 水溫(18—25) , ℃ 每天換已曝氣的自來水一次。

1.2 方法

總 RNA的提取與 cDNA的合成 采用Trizol法提取池蝶蚌總 RNA, 使用 1.5% 變性瓊脂糖膠和紫外分光光度計(jì)檢測RNA質(zhì)量和濃度, 參照SMART RACE Kit (美國, Clonetech)說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及目的基因兩端序列的克隆。

PCR 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室高通量測序測得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出fem-1c基因的部分片段設(shè)計(jì)引物 orfF、orfR; 3′-RACE引物 GSP1、GSP2; 5′-RACE引物GSP3、GSP4 (表1), 由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 實(shí)驗(yàn)中使用到的引物序列Tab. 1 Sequence of primers used in the experiment

cDNA序列的克隆 利用引物orfF、orfR擴(kuò)增中間片段, 反應(yīng)體系為: 10×Extaq PCR Buffer 5 μL, 2.5 mmol/L dNTP Mix 2.5 μL, halorfF 2 μL, halorfR 2 μL, ExTaq酶 0.4 μL, cDNA 1.5 μL, ddH2O 36.6 μL。擴(kuò)增條件: 95℃預(yù)變性5min; 95 ℃ 30s, 60 ℃ 30s, 72℃ 2min, 35個(gè)循環(huán); 72 ℃ 延伸10min。

利用通用引物UPM (Long︰Short︰ddH2O為1︰4︰19)和特異性引物 GSP1, 以 3′-RACE-Ready cDNA為模板進(jìn)行第一輪 PCR, 將擴(kuò)增的產(chǎn)物稀釋10倍作為第二輪巢式 PCR的模版, 以特異性引物GSP2和通用引物UPM進(jìn)行第二輪PCR。反應(yīng)體系為10×Extaq PCR Buffer 5 μL, 2.5 mmol/L dNTP Mix 2.5 μL, GSP1 2 μL, UPM 5 μL, Extaq酶 0.4 μL, cDNA 1.5 μL, ddH2O 33.6 μL。第一輪PCR反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性5min; 95 ℃ 30s, 72 ℃1min30s, 5個(gè)循環(huán); 95 ℃ 30s, 70 ℃ 30s, 72 ℃ 1min, 5個(gè)循環(huán); 95 ℃30s, 60 ℃ 30s, 72 ℃ 1min, 25個(gè)循環(huán); 72 ℃ 延伸10min。第二輪 PCR反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性 5min; 95 ℃30s, 72 ℃1min30s, 5個(gè)循環(huán); 95 ℃30s, 70℃ 30s, 72℃ 1min, 5個(gè)循環(huán); 95 ℃ 30s, 68 ℃ 30s, 72 ℃ 1min, 35個(gè)循環(huán); 72 ℃ 延伸10min。5′-RACE擴(kuò)增反應(yīng)同理。

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR產(chǎn)物, 使用OMEGA切膠回收試劑盒回收特異性目的條帶, 將回收產(chǎn)物連接到pMD19-T Vector上, 再轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)大腸桿菌中, 用氨芐青霉素篩選陽性菌落,挑選陽性菌落送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

fem-1基因 c亞型的全長序列拼接及序列分析利用 MEGA4.0軟件去掉測序結(jié)果的載體序列, 再用Chromas軟件觀察其測序熒光值, 并經(jīng)人工校對,拼接獲得fem-1c基因的全長cDNA。

BLAST program (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)與 Expasy (http://www.expasy.org/)在線軟件分析序列的同源性、開放閱讀框及保守結(jié)構(gòu)域。氨基酸序列經(jīng)Clustalw2 program (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/ clustalw2/)排序比對分析保守性; MEGA4.0軟件鄰位相連法(NJ)[23]建立系統(tǒng)進(jìn)化樹; ProtScale軟件分析編碼蛋白疏水性進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 池蝶蚌 fem-1c基因全長的獲得及其 cDNA核苷酸序列分析

PCR擴(kuò)增獲得了一條 1900 bp大小的片段, 5′-RACE獲得了一條介于100和250 bp的特異性條帶, 3′-RACE獲得了一條介于250和500 bp的特異性條帶(圖1)。將這3段特異性條帶回收純化、克隆、測序, 分別得到1900、154和376 bp大小的序列。用MEGA4.0軟件將這這3條序列進(jìn)行拼接, 得到總長度為2328 bp的全長序列。使用ORF finder查找到一個(gè)1869 bp的最大開放閱讀框(ORF), 編碼622個(gè)氨基酸, 該閱讀框起始密碼子ATG的-3位堿基為嘌呤堿基 G, +4位為 G, 符合 Kozak規(guī)則[24]。5′端UTR 長137 bp, 3′端UTR長322 bp, 含有典型的加尾信號(hào)序列AATAA以及PloyA。

圖1 fem-1c基因中間片段產(chǎn)物(A)、5′-RACE產(chǎn)物(B)及3′-RACE產(chǎn)物(C)電泳結(jié)果Fig. 1 Electrophoresis result of the middle (A), 5′-RACE (B)and 3′-RACE (C) fragments M: DL2000 plus

2.2 池蝶蚌 Fem1c蛋白理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)域分析及二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

池蝶蚌 Fem1c蛋白的理化性質(zhì) ORF finder分析表明 fem-1c基因的開放閱讀框位于(138—2006) bp區(qū)域, 編碼一條含有622個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì), 分子量為69.95 kD, 理論等電點(diǎn)(PI)為7.05,原子數(shù) 9836, 分子式為 C3101H4937N857O900S41, 無信號(hào)肽, 不穩(wěn)定系數(shù)34.62。其編碼的蛋白親疏水性分析結(jié)果表明其大部分區(qū)域?yàn)橛H水區(qū), 親水性總平均值為–0.108, 為穩(wěn)定親水性蛋白。用http://psort.hgc. jp/form2.html 在線軟件預(yù)測蛋白的亞細(xì)胞定位, 得知細(xì)胞質(zhì)中含52.2%, 線粒體中含21.7%, 細(xì)胞核中占17.4%, 液泡中含8.7%。因此, Fem1c蛋白很可能也為胞內(nèi)蛋白。

池蝶蚌Fem1c蛋白結(jié)構(gòu)域分析及二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用SMART軟件分析表明, fem-1c基因編碼的蛋白含有9個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(圖2)且都屬于ANK蛋白家族, ANK重復(fù)序列約33個(gè)氨基酸長, 一般是包括兩個(gè)α螺旋和一個(gè)環(huán), 環(huán)以90°角與兩個(gè)α螺旋連接, 形成了一個(gè)螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)。在 PROSITE在線軟件中分析同樣顯示Fem1c蛋白含有9個(gè)ANK模體(圖3), 與SMART軟件分析結(jié)果相似。

圖2 池蝶蚌Fem1c蛋白結(jié)構(gòu)域SMART預(yù)測分析Fig. 2 Domain architectures of Fem1c in the Hyriopsis schlegelii by SMART

通過在線軟件 https://www.predictprotein.org/ 預(yù)測二級(jí)結(jié)構(gòu), 結(jié)果表明Fem1c蛋白有大量的 α-螺旋, 達(dá)52.09%; 其次為無規(guī)則卷曲。利用瑞士生物信息所(Swiss Institute of Bioinformatics, SIB)的 ExPASy服務(wù)器上提供的SWISS-MODEL程序http://swissmodel.expasy.org/對池蝶蚌 Fem1c蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步預(yù)測, 結(jié)果(圖 4)可以清楚地看到9個(gè)ANK模體, 與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測及SMART結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果都比較符合。

圖3 池蝶蚌Fem1c蛋白結(jié)構(gòu)域PROSITE預(yù)測分析Fig. 3 Domain architectures of Fem1c in the Hyriopsis schlegelii by PROSITE

2.3 池蝶蚌Fem1c蛋白同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用 Clustal軟件對池蝶蚌及其他多個(gè)物種的Fem1c氨基酸序列進(jìn)行多序列同源性比對, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)池蝶蚌Fem1c與牡蠣、人和老鼠的Fem1c序列一致率分別為79%、58%和58%。在比對的各個(gè)物種的C端發(fā)現(xiàn)存在一段固有的序列: P xx L xx F xxx H (x為隨機(jī)氨基酸)[1]。

用Mega4.0軟件鄰位連接法將Fem1c氨基酸序列與其他14個(gè)物種的Fem1c氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5), 比較分析表明池蝶蚌Fem1c與太平洋牡蠣親緣關(guān)系最近, 其次是與海蝸牛接近, 而與人、老鼠等高等動(dòng)物親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn), 說明池蝶蚌在進(jìn)化地位上保守性很強(qiáng)。

3 討論

fem-1基因?qū)€蟲性別決定非常重要, 其產(chǎn)物在信號(hào)通路上起作用, 控制著線蟲性別分化的方向[7,25,26],它有兩個(gè)功能: 一是抑制 tra-1基因的活性, 從而使性別往雄性發(fā)展; 二是在生殖細(xì)胞中它對于精子的生成必不可少。對線蟲fem-1基因的研究表明性別決定基因在結(jié)構(gòu)和功能可能具備一定的進(jìn)化保守性[27]。

圖4 池蝶蚌Fem1c蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 4 The tertiary structure prediction of Fem1c in the Hyriopsis schlegelii

圖5 池蝶蚌Fem1c蛋白與其他物種Fem1c蛋白的進(jìn)化樹分析Fig. 5 Phylogenetic tree of the Fem1c of Hyriopsis schlegelii

本研究首次從淡水貝類中成功克隆到fem-1c基因cDNA的全長序列, 基因全長為2328 bp, 開放閱讀框長1869 bp, 編碼622個(gè)氨基酸, 其蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以 α螺旋為主, 其次為隨機(jī)卷曲; 池蝶蚌 Fem1c蛋白的一個(gè)重要特征是含有9個(gè)ANK模體。從已有報(bào)道顯示, ANK結(jié)構(gòu)域的生物功能主要是介導(dǎo)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。INK4家族是ANK結(jié)構(gòu)研究得最清楚的一類蛋白質(zhì)。1998年 Russ等發(fā)現(xiàn)該家族的四個(gè)成員p16INK4a、p15INK4b、p18INK4c和p19INK4d含有4或5個(gè)ANK模體, ANK結(jié)構(gòu)域是重要的功能區(qū), 它們可以特異性地抑制CDK4和CDK6的激酶活性, 對哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期G1后期的調(diào)控產(chǎn)生影響[28]; Jacobs和Harrison [29]在1998年報(bào)道過IkB蛋白質(zhì)家族成員都含有6個(gè)ANK序列, 通過與 NFkB上的 RHR結(jié)構(gòu)域發(fā)生作用, 抑制NFkB轉(zhuǎn)入細(xì)胞核或者阻止 NFkB 與 DNA 的結(jié)合; 2000年 Foord等[30]研究出 Swi6/Cdc10家族蛋白質(zhì)成員Swi4/6、Mbp1、Res1/2、Cdc10等都具有由5個(gè)ANK序列組成的核心結(jié)構(gòu)域, 其參與整個(gè)細(xì)胞周期中的信號(hào)傳導(dǎo)事件, 抑制CDK的活性, 從而影響轉(zhuǎn)錄激活。從這些研究中發(fā)現(xiàn)ANK結(jié)構(gòu)域通過介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間的相互作用可以參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和發(fā)育調(diào)控等等。池蝶蚌Fem1c蛋白ANK重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域具有高度的保守性, 通過比較發(fā)現(xiàn),不同物種的同源基因 ANK模體是各個(gè)序列中最保守的部分, 且這種保守性在 ANK家族蛋白中普遍存在, 從而認(rèn)為 ANK模體在這類蛋白的生化功能上有一定的重要性[31]。 因此, 池蝶蚌fem-1c基因中ANK 模體的高程度出現(xiàn), 可能在功能上與線蟲fem-1基因的性別決定作用有一定的進(jìn)化保守性。ANK模體在蛋白中多是以最少4個(gè)連續(xù)的ANK模體出現(xiàn)來調(diào)節(jié)蛋白間的相互間作用[32], 這說明在池蝶蚌中Fem1c蛋白可能也是通過與其他蛋白相互作用來參與調(diào)控。研究表明小鼠的Fem1a和Fem1b蛋白都編碼一段相同的區(qū)域: 7個(gè)重復(fù)串聯(lián)的ANK模體[33], 秀麗隱桿線蟲的Fem1蛋白也有6個(gè)ANK模體[7], 人和斑馬魚的 Fem1蛋白也同樣存在串聯(lián)的ANK模體[1]。而這些物種的fem-1基因在性別決定信號(hào)通路上起著舉足輕重的作用, 由此暗示了池蝶蚌fem-1c基因在細(xì)胞命運(yùn)決定信號(hào)通路中具有進(jìn)化保守性特征。

池蝶蚌fem-1c氨基酸序列與太平洋牡蠣fem-1c氨基酸序列同源性達(dá)到了 72%, 顯示出了該蛋白在進(jìn)化上的高度保守性。通過與選取的各個(gè)物種氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn), 它們在C端以一個(gè)含有11個(gè)氨基酸保守結(jié)構(gòu)域終止, 這個(gè)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列為: Pro-X-X-Leu-X-X-Phe-X-X-X-His(X為隨機(jī)氨基酸); 同時(shí)發(fā)現(xiàn)其中一些物種C端末為精氨酸殘基, 在一定程度上我們可以通過這些物種相同序列后面的C端精氨酸殘基來進(jìn)行區(qū)分, C端精氨酸殘基的功能目前并不清楚, 但是在這些物種中的保守性表明了它功能的重要性[1]。同時(shí), 從無脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物fem-1c基因的保守性表明它們有共同的起源, 可能暗示這個(gè)基因家族在這些生物的發(fā)育或者生理功能上具備保守性, 推測池蝶蚌fem-1c基因可能具備與線蟲fem-1基因在性別決定方面上相似的功能。

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STRUCTURE CHARACTERISTICS OF A MASCULINIZED FEM-1C GENE AND ITS PROTEIN FROM HYRIOPSIS SCHLEGELII

XIONG Wen-Fang, SHI Jian-Wu, JIANG Mou-Yan, CHEN Yong-Ling, PENG Kou, SHENG Jun-Qing, WANG Jun-Hua and HONG Yi-Jiang
(School of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031, China)

We first reported the masculinized feminization gene (fem-1c) in the freshwater pearl mussel Hyriopsis schlegelii, which was cloned by Race-PCR from gonad tissue. Gene structure, multiple sequence homology alignment, transmembrane region, hydrophilia and hydrophobic property, and functional domain prediction was further analyzed using bioinformatics approaches. The full length of fem-1c gene was 2328 bp that contained an open reading frame of 1869 bp encoding 622 amino acid residues. The corresponding protein was stable and hydrophilic. Multiple sequence homology alignment showed that the Fem-1c proteins from H. schlegelii and C. gigas shared the highest amino acid identity (79%). The secondary structure of fem-1c protein mainly contained α-helix and random coil forming 9 ankyrin repeat (ANK) motifs. We also found 9 ANK motifs clearly in tertiary structure prediction by SMART soft. The conservation of the fem-1c from invertebrates to vertebrates suggested that these genes have a common ancient origin and that they may play a conserved role in the functions of these organisms. These results suggest that fem-1c gene in Hyriopsis schlegelii may have the similar functions with nematode Caenorhabditis elegans in sex determination.

Hyriopsis schlegelii; fem-1c gene; Clone; Sequence analysis; Structure Prediction

Q781

A

1000-3207(2014)06-1002-06

10.7541/2014.148

2013-10-20;

2014-03-22

國家自然科學(xué)基金(31160534); 江西省科技落地計(jì)劃(12001); 江西省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(20112BBF60013, 20121BBF 60036); 江西省自然科學(xué)基金(20122BAB204016); 江西省教育廳科技項(xiàng)目(GJJ12020) 資助

熊文芳(1989—), 女, 江西豐城人; 碩士; 主要研究方向?yàn)樗锩庖吲c保護(hù)學(xué)。E-mail: xwfpepo1989@163.com

洪一江(1963—), 男, 福建南安人; 教授, 博導(dǎo); 主要研究方向?yàn)樗鷦?dòng)物遺傳育種學(xué)。E-mail: yijianghong@126.com