徐 敏 張海軍 鄧道貴 王文平 張曉莉 查嶺生

(淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 資源植物生物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 淮北 235000)

基于16S rDNA和COⅠ基因序列探討四種溞類的系統(tǒng)關(guān)系和分類地位

徐 敏 張海軍 鄧道貴 王文平 張曉莉 查嶺生

(淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 資源植物生物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 淮北 235000)

為了檢驗(yàn)已記錄的4 個(gè) 溞屬種類(隆 線 溞Daphnia carinata 、透明 溞D. hyalina 、蚤狀 溞D. pulex和大型 溞D. magna)的系統(tǒng)分類, 用試劑盒法分別提取4 種 溞類的基因組DNA。利用特異性引物, 通過PCR擴(kuò)增了4 種 溞屬種類的16S rDNA和COⅠ基因部分序列, 并與來自GenBank中每個(gè)種類相似度較高的同種序列進(jìn)行分析。結(jié)果表明, 基于16S rDNA和COⅠ基因, 4 個(gè) 溞屬種類的平均種間相似度分別為85.56%和80.67%,堿基中A+T含量均明顯高于G+C含量?；贑OⅠ基因, 巢湖隆線 溞與來自GenBank 上的擬同形 溞(Daphnia similoides AB549199)相似度為99%, 分歧度為0.4%—0.9%。就16S rDNA和COⅠ基因而言, 巢湖透明 溞更接近于盔形 溞(Daphnia galeata)。基于16S rDNA和COⅠ基因構(gòu)建的NJ樹和貝葉斯樹, 兩者的主要分枝基本一致。結(jié)果暗示, 巢湖隆線 溞 與擬同形 溞為一個(gè)種, 透明 溞 應(yīng)屬于盔形 溞。由于缺乏核基因的研究, 有關(guān)巢湖 溞屬的分類地位還需進(jìn)行更深入的探討。

溞屬; 16S rRNA; COⅠ基因; 系統(tǒng)分類

溞屬隸屬節(jié)肢動(dòng)物, 又稱水蚤或 溞, 是枝角類中重要的類群。本屬描述的種類超過 100種, 但僅有三十余種被準(zhǔn)確地鑒定, 我國(guó)現(xiàn)存的 溞屬種類有10余種[1,2]。 早期的 溞類分類研究主要依據(jù)其形態(tài)學(xué)特征。由于 溞屬動(dòng)物有十分豐富的變異類型, 屬內(nèi)近源種之間可以雜交, 因此 溞屬種類可能存在種間雜種。例如, 盔型 溞(Daphnia galeata)、 僧帽 溞(D. cucullata)、 透明 溞(D. hyalina)、 玫瑰 溞(D. rosea)、長(zhǎng)刺 溞(D. longispina)都 屬于盔型 溞的種復(fù)合體, 可以形成種間雜交種[3,4]。而近年來我國(guó)在枝角類的分類方面研究尚不多見, 在 溞屬種類的分類鑒定中存在界定模糊, 甚至出現(xiàn)鑒定錯(cuò)誤的現(xiàn)象[2,5]。我國(guó)的《中國(guó)動(dòng)物志·淡 水枝角類》中把同形 溞 歸到隆線溞一類, 沒有關(guān)于擬同形 溞的記載。此外, 只介紹了透明 溞的幾種變異類型, 也沒有對(duì)盔形 溞進(jìn)行描述。據(jù)報(bào)道, 我國(guó)一些水體中的同形 溞可能一直被命名為隆線 溞或者鸚鵡 溞[5]。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展, 分子標(biāo)記被逐漸應(yīng)用到物種的系統(tǒng)進(jìn)化研究中。Schwenk等用線粒體16S rRNA基因?qū)Σ糠种穷惙N類進(jìn)行分子系統(tǒng)進(jìn)化分析, 建立了比較直觀的系統(tǒng)進(jìn)化樹[6]; Gelas和Meester用線粒體COⅠ 基因分析了歐洲大型 溞的不同的單倍型[7]; Briski等采用線粒體COⅠ基因和16S rRNA基因的分子標(biāo)記方法, 利用船舶壓載水所攜帶的休眠卵識(shí)別外來入侵的無脊椎動(dòng)物[8]。近幾年來, 我國(guó)學(xué)者在象鼻 溞屬(Bosmina)[9]、盔形 溞(D. galeata)[10]、 秀體 溞屬(Diaphanosoma)[11]、 薄皮 溞屬(Leptodora)[12]、 圓形盤腸 溞(Chydorus sphaericus)[13]等枝角類的遺傳多樣性方面做了一些工作, 但對(duì)國(guó)內(nèi) 溞類種間系統(tǒng)分化的研究尚未見報(bào)道。本研究通過對(duì)安徽已發(fā)現(xiàn)的大型 溞、隆線 溞、透明 溞、蚤狀溞等四種 溞屬種類的16S rDNA和COⅠ基因序列進(jìn)行分析, 探討這些 溞屬種類的歸屬以及他們之間的分子系統(tǒng)關(guān)系, 初步解決一些傳統(tǒng)分類上存在爭(zhēng)議的分類問題, 以期為國(guó)內(nèi) 溞屬的分子系統(tǒng)學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

研究用大型 溞于2007年3月用25號(hào)浮游生物網(wǎng)在淮河采集; 蚤狀 溞 、隆線 溞 、透明 溞由2012年3月采集的巢湖沉積物中的休眠卵孵化而來, 并分離鑒定[2,14](表1)。 幾種 溞類均在智能光照培養(yǎng)箱中用斜生柵藻培養(yǎng), 2—3d更換一次培養(yǎng)液, 溫度為20 ℃ ±1℃、光照時(shí)間L︰D=12h︰12h。實(shí)驗(yàn)時(shí)用吸管吸取單只個(gè)體饑餓一晝夜后用雙蒸水沖洗, 離心管收集備用。

1.2 基因組DNA提取

本實(shí)驗(yàn)采用微量樣品基因組 DNA試劑盒(TIANamp Micro DNA Kit)提 取 溞屬DNA 。由于溞屬種類屬于小型甲殼動(dòng)物, 外被甲殼, 在提取前用滅菌的牙簽搗碎 溞體, 有利于蛋白酶K對(duì)組織進(jìn)行消化。

1.3 PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定

用于擴(kuò)增COⅠ基因引物:

COIF (5′-AYCAATCATAAGGACYATTGGRAC-3′)

COIR (5′-KGTGATWCCNACHGCTCAKAC-3′)

用于擴(kuò)增16S rDNA基因引物[15]:

L2510(5′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3′)

H3059(5′-CCGGTCTGAACTCAGATCATGT-3′)

PCR反應(yīng)體系25 μL, 每個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)含PCR Buffer 2.5 μL、dNTP 4.0 μL、Mg2+0.5 μL、模板DNA 1.0 μL、Taq酶0.25 μL、上下游引物各1.0 μL, 雙蒸水補(bǔ)足到25 μL。

擴(kuò)增條件為 95℃預(yù)變性 3min, 95℃變性 45s, 50℃退火 45s, 72℃延伸 45s, 共 35個(gè)循環(huán), 72℃10min充分延伸, 4℃結(jié)束。

表1 本研究中樣本的核苷酸序列的來源及編號(hào)Tab. 1 The origin and number of nucleotide sequence of samples in this study

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后, 選擇目的帶清晰且明亮的 PCR反應(yīng)產(chǎn)物送交生工公司純化, 并測(cè)序。其中16S rDNA采用雙向測(cè)序, 正反向?qū)Ρ群蟠_定分析用序列, 用DNASTAR中的seqnam比對(duì)后獲得隆線溞539個(gè)堿基, 對(duì)比峰圖修除兩端不可靠的堿基, 經(jīng)人工校正后5 溞個(gè)隆線 個(gè)體共獲得有效堿基為510-19個(gè)(C1S510、C2S517、C3S517、C4S515、C5S519)。同樣地, 溞蚤狀 的有效堿基為 479-22個(gè)(P1S479、P2S522), 溞透明 為482-20個(gè)堿基(H1S513、H2S520、H3S520、H4S482、H5S520、H6S520), 大溞型 為519個(gè)有效堿基。來自5個(gè)休眠卵孵化的隆線溞的16S rDNA序列完全相同, 來自6個(gè)休眠卵孵化溞的透明 的16S rDNA序列也完全相同, 溞蚤狀 的兩個(gè)序列存在多態(tài)性, 分別用P1、P2構(gòu)建進(jìn)化樹。在序列對(duì)比中, 溞除大型 只有1個(gè)個(gè)體外, 溞每種 取片段最長(zhǎng)的個(gè)體進(jìn)行比對(duì), 分別用C5S、H2S、M1S、P1S、P2S進(jìn)行分析(表1)。COⅠ基因采用單向測(cè)序,獲得5個(gè)種類16個(gè)個(gè)體長(zhǎng)度為499個(gè)堿基的COⅠ部分序列, 其中7 溞個(gè)隆線 個(gè)體中有4個(gè)單倍型, 透溞明 6個(gè)個(gè)體的COⅠ序列完全一致, 溞蚤狀 2個(gè)個(gè)體有2個(gè)單倍型。由于物種內(nèi)存在多態(tài)性, 溞隆線 、溞溞溞透明 、蚤狀 、大型 分別取C1I、C2I、C5I、C7I、H1I、P1I、P2I和M1I參與比對(duì)(表 1)。通過NCBI中BLAST比對(duì), 分別找出與本研究相似度最高的序列放在文中一起分析。參考已測(cè)出Daphnia pulex全序列[16](GenBank登錄號(hào)AF117817)中16S rRNA基因定位剪出AF117817的16S rRNA基因進(jìn)行比對(duì), 其他用于分析的下載序列見表1。

1.4 系統(tǒng)發(fā)生分析

用DNASTAR對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行人工校正, 并去除兩端冗余序列。使用BioEdit建立序列相似矩陣圖,用Clustalx1.81軟件多重序列比對(duì), 用DNAspV5分析變異位點(diǎn), 用Mega4.1計(jì)算不同序列間轉(zhuǎn)換/顛換數(shù)、生成序列差異位點(diǎn)表、并計(jì)算遺傳距離和構(gòu)建NJ進(jìn)化樹。采用K2P雙參模型計(jì)算兩兩遺傳距離,系統(tǒng)樹設(shè)置采用 P-distance模型, 兩種分子標(biāo)記分溞別以脆弱象鼻 和Bosmina cf. liederi為外群, Bootstrap Replications1000次; 用 Mrbayes3.2構(gòu)建貝葉斯樹, 替換模型設(shè)置參數(shù)nst=6 (GTR模型), 位點(diǎn)速率變異設(shè)置 invgamma, 其余設(shè)置為默認(rèn)值; 采用mcmc法運(yùn)算1000000代, 每100代取樣一次, 在舍棄25%老化樣本后, 用剩余樣本構(gòu)建一致樹。

2 結(jié)果

2.1 基于16S rDNA的結(jié)果分析

C5S、H2S、M1S、P2S在DNASTAR中經(jīng)過兩兩序列比對(duì), 平均種間相似度為 85.56%, 堿基中A+T(66.2%)含量明顯高于G+C(33.8%)含量。與來自GenBank上Daphnia的16S rDNA進(jìn)行序列比對(duì), 并計(jì)算遺傳距離(表2); 用DNAspV5進(jìn)行序列變異位點(diǎn)分析, 表2中12 溞個(gè) 個(gè)體可識(shí)別位點(diǎn)(包括缺失與丟失的位點(diǎn))445個(gè), 其中保守位點(diǎn) 326個(gè), 變異位點(diǎn)119個(gè), 單一位點(diǎn)18個(gè), 簡(jiǎn)約信息點(diǎn)101個(gè); 用MEGA軟件分析平均轉(zhuǎn)換/顛換(si/sv)數(shù)為 1.25, 轉(zhuǎn)換數(shù)明顯高于顛換數(shù)。就構(gòu)建的NJ樹(圖1)和貝葉斯樹來看, 兩者主要分枝基本一致。

表2 12個(gè)溞類個(gè)體16S rDNA的遺傳距離(對(duì)角線下)和序列相似度(對(duì)角線上)Tab. 2 The genetic distances (below diagonal) and sequence similarity (above diagonal) of 16S rDNA in twelve Daphnia individuals

圖1 基于12 溞個(gè) 屬個(gè)體16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(NJ樹)Fig. 1 NJ tree based on the sequence of 16S rDNA in twelve Daphnia individuals

2.2 基于COⅠ基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究發(fā)現(xiàn)4個(gè)種類16個(gè)個(gè)體的COⅠ基因部分序列中, 隆線 溞7個(gè)個(gè)體中, 有4個(gè)單倍型, 平均相似率為 99%, 有三個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)均發(fā)生轉(zhuǎn)換。蚤狀 溞2個(gè)個(gè)體序列相似度為98%(表3)。參與分析的4個(gè)種類8個(gè)個(gè)體中平均種間相似率為80.67%, 低于16S rDNA的種間相似度。A+T含量(69.25%)明顯高于 G+C(30.75)含量, 符合無脊椎動(dòng)物 A、T含量高的特點(diǎn)。用 DNAspV5分析可識(shí)別的位點(diǎn)數(shù)為569個(gè), 其中保守性位點(diǎn) 368個(gè), 變異位點(diǎn) 201個(gè),遠(yuǎn)大于16S rDNA的變異。單一位點(diǎn)15個(gè), 簡(jiǎn)約信息點(diǎn)186個(gè)(圖2)。用Mega 4.1軟件分析堿基的轉(zhuǎn)換/顛換樹之比為1.42。就構(gòu)建的NJ樹(圖2)和貝葉斯樹來看, 兩者主要分枝也基本一致。

圖2 基于17 溞個(gè) 屬個(gè)體線粒體COI基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(NJ樹)Fig. 2 NJ tree based on the sequence of mitochondrial COI gene in seventeen Daphnia individuals

表3 17個(gè)溞類個(gè)體基于線粒體COI基因的遺傳距離(對(duì)角線下)及序列相似度(對(duì)角線上)Tab. 3 The genetic distances (below diagonal) and sequence similarity (above diagonal) based on mitochondrial COI gene in seventeen Daphnia individuals

3 討論

3.1 有關(guān)幾種爭(zhēng)議溞類的命名和分類地位的探討

鸚鵡 溞和隆線 溞由于在形態(tài)上十分接近, 國(guó)內(nèi)學(xué)者在參考中國(guó)動(dòng)物志進(jìn)行鑒定時(shí)有可能把兩者混為一談, 統(tǒng)稱為隆線 溞[5,6]。近幾年來, 關(guān)于同形溞的報(bào)道逐漸增多, 以前以隆線 溞命名的種名逐漸更正為同形 溞[5]。 隆線 溞最早由King在1853年進(jìn)行繪圖描述, 我國(guó)的中國(guó)動(dòng)物志中也參考了King的形態(tài)描述, 記載了我國(guó)隆線 溞的分布。通過形態(tài)比對(duì),國(guó)內(nèi)學(xué)者早年描述的隆線 溞在形態(tài)上與 King的記載存在很大的區(qū)別[17]。在本研究中, 選用的 7個(gè)個(gè)體16S rRNA基因均相同而COⅠ基因有所不同, 這驗(yàn)證了16S rRNA基因相對(duì)保守、COⅠ基因變異較大的特點(diǎn)?；?6S rDNA序列可以看出, 與C5S相似度最大的為同形 溞(Daphnia similis), 相似度為94%?；贙2P模型分歧度為4.9%(表2), 接近5%的枝角類線粒體的種內(nèi)分歧度[18]。同時(shí), 基于COⅠ基因序列, 與C1I-C7I 相似度最大均為擬同形溞(Daphnia similoides)。基于 K2P模型分歧度為0.4%—0.9% (表3), 明顯小于枝角類種內(nèi)差異5%的數(shù)值。因此, 僅僅從線粒體序列差異來看, 巢湖隆線溞應(yīng)為擬同形 溞, 兩種不同標(biāo)記的進(jìn)化樹均支持以上結(jié)論(圖1、圖2)。這與顧楊亮等[17]結(jié)合形態(tài)分類的研究結(jié)果一致。

關(guān)于透明 溞和盔形 溞的歸屬也存在問題, 國(guó)內(nèi)學(xué)者分類一般參考《中國(guó)動(dòng)物志·淡水枝角類》[2]均以透明 溞命名。近年來, 國(guó)內(nèi)學(xué)者將透明 溞的命名逐漸更正為盔形 溞[19]。在本研究中, 巢湖透明 溞與盔形 溞基于16S rDNA的相似度為98%, 基于K2P模型的遺傳距離為0.7% (表2); 同時(shí)基于COⅠ基因相似度為97%—98%, 基于K2P模型的遺傳距離為1.8%—2.3% (表3); 兩種分子標(biāo)記均支持透明 溞為盔形 溞的結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的兩種進(jìn)化樹也均顯示巢湖透明 溞與盔形 溞的親緣關(guān)系最近(圖1、圖2)。據(jù)報(bào)道, 透明 溞 、盔形 溞 、僧帽 溞 、長(zhǎng)刺 溞等近源物種之間存在種間雜交的現(xiàn)象, 其雜交種具有外形相近、核基因相同線粒體基因相近或線粒體基因相同核基因相近的特點(diǎn)[6,20]。僅根據(jù)線粒體基因來劃分, 巢湖的透明 溞 應(yīng)與盔形 溞為同一個(gè)物種。在本研究中, 來自GenBank的D. mendotae在國(guó)內(nèi)尚未見記載, 且與巢湖透明 溞和來自GenBank 的盔形溞遺傳距離在種內(nèi)范圍內(nèi), 該種也可能為盔形 溞的種復(fù)合體。在今后的研究中將增加分子標(biāo)記的數(shù)量,以及增加核基因與線粒體基因進(jìn)行對(duì)比, 以確定巢湖 溞屬種類間是否存在種復(fù)合體。

3.2 四種溞類的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析

據(jù)報(bào)道, 16S rDNA進(jìn)化速度較慢且相對(duì)保守[21],而COⅠ基因變異相對(duì)較大, 約是16S rDNA的1.5倍[22]。在本研究中, 12 個(gè) 溞個(gè)體16S rDNA變異率(總變異數(shù)/可識(shí)別位點(diǎn)數(shù))為 26.7%, COⅠ基因的變異率為35.3%, 是16S rDNA變異率的1.32倍。兩種測(cè)序結(jié)果的A+T含量均明顯高于G+C的含量, 這一結(jié)果與其他學(xué)者在無脊椎動(dòng)物中研究結(jié)果相一致[23—25]。基于 COⅠ基因的 K2P雙參模型遺傳距離, 屬內(nèi)種間距離最小為 8.7%, 最大為 29.9%, 與端足類鉤蝦屬的種間距離一致(min 5.58—max 31.39)[26]。通過序列比對(duì)可以看出, 四種 溞類的 16S rRNA基因變異區(qū)較集中, 而COⅠ基因變異區(qū)較分散。兩種分子標(biāo)記構(gòu)建的進(jìn)化樹均顯示, 大型 溞 與擬同形 溞親緣關(guān)系最近, 這也符合形態(tài)分類標(biāo)準(zhǔn), 他們同為一個(gè)亞屬。大型 溞與擬同型 溞先聚為一支, 然后與盔形溞聚為一支, 最后與蚤狀 溞聚在一起; 根據(jù)進(jìn)化樹物種分枝時(shí)間不同, 四種 溞的進(jìn)化趨勢(shì)由低到高為蚤狀 溞— 盔形 溞— 大型 溞— 擬同形 溞。在本研究中,基于16S rDNA, 與P1S、P2S相似度最大和遺傳距離最小的均為短鈍 溞(D. obtusa), 其次才為蚤狀 溞;而在COⅠ基因的比對(duì)中與P1S、P2S相似度較高的均為蚤狀 溞; 在構(gòu)建的系統(tǒng)樹中, 基于16S rDNA的進(jìn)化樹出現(xiàn)了巢湖蚤狀 溞最先與短鈍 溞并為一支,而在基于COⅠ的進(jìn)化樹中卻沒有出現(xiàn)這種現(xiàn)象。另外, 基于16S rDNA, 巢湖蚤狀 溞與來自GenBank的蚤狀 溞種內(nèi)遺傳距離(0.81—0.86)大 于其他 溞種內(nèi)遺傳距離, 巢湖蚤狀 溞與來自GenBank 上的短鈍溞間的分類關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。線粒體為非編碼蛋白質(zhì)基因, 進(jìn)化過程中沒有受到密碼子選擇壓力影響, 其大部分區(qū)域發(fā)生的變異為中性突變[27], Schubart等提出的16S rDNA分子鐘理論, 即每百萬年序列變異為0.4%—0.9%[28]。P1S、P2S均來自巢湖休眠卵的孵化, 其基因序列差異為1%, 可以推測(cè)2個(gè)蚤狀 溞個(gè)體的分化時(shí)間約為1.11百萬—2.5百萬年前, 這在其他幾個(gè)個(gè)體中均沒有出現(xiàn)過。由此可見, 巢湖 溞屬種類的遺傳多樣性和種類的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系還需進(jìn)一步探討。

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PHYLOGENETIC RELATIONSHIP AND TAXONOMIC STATUS OF FOUR DAPHNIA SPECIES BASED ON 16S rDNA AND COⅠSEQUENCE

XU Min, ZHANG Hai-Jun, DENG Dao-Gui, WANG Wen-Ping, ZHANG Xiao-Li and ZHA Ling-Sheng
(Anhui Key Laboratory of Resource and Plant Biology, School of Life Science, Huaibei Normal University, Huaibei 235000, China)

To examine the systematic classification of four previously-recorded Daphnia species, D. carinata, D. hyalina, D. pulex, and D. magna, genomic DNAs of these species were extracted and PCR was used to amplify fragments of 16S rDNA and COⅠ gene by employing specific primers. The sequences of amplified fragments were compared with Daphnia species from the GeneBank. Based on 16S rDNA and COⅠ gene, the average interspecific similarity rate of four Daphnia species was 85.25% and 80.67% respectively, and the content of A+T was obviously higher than that of G+C. The similarity of D. carinata from Lake chaohu and D. similoides (AB549199) from the GeneBank was 99% according to COⅠ gene and the divergence rate was 0.4%—0.9%. D. hyalina from Lake Chaohu was more close to D. galeata from the GeneBank based on 16S rDNA or COⅠgene. Main branches of both NJ tree and bayes tree were similar. The results indicated that D. carinata and D. similoides were the same species, and D. hyalina belongs to D. galeata. Due to the lack of nuclear gene analysis, the classification status of Daphnia species in Lake Chaohu needs further investigation.

Daphnia; 16S rDNA; COⅠgene; Systematic classification

Q951+.3

A

1000-3207(2014)06-1040-07

10.7541/2014.153

2013-10-09;

2014-03-11

國(guó)家自然科學(xué)基金 (31370470)資助

徐敏(1983—), 女, 安徽蒙城人; 碩士研究生; 研究方向?yàn)楦∮紊锵到y(tǒng)進(jìn)化。E-mail: minxuzheng@126.com

鄧道貴, E-mail: dengdg@263.net