李 靜 李建宏 李文斌

(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 南京 210023)

抗生素和紫外照射聯(lián)合處理制備無菌微囊藻株

李 靜 李建宏 李文斌

(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 南京 210023)

目前我國大多數(shù)地表水體均已達(dá)到富營養(yǎng)化的程度,滇池、太湖等水體暴發(fā)的藍(lán)藻水華已造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失和環(huán)境災(zāi)難[1], 其中以銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)在數(shù)量和發(fā)生頻率上占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)[2]。由于常用微囊藻藻種附生細(xì)菌的存在, 不能準(zhǔn)確地應(yīng)用于藻類生理生化以及藻菌間相互作用, 特別是不能探索微囊藻與某一特定細(xì)菌的相互關(guān)系。另外, 由于細(xì)菌與藍(lán)藻有較近的遺傳距離, 很多從分子水平開展的研究工作, 也需要避免細(xì)菌的干擾, 因此, 獲得無菌的純培養(yǎng)物是許多研究的基本保證。目前對(duì)微囊藻水華的產(chǎn)生與水體中的各種理化因素的相互關(guān)系已有了一些研究[3], 但迄今對(duì)微囊藻水華產(chǎn)生的生物學(xué)機(jī)理所知有限。為在實(shí)驗(yàn)室控制條件下揭示微囊藻自身形成水華的機(jī)理, 亟需無菌的藻種作為研究材料。

藻種的無菌化通常可采用固體培養(yǎng)基平板畫線、殺菌劑(抗生素、雙氧水等)、離心洗滌、紫外線處理等方法[4—8]。對(duì)于一些生長繁殖迅速且對(duì)化學(xué)藥物耐受性較強(qiáng)的藻類,傳統(tǒng)的分離方法較易獲得無菌藻株, 但對(duì)于微囊藻而言卻十分困難。在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)過程中, 一方面微囊藻群體豐富的細(xì)胞壁多糖很容易裹挾細(xì)菌, 這些細(xì)菌難以通過畫線清除; 另一方面, 微囊藻對(duì)大多數(shù)化學(xué)藥物十分敏感,殺菌的藥物同樣也對(duì)藻細(xì)胞也產(chǎn)生強(qiáng)烈毒害作用, 因此難以直接用于清除細(xì)菌。

為獲得無菌的藻株用以深入開展微囊藻的細(xì)胞生物學(xué)研究, 本研究對(duì)一株群體微囊藻(M. aeruginosa XW01)進(jìn)行了無菌化處理, 分別通過附生菌抗生素敏感性篩選, 找出了有效抑殺細(xì)菌的抗生素種類、濃度和作用時(shí)間, 并結(jié)合紫外殺菌, 最終獲得了無菌的培養(yǎng)物。為基因測(cè)序等進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究及生理生化研究提供了有用材料。

1 材料與方法

1.1 藻種及培養(yǎng)條件

群體狀態(tài)銅綠微囊藻M. aeruginosa XW01(以下簡稱XW01), 為本實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)。微藻培養(yǎng)液為BG11[9], 所用培養(yǎng)基均高壓滅菌處理。

培養(yǎng)溫度為(26±2)℃, 光照條件為30—40 μmol/(m2·s), 40 W日光燈連續(xù)光照, 培養(yǎng)期間每天振蕩數(shù)次。

1.2 藻液中藻細(xì)胞與細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定

藻濃度用A650測(cè)定, 細(xì)胞數(shù)量采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

培養(yǎng)物中細(xì)菌的濃度采用混勻平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)。培養(yǎng)基采用LB固體培養(yǎng)[10], 每樣3個(gè)平行, 37℃培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)。

1.3 抗生素處理法

抗生素對(duì)XW01生長的影響 選取氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Km)、硫酸慶大霉素(Gm)、四環(huán)素(TE)、新霉素(N) 5種抗生素(購于上海生工生物工程有限公司)配制成10 mg/mL的母液, 使用時(shí)按需要量加入培養(yǎng)物。按照預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置各種抗生素的使用濃度分別為0、0.01、0.1、0.5、1、5 mg/L。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行組, 以未加抗生素的為對(duì)照組。取對(duì)數(shù)生長期的藻液3 mL接種于含有不同濃度抗生素的50 mL BG11液體培養(yǎng)基中(100 mL錐形瓶)培養(yǎng)。

XW01藻液中細(xì)菌的分離鑒定 經(jīng)鏡檢, 群體微囊藻外膠鞘上黏附大量細(xì)菌。取藻液100 μL 涂布于LB固體培養(yǎng)基上, 37℃培養(yǎng)3d, 挑取不同形態(tài)的單菌落劃線純化。通過16S rDNA基因于NCBI上比對(duì)鑒定分離的菌株[11]。

分離細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性實(shí)驗(yàn) 將分離的細(xì)菌用LB液體培養(yǎng)基搖菌培養(yǎng), 24h后, 取50 μL菌液在LB平板上進(jìn)行涂布。將分別含有5 μg/片的各含Amp、Km、Gm、TE和N濾紙片(直徑5.5 mm, 購自上海生工生物工程有限公司)平貼于該平板表面在溫室中培養(yǎng)3d, 檢測(cè)抑菌圈直徑。選擇抑菌圈直徑≥20 mm的抗生素為較敏感種類, 選為除菌藥物。

抗生素除菌時(shí)間的選擇 經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)可知, 微囊藻處于對(duì)數(shù)生長期時(shí), 其附生菌對(duì)抗生素更敏感?；谒幬锩舾袑?shí)驗(yàn)的結(jié)果, 分別采用5 mg/L N、5 mg/L N+5 mg/L Gm、5 mg/L N+5 mg/L Km+5 mg/L Gm對(duì)處于對(duì)數(shù)生長期微囊藻進(jìn)行無菌化處理。設(shè)置處理時(shí)間組為4、10、24、48h, 于不同處理時(shí)各取1 mL進(jìn)行細(xì)菌數(shù)量檢測(cè)。以初始藻液中菌數(shù)量為對(duì)照。

抗生素作用后藻的處理 將組合抗生素處理XW01后的藻液用無抗生素的BG11離心洗涕兩次, 以去除抗生素的影響。取100 μL置于BG11 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng);同時(shí)另取藻液3 mL于50 mL BG11液體培養(yǎng)基中(100 mL錐形瓶)培養(yǎng)。待藻成活后檢測(cè)是否無菌。

1.4 實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)藻紫外(UV)照射處理

UV光源為30 W UV燈管, 距離燈管40 cm處UV強(qiáng)度為1.25 μW/cm2, 通過調(diào)整照射時(shí)間控制輻射劑量。各實(shí)驗(yàn)組總UV照射劑量列于表1。

取 15 mL處于生長對(duì)數(shù)期的藻液, 將其倒入直徑9 cm高1.8 cm的培養(yǎng)皿中, 使其的初始濃度一致。置于距光源40 cm處進(jìn)行照射處理, 在預(yù)實(shí)驗(yàn)的前提下, 設(shè)計(jì)20—50min的輻射時(shí)間。在處理過程中加入電磁攪拌子進(jìn)行攪拌。分別于不同照射時(shí)間, 取樣分析殘留細(xì)菌數(shù)量,同時(shí)培養(yǎng)藻樣。以未經(jīng)UV照射為對(duì)照。

表1 不同照射時(shí)間下的總UV輻射劑量Tab. 1 UV irradiation amount of different exposure times

1.5 抗生素結(jié)合UV照射處理

藻培養(yǎng)物中加入組合抗生素(5 mg/L N+5 mg/L Gm)處理, 同時(shí)分別進(jìn)行5、10、20min UV照射處理。對(duì)照組加入等量的抗生素。然后置于UV燈下照射, 分別在照射5、10 和20min后取樣分析細(xì)菌, 并培養(yǎng)藻細(xì)胞。整個(gè)操作過程中抗生素的處理時(shí)間為1h。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)設(shè)置1個(gè)對(duì)照組, 3個(gè)實(shí)驗(yàn)平行組, 取平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Mean±SD)。用Origin 8.0進(jìn)行差異顯著性分析, T-test檢驗(yàn)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組之間的差異。

2 結(jié)果

2.1 微囊藻培養(yǎng)過程中細(xì)菌含量的變化

在微囊藻的液體培養(yǎng)物中, 細(xì)菌的數(shù)量隨著藻的生長而同步增加(圖 1)。在藻生長對(duì)數(shù)期, 細(xì)菌的增殖也處于旺盛階段。由于處于快速生長階段的細(xì)菌通常對(duì)毒害條件更敏感, 因此, 采用對(duì)數(shù)生長期的藻培養(yǎng)物(第 6天到第10天)進(jìn)行作為除菌材料應(yīng)更有利。

圖1 液體培養(yǎng)微囊藻XW01的生長曲線和培養(yǎng)物中細(xì)菌含量Fig. 1 The growth curve of M. aeruginosa XW01 and bacteria number in culture liquid

2.2 抗生素處理的效果

通過稀釋涂布平板法培養(yǎng), 從微囊藻中分離出 4株優(yōu)勢(shì)菌株。對(duì)其進(jìn)行16S rDNA 測(cè)序比對(duì)鑒定。4株菌分別為 B1: 單胞菌(Pseudomonas sp.)、B2: 鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas sp.)、B3: 鞘脂單胞菌(Sphingomonas sp.)、B4: 門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina), 對(duì)這4株菌進(jìn)行抗生素抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。

表2 分離細(xì)菌的抗生素抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Antibiotic sensitivity of bacterial isolation

從表2的結(jié)果可見, 只有Km、Gm和N對(duì)4株菌均有抑制作用, Amp對(duì)4株菌均無作用, TE僅對(duì)B3有一定的作用。3種有明顯抑菌效果的抗生素對(duì)不同的菌株抑制效果也各不相同。可見如果采用單種抗生素除菌, 很難有效除去所有細(xì)菌。因此選擇了N、Km、Gm進(jìn)行組合純化微囊藻XW01。

經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn), 抗生素濃度為 5 mg/L較為合適, 更高的濃度容易殺死藻細(xì)胞。比較了 3個(gè)不同的抗生素組合: 5 mg/L N、5 mg/L N+5 mg/L Gm、5 mg/L N+5 mg/L Km+ 5 mg/L Gm, 處理后微囊藻細(xì)胞密度后細(xì)菌數(shù)量如圖2所示。

由圖2結(jié)果可見: 處理24h后, 5 mg/L N的藻液中菌落數(shù)為 15個(gè)/mL, 說明單一的 N 未能完全殺滅細(xì)菌; 5 mg/L N+5 mg/L Gm組合抗生素除菌率為100%; 但在5 mg/L N+5 mg/L Gm的基礎(chǔ)上, 再加入5 mg/L Gm抑菌效果反而降低, 不能將藻液中的細(xì)菌完全排除。其原因可能是抗生素之間存在相互拮抗, 這與林偉利用抗生素純化微藻結(jié)果一致[12]。延長抗生素作用時(shí)間可提高殺菌效果, 但同樣也對(duì)藻細(xì)胞的活力產(chǎn)生傷害, 第3天藻細(xì)胞數(shù)量開始減少。經(jīng)抗生素處理超過24h時(shí), 雖然顯微鏡下藻細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化, 但大部分藻細(xì)胞已不能再生長繁殖, 藻細(xì)胞逐漸死亡。經(jīng)5 mg/L N+5 mg/L Gm組合處理后, 經(jīng)過一個(gè)月左右的培養(yǎng), 藻細(xì)胞培養(yǎng)存活情況見表3。

圖2 不同處理時(shí)間不同組合抗生素對(duì)細(xì)菌的影響Fig. 2 The effect of different treating time and different antibiotic combinations on the amount of bacteria

表3 組合抗生素處理XW01藻細(xì)胞和細(xì)菌的生長情況Tab. 3 The survive of XW01 cell and bacteria after treatment of mixed antibiotics

經(jīng)5 mg/L N+5 mg/L Gm處理24h后的藻液初步測(cè)定已無菌化。取出上層漂浮的 XW01藻細(xì)胞經(jīng)過兩次洗滌后, 分別接入BG11固體和液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。經(jīng)抗生素傷害后的藻細(xì)胞長勢(shì)均很緩慢, 固體培養(yǎng)基上一個(gè)月左右才出現(xiàn)單藻落, 液體培養(yǎng)基中 25d左右明顯可見藻生長。處理48h、72h的藻液在兩種培養(yǎng)基上均未見生長。實(shí)驗(yàn)過程中抗生素處理 24h后再培養(yǎng)的無菌藻大部分不再存活, 僅通過大量重復(fù)才獲得無菌藻株。

2.3 UV輻射除菌結(jié)果

對(duì)藻液進(jìn)行不同時(shí)間UV照射處理后的菌落個(gè)數(shù)見圖3, 微囊藻培養(yǎng)物中細(xì)菌數(shù)量與UV照射處理時(shí)間成反比。

圖3 不同UV照射時(shí)間藻液中細(xì)菌數(shù)量Fig. 3 The amount of bacteria under different treating times with UV radiation

在照射30min時(shí), 除菌率已達(dá)到了99.97% (P<0.01)。但繼續(xù)增加處理時(shí)間(40和50min), 除菌率則基本不再下降(差異不顯著P>0.05)。UV處理30 min時(shí), 細(xì)菌個(gè)數(shù)約122個(gè)/mL, 處理 50min時(shí), 細(xì)菌數(shù)約 40個(gè)/mL, 但大于30 min的UV照射后藻細(xì)胞也基本全部被殺死, 難以再培養(yǎng)。因此, UV照射的時(shí)間不能超過30min。

2.4 抗生素結(jié)合UV照射的除菌效果

為有效獲得無菌藻株, 將 UV照射和抗生素處理相結(jié)合同時(shí)處理對(duì)微囊藻進(jìn)行了除菌純化。將含有 5 mg/L N+5 mg/L Gm的藻液經(jīng)不同UV照射時(shí)間處理的除菌結(jié)果見圖 4: 未經(jīng) UV處理的 XW01藻液中細(xì)菌數(shù)為 844個(gè)/mL, 添加組合抗生素的藻液在UV照射5min時(shí), 細(xì)菌數(shù)量就迅速減少到了8個(gè)/mL, 處理10min時(shí), 藻液中細(xì)菌已完全除去。

再培養(yǎng)的 XW01藻細(xì)胞和細(xì)菌的生長情況見表 4:經(jīng)過10min聯(lián)合處理的藻液, 細(xì)菌已全部殺滅, 藻細(xì)胞依然有部分存活; 但處理 20 min的藻, 卻無法再培養(yǎng)出藻細(xì)胞。

圖4 抗生素結(jié)合UV照射除菌效果Fig. 4 The sterilization effect of mixed antibiotics combined with UV radiation

表4 抗生素-UV聯(lián)合處理后再培養(yǎng)的XW01藻細(xì)胞和細(xì)菌的生長結(jié)果Tab. 4 The survive of XW01 cell and bacteria after treatment of mixed antibiotics combined with UV radiation

3 討論

對(duì)于可產(chǎn)生氣囊漂浮于水面的藍(lán)藻, 獲得無菌藻株的經(jīng)典方法是通過離心洗滌去除細(xì)菌, 或(和)通過平板稀釋劃線獲得無菌藻株, 這兩種方法運(yùn)用于單細(xì)胞藻是有效的, 但對(duì)于微囊藻這樣很多細(xì)胞形成的群體則難以奏效。其原因可能是群體中豐富多糖裹挾的細(xì)菌, 通過簡單的洗滌和稀釋難以使菌藻分離。Sensen, et al.利用流式細(xì)胞儀分離出了無菌的單細(xì)胞藍(lán)藻[13]。Makoto, et al.運(yùn)用1.4%的UV低溫凝膠處理一個(gè)月, 分離出了7株無菌的藍(lán)藻[14]。Ichiro, et al.設(shè)置了20—30 μmol/(m2·s)的燈光利用藻細(xì)胞的上浮性獲得無菌藻株[15]。這些方法都是利用了微藻與細(xì)菌的某些不同特征得到無菌藻株, 但這些方法單一的處理對(duì)群體的微囊藻而言并不能分離出無菌藻株。

不同的抗生素可通過不同的途徑抑制細(xì)菌的繁殖,可作為藻培養(yǎng)物除菌的有效工具[16]。本文通過比較附生的細(xì)菌對(duì)抗生素敏感性不同, 選擇5 mg/L N和5 mg/L的Gm混合加入到處于生長期的XW01藻液中可分離純化出無菌藻株。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 組合抗生素處理藻液 24h, 除菌效果即可達(dá)到最佳狀態(tài), 處理時(shí)間越短對(duì)藻細(xì)胞活性影響越小, 這與Droop, et al.研究得一致[17]。但是本研究也發(fā)現(xiàn), 僅僅采用抗生素處理的方法, 很難在清除細(xì)菌和保留微囊藻活性間找到平衡點(diǎn), 這與Sakami, et al.對(duì)具毒岡比甲藻(Gambierdiscus toxicus)兩個(gè)分離株生長結(jié)果相似[18]。可能是因?yàn)樗{(lán)藻(藍(lán)細(xì)菌)與其他細(xì)菌具有類似的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理代謝過程, 超過藻類閾值的抗生細(xì)素濃度會(huì)對(duì)藻細(xì)胞造成傷害, 破壞藻細(xì)胞, 抑制藻細(xì)胞組成成分的形成[19]。本研究經(jīng)過一年時(shí)間多次重復(fù)嘗試后才獲得無菌藻株。

在自然環(huán)境下, 藍(lán)藻常常暴露在高強(qiáng)度的 UV輻射下, 并且擁有一套完整的自我保護(hù)機(jī)制[20]。藍(lán)藻細(xì)胞在陽光的誘導(dǎo)下合成了抗氧化相關(guān)的超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)、促進(jìn)胞外多糖的產(chǎn)生并形成較大的群體[21]、并形成偽枝藻素(Scy)、類菌胞素氨基酸(MAAs)等UV屏障物質(zhì)來抵抗UV的傷害[22,23], 因此, 藍(lán)藻具有較強(qiáng)的抗UV能力。但絕大多數(shù)細(xì)菌的抗UV保護(hù)機(jī)制遠(yuǎn)弱于藍(lán)藻, 在UV下更易受到傷害。這為消除藍(lán)藻附生細(xì)菌提供了一條可用的途徑。Gerloff, et al.就采用UV殺菌獲得了無菌聚球藻[24], 本研究運(yùn)用組合抗生素聯(lián)合 UV照射方法純化群體微囊藻, 加入5 mg/L N和5 mg/L Gm結(jié)合UV處理10min時(shí)即可無菌化XW01藻株, 藻培養(yǎng)存活的機(jī)率大大高于抗生素長時(shí)間處理。N和Gm都為氨基糖苷類抗生素, 主要與細(xì)菌核糖體30S亞單位結(jié)合, 抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。在加入組合抗生素后, 殺滅細(xì)菌效率大大提高, 這可能與細(xì)菌產(chǎn)生的一種R因子使細(xì)菌對(duì)UV輻射抗性減弱有關(guān)[25]。本研究最終獲得無菌藻株結(jié)果表明, 選擇合適的抗生素結(jié)合一定的UV照射是獲得無菌微囊藻的有效方法。

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PREPARATION OF AN AXENIC MICROCYSTIS STRAIN WITH ANTIBIOTICS AND UV IRRADIATION

LI Jing, LI Jian-Hong and LI Wen-Bin
(College of Life Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China)

微囊藻; 無菌株; 抗生素; 紫外照射

Microcystis; Axenic strains; Antibiotic; Ultraviolet radiation

Q-33

A

1000-3207(2014)03-0592-05

10.7541/2014.84

2013-12-03;

2014-03-01

國家自然科學(xué)基金(31370217); 江蘇省優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目; 國家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金(J1103507)資助

李靜(1988—), 女, 湖北黃岡人; 碩士研究生; 主要專業(yè)方向?yàn)樵孱悓W(xué)。E-mail: lj5633258@163.com

李建宏(1963—), 教授; 主要研究方向?yàn)樵孱悓W(xué)。E-mail: lijianhong@njnu.edu.cn