張 鳳李周全閆利明,羅紹祥鐘利橋

張曉華1袁 麗1方 勤3戴和平1

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 3. 中國科學(xué)院病毒研究所, 病毒學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430071)

利用噬菌體展示技術(shù)淘選草魚呼腸孤病毒的單鏈抗體

張 鳳1,2李周全1,2閆利明2,3羅紹祥1,2鐘利橋1,2

張曉華1袁 麗1方 勤3戴和平1

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 3. 中國科學(xué)院病毒研究所, 病毒學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430071)

草魚呼腸孤病毒(GCRV)是引起我國大面積草魚幼魚出血病暴發(fā)的主要病原, 其外衣殼蛋白 VP5和VP7在病毒入侵宿主細(xì)胞過程中起著至關(guān)重要的作用。研究以原核表達(dá)的VP7、全長VP5、VP5的N端片段及C端片段為靶蛋白, 利用已構(gòu)建的噬菌體展示單鏈抗體文庫進(jìn)行淘選。經(jīng)過3輪淘選后, 共獲得7個針對VP7、VP5、VP5N和VP5C的單鏈抗體。經(jīng)過驗(yàn)證, 識別原核表達(dá)的VP7的兩個單鏈抗體能夠成功識別天然GCRV病毒。此結(jié)果對于進(jìn)一步研究GCRV與宿主細(xì)胞的相互作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

草魚呼腸孤病毒; VP5; VP7; 噬菌體展示; 單鏈抗體

草魚呼腸孤病毒(Reovirus of grass carp, GCRV)是我國分離的第一株魚類病毒[1,2], 隸屬水生呼腸孤病毒屬, 也是該屬中致病性最強(qiáng)的一種病毒, 是引起我國大面積草魚幼魚出血病暴發(fā)的主要病原體,死亡率高達(dá) 80%, 給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了極大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。除了草魚, GCRV 還能感染青魚(Mylopharyngodon piceus)、麥穗魚(Pseudorasbora parva)、布氏條(Hemicculter leuciclus)、稀有鯽(Gobiocypris rarus)、鰱(Hypophthalmichthys molitrix)等[4—6]。目前對于該病的防治仍以預(yù)防為主, 該病毒與宿主細(xì)胞作用的分子機(jī)理亟待揭示, 以期為草魚出血病的防治提供新的突破。

GCRV為二十面體對稱的球形顆粒, 基因組由11條(S1-S11)分段的雙鏈RNA組成[2], 編碼12種蛋白質(zhì), 包括7種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-VP7)和5種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1-NS5)[7]。其中, 結(jié)構(gòu)蛋白VP5和VP7以200個異源六聚體的形式構(gòu)成了病毒的外層衣殼蛋白, 其作用可能與病毒侵染及進(jìn)入細(xì)胞的方式有關(guān)[8,9]。目前已有報道, 針對VP5和VP7的多抗血清具有中和GCRV的效應(yīng)[10—12], 但是多抗血清中的多克隆抗體對病毒識別的位點(diǎn)多且雜, 無法特異性地研究病毒與細(xì)胞的結(jié)合及侵染過程[13]。楊倩等[14]利用傳統(tǒng)雜交骨髓瘤方法得到了識別VP7蛋白的單克隆抗體,為建立快速檢測GCRV的方法奠定了基礎(chǔ)。但是傳統(tǒng)的單克隆抗體制備往往價格高昂, 制備周期長,并且需要免疫小鼠, 因此限制了其大批量的生產(chǎn)和應(yīng)用。

噬菌體展示單鏈抗體主要通過將工程化的抗體基因片段插入到噬菌體外殼蛋白基因中, 達(dá)到抗體與外殼蛋白融合表達(dá)并展示于噬菌體表面的目的。通過幾輪對目的抗原的淘選, 目標(biāo)抗體即可快速且廉價地獲得[15], 此抗體在大腸桿菌中表達(dá)分泌, 產(chǎn)量也是無限的; 另外, 由于不需要免疫動物, 通過噬菌體展示技術(shù)獲得單克隆抗體的方法更方便快捷。

本研究利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的噬菌體展示鼠源天然單鏈抗體文庫, 以草魚呼腸孤病毒外殼蛋白VP5和VP7為抗原進(jìn)行淘選, 共獲得了7個針對VP5和VP7的單鏈抗體。經(jīng)過驗(yàn)證, 其中兩個識別原核表達(dá)VP7的單鏈抗體能夠成功識別天然GCRV病毒。這兩個單鏈抗體將成為后續(xù)進(jìn)一步研究病毒與細(xì)胞相互作用的有效工具。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒載體及菌種

庫容量1.2×109的鼠源天然大容量單鏈抗體噬菌體展示文庫由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[16], 噬菌體載體pCANTAB5E及其宿主菌大腸桿菌TG1購自Pharmacia公司。采用pRSETA原核表達(dá)載體構(gòu)建的GCRV VP5及VP7重組表達(dá)質(zhì)粒及菌株BL21(DE3)- pLysS來自中國科學(xué)院武漢病毒研究所方勤老師實(shí)驗(yàn)室[17,18]。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

PCR引物為武漢擎科公司合成, 限制性內(nèi)切酶XhoI和PstI購自Takara公司, PfuDNA聚合酶和T4DNA連接酶為Fermentas公司產(chǎn)品。HRP/Anti-M13單克隆抗體及HRP標(biāo)記的鼠抗His-tag單克隆抗體購自Novagen公司, HRP標(biāo)記的兔抗E tag多克隆抗體為Abcam公司產(chǎn)品。質(zhì)粒提取試劑盒及DNA膠回收試劑盒購自北京百泰克公司。大腸桿菌培養(yǎng)基2YT、SOBAG和LB配方見Pharmacia和Novagen公司說明書, 大腸桿菌周質(zhì)空間混合物提取緩沖液1×TES和1/5×TES緩沖液配方見Pharmacia公司說明書。氨芐青霉素(Amp)購自Amresco公司, 工作濃度為100 μg/mL; 氯霉素(Chl)購自Genview公司, 工作濃度為50 μg/mL。PBSM為含4%脫脂牛奶的PBS溶液, PBST為含0.1%Tween 20的PBS溶液。Western Blot反應(yīng)底物DAB溶液的配方為: 10 mL Tris-HCl (pH 7.6, 50 mmol/L), 10 μL H2O2, 6 mg DAB。ELISA底物TMB的配方為: 2.5 mL 0.1 mol/L醋酸鈉溶液 (pH 6), 250 μL TMB (溶于二甲亞砜, 60 mg/mL), 10 μL H2O2,加蒸餾水至終體積25 mL。

1.3 VP5和VP7的誘導(dǎo)表達(dá)

VP5和VP7的表達(dá)參照張嵐嵐等的方法[17,18]。簡述步驟如下: 將新鮮轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)-PlysSpRSETAVP7/VP5菌株接種于LB+Amp+Chl培養(yǎng)基中, 37℃培養(yǎng)至A600=0.8, 加入IPTG至終濃度為1 mmol/L, 30℃誘導(dǎo)過夜(約18h)。培養(yǎng)產(chǎn)物在4 , ℃8000 g離心15min, 分離菌體和培養(yǎng)基上清。棄上清,將沉淀以50 g/L的濃度重懸于純化蛋白所用的1×binding buffer中, 冰浴條件下用超聲波破碎儀破碎細(xì)胞, 然后在4 , ℃ 10000 g離心10min, 分別收集沉淀和上清。

將所獲沉淀和上清與誘導(dǎo)前菌液一起, 進(jìn)行十二烷基磺酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE),之后將分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)上, 麗春紅染色并標(biāo)出marker的位置。洗凈后用4%PBSM (脫脂奶粉的PBS溶液, 4%為質(zhì)量體積比)室溫封閉NC膜1h, PBS洗三次之后, 用HRP標(biāo)記的鼠抗His tag孵育1h, PBST和PBS各洗三次, DAB底物溶液中顯色, 檢測目的蛋白的表達(dá)情況。

參照pET載體系統(tǒng)使用說明書, 分別采用自然條件和尿素溶解包涵體的方式純化VP5和VP7蛋白。尿素變性純化的蛋白采用逐漸減低尿素濃度法使蛋白復(fù)性, 得到可溶的目的蛋白。

1.4 VP5N和VP5C的克隆表達(dá)

根據(jù)Genbank中公布的VP5基因序列(Accession No.為AF403392), 設(shè)計(jì)兩對帶有XhoI和PstI酶切位點(diǎn)的特異性引物(表1), 以pRSETAVP5質(zhì)粒為DNA模版, 用PCR分別擴(kuò)增VP5的N端片段(VP5N)和C端片段(VP5C)。用XhoⅠ和Pst I將VP5N和VP5C的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切后, 與同樣雙酶切的pRSETA質(zhì)粒載體連接, 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)–pLysS中,通過LB+Amp+Chl平板篩選, 得到陽性克隆株(稱為BL21pRSETAVP5N/C)。BL21pRSETAVP5N/C的表達(dá)純化與VP5的表達(dá)純化步驟相同, 參見VP5的表達(dá)純化。

表 1 VP5N和VP5C片段PCR擴(kuò)增引物Tab. 1 PCR primers for VP5N and VP5C

1.5 純化VP7、VP5、VP5N和VP5C對小鼠天然抗體庫的淘選

本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的大容量天然(Naive)噬菌體展示單鏈抗體文庫以噬菌粒形式保存在宿主菌中, 在進(jìn)行淘選之前, 需加入輔助噬菌體M13K07將其拯救成展示于PIII蛋白末端的噬菌體單鏈抗體(phagescFv)形式。具體方法見Barbas, et al.[19]的敘述。將VP7等抗原蛋白通過與樹脂結(jié)合的方式固定, 具體操作為: 取20 μL NTA His Bind樹脂(Novagen)按照說明書進(jìn)行清洗、離子化和平衡之后, 分別加入10 μg用結(jié)合緩沖液稀釋至200 μL的帶有His標(biāo)簽的VP7等目的蛋白, 4℃放置過夜。為盡量減少NTA的基質(zhì)效應(yīng)對淘選的影響, 先將拯救好的噬菌體展示抗體庫與等體積的空載樹脂預(yù)保溫15min, 然后將未結(jié)合的抗體庫轉(zhuǎn)移到VP7等抗原包被過的樹脂中,于室溫條件下微震蕩孵育2h。接下來用蛋白純化所用的漂洗緩沖液(含0.1%Tween-20)洗10次(3min/次),再用不含Tween-20的漂洗緩沖液洗10次(3min/次)。最后用1×洗脫緩沖液洗脫20min, 立即將洗脫下來的phage加入新鮮制備的大腸桿菌TG1(A600=0.3—0.5)中, 于37℃保溫1h后涂布SOBAG平板, 30℃過夜生長。第2天用2YT-AG培養(yǎng)基(AG表示含100 mg/L Amp, 2%Glucose)刮下平板上的菌落, 拯救成噬菌體形式抗體后進(jìn)行下一輪淘選, 如此共進(jìn)行3輪淘選。

1.6 ELISA鑒定淘選陽性克隆

從最后一輪淘選的平板上隨機(jī)挑取單克隆至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板, 培養(yǎng)并拯救其形成phage-scFv, 對原核表達(dá)的VP7等靶蛋白分別進(jìn)行ELISA檢測, 方法如下: 將純化的VP7等靶蛋白用PBS稀釋至1000 ng/mL, 以100 μL/孔的量加入96孔板, 37℃包被1h, PBS洗三次; PBSM封閉1h后, 用PBS洗三次;加入100 μL用PBSM 1∶1稀釋的含有phage-scFv的培養(yǎng)基上清, 37℃保溫1h; PBST和PBS分別洗板三次, 加入100 μL PBSM稀釋的HRP/Anti-M13單克隆抗體(1 5000), 37℃保溫1h; PBST和PBS再分別洗板三次, 加入TMB底物顯色, 10min后加25 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng), 酶標(biāo)儀讀取450nm的吸光值。

初步鑒定為陽性克隆后, 需確認(rèn)scFv識別的是目的蛋白序列, 而非載體序列。方法為: 分別用目的蛋白及同載體的其他蛋白包被ELISA板, 重復(fù)上面的ELISA過程。確定為陽性克隆后, 再誘導(dǎo)表達(dá)為可溶性單鏈抗體形式進(jìn)行下一步分析, 可溶性單鏈抗體在大腸桿菌中的表達(dá)參見張曉華等的方法[20], 簡述如下: 離心獲取IPTG過夜誘導(dǎo)后的菌體, 加入1×TES緩沖液充分重懸菌體, 再加入1/5×TES緩沖液混勻, 冰浴30min; 12000 r/min離心, 上清即為含∶有可溶性單鏈抗體的大腸桿菌周質(zhì)空間提取物。不能夠形成可溶性單鏈抗體的菌株, 直接取含有phage-scFv的培養(yǎng)基上清完成后續(xù)試驗(yàn)。

將最終確定為陽性克隆的單鏈抗體, 使用通用引物S1: 5′-GACCATGATTACGCCAAGC-3′進(jìn)行基因測序(華大公司)。

1.7 ELISA和 Western Blot分析陽性單鏈抗體對原核表達(dá)抗原的識別

分別將原核表達(dá)純化的VP7等抗原蛋白進(jìn)行12%的SDS-PAGE電泳變性, 恒定電壓140伏, 90min。將變性蛋白條帶電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC膜)上, 恒定電流100 mA, 持續(xù)時間1h。轉(zhuǎn)膜后將膜用PBSM封閉1h, PBS洗三次后, 加入用PBSM稀釋的抗體, 37℃保溫孵育1h; PBST和PBS分別洗膜三次, 加入PBSM稀釋(1∶5000)的E tag抗體(Abcam公司), 37℃保溫孵育1h, PBST和PBS分別洗膜三次,加入DAB顯色液顯色。

1.8 Western Blot和Dot Blot分析陽性單鏈抗體對真核細(xì)胞培養(yǎng)病毒的識別

用GCRV病毒感染草魚頭腎細(xì)胞(CIK細(xì)胞), 并獲取含有病毒的細(xì)胞裂解液上清, 具體制備方法參見張嵐嵐等[17]。分別取細(xì)胞裂解液上清0.5、1、2、4、8 μL, 加入等體積2×loading buffer混勻, 煮沸8min后上樣, 進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳分析。另外,取未經(jīng)GCRV感染的CIK細(xì)胞裂解液上清8 μL進(jìn)行同樣操作, 作為陰性對照。后續(xù)過程與前面Western Blot檢測抗體識別變性原核表達(dá)抗原相同, 區(qū)別在于, 延長PBST和PBS的洗滌時間, 以免非特異吸附影響后面的化學(xué)發(fā)光顯色。Dot Blot檢測步驟如下,分別取兩份0.1、0.5、1、2 μL含病毒的細(xì)胞裂解液上清, 一份直接點(diǎn)至NC膜; 另一份加入等體積不含甘油和溴酚藍(lán)的2 × SDS-PAGE上樣緩沖液 [配方為100 mmol/L Tris-Cl (pH 6.8), 4% (m/v)SDS, 200 mmol/L DTT]混勻, 煮沸8min后, 也點(diǎn)至NC膜上。晾干后,用PBSM將膜封閉1h, 接著加入PBSM稀釋的scFv抗體, 37℃保溫1h, PBST和PBS各洗三次(10min/次),然后加入相應(yīng)二抗, 37℃保溫1h, PBST和PBS各洗三次(10min/次), 加入化學(xué)發(fā)光底物顯色。

2 結(jié)果

2.1 VP5、VP7、VP5N和VP5C的表達(dá)與純化

GCRV外殼蛋白VP5大小約為68 kD[21], 一方面為了易于原核表達(dá), 另一方面, 也期望通過對截短蛋白的淘選獲取識別全長的單鏈抗體,利用 SWISSMODEL軟件(http://swissmodel.expasy.org/workspace/index.php?func= workspacemodelling&userid)對其疏水性等性質(zhì)進(jìn)行分析后, 將其分段克隆至pRSETA 載體, 分別命名為 VP5N 和VP5C(序列長度分別為 1110和 1134 bp,中間約有 300個堿基的重合), 與 VP5、VP7同時進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。用1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)過夜后, 對破菌上清和沉淀進(jìn)行Western Blot分析, 結(jié)果(圖1)顯示, 只有VP7誘導(dǎo)后, 在破菌上清中有較多可溶形式的目的蛋白, VP5、VP5N和VP5C均集中在包涵體沉淀中, 上清中含量很少。故 VP7在非變性條件下得到了有效純化,而VP5、VP5N和VP5C均需在尿素變性條件下才能獲得純化蛋白, 最后通過逐漸降低尿素濃度法使其復(fù)性。圖1顯示純化的VP5、VP5N和VP5C在對應(yīng)的蛋白理論大小下面還有幾條較弱條帶, 可能是稀有密碼子處終止導(dǎo)致的表達(dá)不完全造成的, 但這些不完全表達(dá)的片段所占含量較小, 對后續(xù)淘選過程應(yīng)該不會有較大影響。

圖1 VP7、VP5、 VP5N、VP5C原核表達(dá)與純化的SDS-PAGE與Western Blot分析結(jié)果Fig. 1 SDS-PAGE and Western Blot analysis of expression and purification of four antigens (A)VP5; (B) VP5N; (C) VP7; (D) VP5C

2.2 針對原核表達(dá)VP7、VP5、VP5N和VP5C單鏈抗體的淘選及序列分析

以純化的重組VP7、VP5、VP5N和VP5C為靶蛋白, 分別對本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的非免疫小鼠單鏈抗體庫進(jìn)行三輪淘選。在淘選中, 用His Bind 樹脂代替?zhèn)鹘y(tǒng)的免疫管固定抗原, 這一做法的優(yōu)越處在于,帶有 His Tag的抗原蛋白通過 His Tag序列與 His Bind樹脂的 Ni2+結(jié)合, 而另一端的目的蛋白就游離于溶液中, 更容易保持它原有的結(jié)構(gòu)。淘選的結(jié)果是分別得到了兩個針對VP7(19B7、P1A3)、VP5N(25G10、24B6)和 VP5C(26F4, 26D9)的單鏈抗體, 及一個針對VP5(29E12)的單鏈抗體。利用S1通用引物對編碼單鏈抗體的基因序列進(jìn)行測序, 翻譯后的單鏈抗體氨基酸序列比對表明, 抗體序列差異主要集中于重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR區(qū)), 具體差異列于表2。另外,針對VP5蛋白的單鏈抗體29E12重鏈可變區(qū)(VH)缺失, 僅含有輕鏈可變區(qū)片段(VL), VL的CDR序列也示于表2。

表 2 scFv抗體重鏈可變區(qū)CDR的氨基酸序列(29E12為輕鏈可變區(qū))Tab. 2 Amino acid sequence of the VH region complementary determinant regions (CDR) of isolated single-chain variable (scFv) antibodies (VL for 29E12)

對所得陽性單鏈抗體進(jìn)行可溶性表達(dá), 分別收集周質(zhì)空間、破菌上清和破菌沉淀, 對其進(jìn)行SDS-PAGE及Western Blot分析, 結(jié)果顯示除了針對VP7的scFv P1A3, 針對VP5的scFv 29E12不能進(jìn)行可溶性表達(dá)外, 其余陽性克隆經(jīng)過IPTG誘導(dǎo), 均能表達(dá)出可溶性單鏈抗體。對于不能形成可溶性抗體的 scFv P1A3和 29E12, 直接離心獲取含有phage-scFv的培養(yǎng)基上清, 完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 單鏈抗體對原核表達(dá)病毒蛋白特異性結(jié)合的分析

為確定所獲單鏈抗體的特異性, 分別用 0—2 μg的VP7、VP5、VP5N和VP5C抗原包被進(jìn)行ELISA檢測, 每個樣品設(shè)三個平行重復(fù), 并選用同載體序列不相關(guān)的蛋白作為對照, 進(jìn)行同樣操作。結(jié)果如圖2所示, 所有淘到的單鏈抗體對相應(yīng)抗原進(jìn)行ELISA 檢測時, 在同一抗體濃度下, 隨著各自抗原蛋白包被量的增加, A450都隨之增加, 而對照蛋白, 則完全無此趨勢,說明淘選得到的陽性單鏈抗體對相應(yīng)抗原特異性良好。其中, scFv 19B7、P1A3對VP7, 26F4、26D9對VP5C, 25G10對VP5N的最低檢測濃度均約為 50 ng; scFv 29E12對VP5的最低檢測濃度稍高, 約為 100 ng; scFv 24B6對VP5N的最低檢測濃度最低, 約為25 ng。同時, western結(jié)果顯示(圖3), 所有淘得的抗體均能夠識別變性的原核表達(dá)抗原, 說明這些抗體識別的均為線性表位。另外, 識別VP5N、VP5C 的單鏈抗體 24B6、25G10、26F4、26D9, 對全長VP5及另一區(qū)段VP5的檢測結(jié)果表明, 識別 VP5N 的 scFv 25G10也能夠成功識別變性與非變性的VP5和VP5C(圖2C、3B所示), 推測可能的原因是25G10的識別位點(diǎn)位于 VP5的中間區(qū)域, 同時VP5N的C端和VP5C的N端是同一段序列(約為100個氨基酸),故25G10可以同時識別VP5、VP5N、VP5C。但是,識別 VP5N的 scFv 24B6及識別 VP5C的 scFv 26F4、26D9均不能識別 VP5的另一區(qū)段及全長VP5(圖3B、3D), 可能的解釋是, 這些抗體的識別位點(diǎn)都不僅僅是目的蛋白序列, 而是質(zhì)粒載體與目的蛋白結(jié)合處的一段序列。

圖2 陽性單鏈抗體與對應(yīng)抗原的ELISA分析結(jié)果Fig. 2 ELISA analysis of binding specificity of positive scFv antibodies to prokaryotic expressed antigens

2.4 單鏈抗體對真核表達(dá)病毒蛋白的識別

為確定所獲單鏈抗體能否識別真核表達(dá)的病毒蛋白VP7和VP5, 將GCRV 感染的CIK細(xì)胞裂解液上清0.5—8 μL梯度上樣進(jìn)行Western Blot檢測,未經(jīng)GCRV感染的CIK細(xì)胞裂解液上清8 μL作為陰性對照, 原核表達(dá)VP7、VP5各4μL作為陽性對照。Western結(jié)果表明針對VP7的scFv 19B7和P1A3能夠識別GCRV的變性VP7(圖4A、4B所示), 而針對VP5、VP5N和VP5C的所有單鏈抗體均不能識別 GCRV的 VP5(結(jié)果未顯示), 對此, 推測其原因,可能與真核表達(dá)的病毒VP5蛋白有著原核表達(dá)不具有的翻譯后修飾有關(guān)。另外, 對于能夠識別變性GCRV VP7的scFv 19B7和P1A3, 為了確認(rèn)其能否識別非變性GCRV VP7, 分別取GCRV感染的CIK細(xì)胞裂解液上清及未經(jīng)GCRV感染的CIK細(xì)胞裂解液上清進(jìn)行 ELISA實(shí)驗(yàn)。但是, 背景值很高, 也沒有明顯陽性結(jié)果。推測原因是細(xì)胞裂解液上清, 雖經(jīng)過一定的濃縮, 其蛋白種類仍然很多, 而 ELISA的包被量很有限, 目的蛋白不能有效固定。相反, NC膜的蛋白吸附量要大得多, 故嘗試用Dot Blot實(shí)驗(yàn)確認(rèn)scFv 19B7和P1A3能否識別非變性GCRV VP7。分別取變性與非變性GCRV感染CIK細(xì)胞裂解液上清0.1—2 μL梯度點(diǎn)膜進(jìn)行Dot blot實(shí)驗(yàn)。0.1—2 μL變性與非變性原核表達(dá)VP7也點(diǎn)膜, 作為陽性對照, 0.1—2 μL未經(jīng)GCRV感染的CIK細(xì)胞裂解液上清作為陰性對照。結(jié)果(圖4 C3)顯示, 隨著樣品中 GCRV濃度的增加, 化學(xué)信號也在增強(qiáng),而未經(jīng)GCRV感染的CIK細(xì)胞裂解液上清則無此現(xiàn)象, 說明scFv 19B7能夠與非變性的GCRV特異性結(jié)合。根據(jù)圖4 C5、C6, 在同一上樣量條件下, 非變性 VP7的化學(xué)信號比變性的要強(qiáng), 推測是因?yàn)? 蛋白經(jīng)過變性后, 與 NC膜的結(jié)合力下降, 或者在后面長時間的PBST的漂洗中, 更容易脫落。這也解釋了在GCRV感染的CIK細(xì)胞裂解液上清中, 非變性的呈現(xiàn)出了弱信號,而變性后的卻沒有信號。

而scFv P1A3的dot blot實(shí)驗(yàn)中則顯示出很強(qiáng)的非特異性吸附(結(jié)果未顯示), 因此無法確認(rèn)其能否與非變性GCRV結(jié)合。

圖3 單鏈抗體對原核表達(dá)抗原Western Blot結(jié)果Fig. 3 Western Blot assay of scFv antibodies with prokaryotic expressed antigen

3 討論

GCRV是水生呼腸孤病毒屬中致病性最強(qiáng)的一種病毒, 由外部的兩層蛋白衣殼與內(nèi)部的雙鏈環(huán)狀RNA構(gòu)成, 最外層的核衣殼是由200個VP5和VP7三聚體分子組成的異源二聚體構(gòu)成。根據(jù)方勤等的報道[8], VP5和VP7與哺乳動物正呼腸孤病毒(MRV)的μ1、σ3蛋白分別有20%和40%的同源性。推測其與MRV的μ1、σ3蛋白可能也有著相似的功能, 即與病毒吸附、侵染及進(jìn)入細(xì)胞的方式有關(guān)[9]。

本研究利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的大容量天然單鏈抗體庫對原核表達(dá)的VP5、VP7及截短的VP5N和VP5C進(jìn)行淘選, 共獲得了7個單鏈抗體。其中針對VP7、VP5N和VP5C的各有兩個, 針對VP5的有一個, 它們均能夠同時識別對應(yīng)的變性與非變性的原核表達(dá)抗原。但是檢測GCRV感染的細(xì)胞裂解液上清中的GCRV病毒時, 發(fā)現(xiàn)針對原核表達(dá)VP5、VP5N和VP5C淘到的單鏈抗體均不能識別天然GCRV中的VP5。推測其原因, 可能與真核細(xì)胞表達(dá)的病毒VP5蛋白有著原核表達(dá)不具有的翻譯后修飾有關(guān)。

針對原核表達(dá)VP7淘到的兩個scFv 19B7和P1A3能夠識別GCRV的P7, 其中19B7可以同時識別變性與非變性的GCRV的VP7, 說明其識別位點(diǎn)為線性表位。P1A3可識別變性的病毒VP7(非變性的Dot Blot實(shí)驗(yàn)因?yàn)榉翘禺愋晕教珡?qiáng), 未能得出確定結(jié)論)。在這一單克隆抗體的基礎(chǔ)上, 接下來可以繼續(xù)探究, 該抗體對病毒是否有中和效應(yīng), 同時參考哺乳動物σ3蛋白的功能區(qū), 將GCRV的VP7分段表達(dá), 應(yīng)用該抗體揭示病毒與細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn), 為后面深入研究提供理論基礎(chǔ)。

圖4 19B7、P1A3檢測病毒VP7的Western Blot 和Dot blot結(jié)果Fig. 4 Western Blot and dot blot analysis of capsid protein VP7 in GCRV virus

本研究首次將噬菌體展示單鏈抗體庫應(yīng)用于GCRV外殼蛋白抗體的淘選中, 并成功獲得了可以同時識別變性與非變性的GCRV VP7的單鏈抗體。相比較傳統(tǒng)的單克隆制備方法, 它有著很多優(yōu)勢:淘選周期短, 獲得抗體迅速; 同時因?yàn)槭窃诖竽c桿菌中表達(dá), 抗體的產(chǎn)量是無限的, 并且也是廉價的;另外, 因?yàn)槭删w展示抗體屬于工程抗體, 易于后面的基因操作, 比如可通過在單鏈抗體基因序列后面連上某些酶基因, 直接將二者融合表達(dá), 檢測時,就可以省略二抗的步驟, 一抗孵育后即可加入該酶的反應(yīng)底物, 整個過程方便快捷[22]。

另外, 構(gòu)建的pRSETVP5N/C載體成功大量表達(dá)了VP5N和VP5C, 雖然針對它們淘選所獲得的單鏈抗體不能夠識別GCRV中的VP5衣殼蛋白, 但是原核表達(dá)的VP5N、VP5C對于以后研究VP5的結(jié)構(gòu)與功能將會大有裨益。

總結(jié)來說, 本研究利用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的大容量天然噬菌體展示單鏈抗體文庫成功獲取了能夠識別GCRV VP7的單鏈抗體, 此抗體將成為后面進(jìn)一步研究病毒與細(xì)胞相互作用的有效工具。

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ISOLATION OF SCFV ANTIBODIES AGAINST GCRV USING PHAGE DISPLAY TECHNOLOGY

ZHANG Feng1,2, LI Zhou-Quan1,2, YAN Li-Ming2,3, LUO Shao-Xiang1,2, ZHONG Li-Qiao1,2,
ZHANG Xiao-Hua1, YUAN Li1, FANG Qin3and DAI He-Ping1
(1. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institution of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. State Key Laboratory of Virology, Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430071, China)

Grass carp reovirus (GCRV) is the main cause of severe outbreaks of hemorrhagic disease in fingerling and yearling grass carp. The virus outer capsid proteins, VP5 and VP7, have been shown to play critical roles in the invasion of host cells. In our study, prokaryotic-expressed VP7, VP5, and the N and C terminals of VP5 protein were used as targets to select the desired antibodies from phage-displayed scFv library. After 3 rounds of panning, we selected 7 antibodies against the prokaryotic-expressed antigens -- VP7, VP5, VP5N and VP5C. Furthermore, we found that 2 antibodies against VP7 out of the total 7 were able to recognize native GCRV particles. Our study should provide an insight into the interactions between GCRV and its host cells.

Reovirus of grass carp (GCRV); VP5; VP7; Phage display; scFv antibody

Q939.4

A

1000-3207(2014)03-0430-08

10.7541/2014.61

2013-04-26;

2014-01-17

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(批準(zhǔn)號: 2009CB118704)資助

張鳳(1988—), 女, 安徽人; 碩士研究生; 主要研究方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)工程。E-mail: zhangf8810@163.com

袁麗(1979—), 女, E-mail: liyuan@ihb.ac.cn; 方勤(1961—), 女, E-mail: qfang@wh.iov.cn