倪加加余育和

(1. 中國科學院水生生物研究所, 中國科學院水生生物多樣性與保護重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

凝膠條帶內DNA回收測序評估DGGE可靠性

倪加加1,2余育和1

(1. 中國科學院水生生物研究所, 中國科學院水生生物多樣性與保護重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

為了評估DGGE的可靠性, 對DGGE條帶中回收的DNA片段進行了測序比較分析, 并引入了DGGE可靠性指數的概念評價其可靠性。結果顯示同一條DGGE條帶回收的DNA來自同一屬的概率為64.7%, 相同位置的DGGE條帶可以被認為是同一OTU; 不同的DGGE條帶回收到類似的DNA序列(16S rDNA V3區(qū)差異小于4 bp)的概率為10.5%; DGGE可靠性指數為74.8%。以上結果表明盡管DGGE技術與理論預期存在一定的差距, 但是DGGE技術基本能夠反映微生物群落的多樣性。

DGGE可靠性指數; DNA指紋; 變性梯度凝膠電泳; 微生物群落結構

變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)技術被廣泛應用于微生物群落結構分析[1—8], 并且在PCR擴增條件、PCR引物設計、DGGE分析方法等方面得到了深入地研究和優(yōu)化[9—13]。然而, 由于PCR擴增條件、變性梯度凝膠的變性范圍、DGGE凝膠信息分析方法等都會對結果產生影響, 因此DGGE結果的可靠性也受到了質疑[14—16]。另外, 由于DGGE技術的理論基礎是依靠DNA序列的不同造成的DNA片段變性條件不同,通過在連續(xù)的變性梯度凝膠中將 DNA片段變性來改變 DNA分子在凝膠中的遷移速率從而將序列不同的DNA片段分為不同的DGGE條帶[1,14,17], 因此,在進行DGGE凝膠分析時一般都將一條DNA條帶作為一個可操作分類單位(Operational taxonomic unit, OTU)來處理, 并認為位于同一變性條件的DGGE條帶是相同的 OUT[1,4]; 然而, 由于共遷移等因素的影響, 在相同的DGGE條帶中可能檢出不同的 DNA序列, 而相同的序列也可能出現在不同的DGGE條帶中[8,10,15,16]。

為了評估共遷移等因素對 DGGE結果的影響,我們對分析草魚腸道菌群結構的DGGE凝膠條帶中的DNA片段進行回收測序, 并根據所得DNA序列的相似性情況分析了同一條帶中得到不同 DNA序列的概率及同一DNA序列出現在不同DGGE條帶中的概率, 同時引入了 DGGE可靠性指數來評估DGGE結果的可靠性。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

實驗草魚樣本于2010年12月29日采自湖北省武漢市多?？萍嫁r莊(30°08′ N, 114°23′ E), 用于分析的三尾草魚的平均體重為(910.0 ± 72.1) g, 平均體長為(37.0 ± 0.34) cm。樣本冰凍帶回實驗室稱量體長、體重后立即在無菌條件下解剖并根據外部形態(tài)將草魚腸道分為六段(前腸前端, FF; 前腸后端, RF; 中腸前端, FM; 中腸后端, RM; 后腸前端, FH;后腸后端, RH), 并分別從每段取約0.5 cm腸道及內含物放入2 mL離心管中–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取、PCR-DGGE分析及條帶回收測序

DNA提取和PCR擴增條件參考Ni, et al.[8]。采用膠濃度為9%、變性范圍為40%—70%的變形梯度凝膠對獲得的PCR產物進行DGGE分析, DGGE實驗條件及條帶回收測序方法參考Ni, et al.[8]。

1.3 數據分析

克隆測序得到的DNA序列使用NCBI網站中的vector contamination (vecscreen) 程序去載體后使用Clustal 2.0進行序列比對, 然后使用BioEdit軟件包手動去除引物序列后使用 Mothur軟件中的Chimera.uchime程序分析所得序列中的嵌合體, 再使用MEGA 4軟件分析非嵌合體的DNA序列的堿基差異并根據該堿基差異矩陣分析各DGGE條帶中DNA序列差異情況。所得序列對應的物種信息及對應的 DNA 序列使用 Ribosomal Database Project (RDP) release 10網站中的Classifier程序和Browser程序獲得。

為了分析不同DGGE條帶檢出相似的DNA序列的概率, 我們引入了以下計算公式:

其中p為不同DGGE條帶檢出相似的DNA序列的概率, Nij為DNA序列堿基差異矩陣中小于定義相似性序列閾值的堿基差異值總數, Nss為同一DGGE條帶中DNA序列堿基差異矩陣中小于定義相似性序列閾值的堿基差異值總數, N為DNA序列堿基差異矩陣中所有的堿基差異值總數, N = [n · (n–1)] / 2, 其中的n為用于計算堿基差異矩陣的DNA序列總數。

為了從整體上評估DGGE結果的可靠性, 我們引入了DGGE條帶可靠性指數RI, 計算公式為:

其中Nss為同一DGGE條帶中相似DNA序列兩兩組合數, Nsd為同一DGGE條帶中與其他DNA序列不相似的DNA序列兩兩組合數, Ndd為不同DGGE條帶中檢出的不相似的 DNA序列兩兩組合數, Nds為不同DGGE條帶中檢出相似的DNA序列兩兩組合數, NS為用于分析的 DNA序列兩兩組合總數。RI越大, 表征DGGE結果越可靠。

2 結果

2.1 DGGE指紋圖譜和DNA測序情況

共檢出77條不同的DGGE條帶, 其中共有帶2條, 只在一個樣品中出現的條帶 9條, 平均每個樣品26.22±2.05條DGGE條帶(圖1A)。對其中的22條DGGE凝膠條帶中的DNA片段進行了回收測序(圖1A)。除了8號條帶、19號條帶和21號條帶未能測得其中的DNA序列外, 其余19條帶共測得50條DNA序列(18號條帶只測得1條DNA序列, 11號帶、12號帶、13號帶、17號帶和20號帶分別測得2條DNA序列, 其余DGGE條帶分別測得3條DNA序列), 其中有2條為嵌合體序列, 分別來自于5號條帶和11號條帶, 后續(xù)的分析中去除了這兩條嵌合體序列。

2.2 同一DGGE條帶中DNA序列的相似性

在19條DGGE條帶中, 除了11號和18號條帶因只有一條有效的 DNA序列無法評估外, 剩余的17條DGGE條帶中, 只有6條(35.3%)DGGE條帶(4號、5號、9號、15號、17號和22號條帶)回收的DNA 序列完整一樣(0個堿基差異), 另有 5條(29.4%)DGGE條帶(1號、2號、6號、12號和 20號條帶)回收的DNA序列差異小于3 bp。其余的6條(35.3%)DGGE條帶(3號、7號、10號、13號、14號和16號條帶)中至少有兩條DNA序列的差異大于30 bp。

DNA序列在 RDP數據庫中比對的結果顯示 1號和2號DGGE條帶回收的DNA序列與Bacteroides屬細菌的16S rDNA V3區(qū)序列最相似, 6號和12號DGGE條帶回收的DNA序列與Cetobacterium屬細菌的16S rDNA V3區(qū)序列最相似, 而20號序列則只能確定與Firmicutes門細菌的16S rDNA V3區(qū)序列最相似。為了深入分析所測DNA片段對應的細菌種間和種內16S rDNA V3區(qū)的多樣性, 我們從RDP數據庫中下載了 Bacteroides屬和 Cetobacterium屬細菌的16S rDNA序列并對其V3區(qū)進行了分析。結果顯示, 12條Bacteroides fragilis的16S rDNA V3區(qū)DNA序列沒有堿基差異, 10條Bacteroides thetaiotaomicron的16S rDNA V3區(qū)DNA序列存在11—13 bp差異; 而Bacteroides屬的16S rDNA V3區(qū)不同種間DNA序列則存在0—18 bp差異, Cetobacterium屬的16S rDNA V3區(qū)不同種間DNA序列則存在 8 bp差異; Bacteroides、Acetomicrobium 和Anaerorhabdus的 16S rDNA V3區(qū)屬間差異則為28—50 bp, Cetobacterium、Clostridium、Fusobacterium、Ilyobacter、Propionigenium和Psychrilyobacter屬的16S rDNA V3區(qū)屬間差異則為4—14 bp。因此,同一條DGGE條帶回收的DNA來自同一屬的概率為64.7%。

根據DGGE條帶的位置, 1號條帶跟2號條帶應為同一OTU, 4號條帶與5號條帶應為同一OTU。測序結果顯示1號條帶跟2號條帶中的DNA序列相差0—3 bp, 都與Bacteroides屬細菌的16S rDNA V3區(qū)序列最相似; 4號條帶與5號條帶中回收的DNA序列完全相同。這一結果顯示相同位置的DGGE條帶可以被認為是同一OTU。

圖1 DGGE指紋圖譜Fig. 1 DGGE fingerprinting

2.3 不同DGGE條帶中DNA序列的相似性

我們還在不同的DGGE條帶中檢出序列差異小于4 bp的DNA序列, 如1號和2號條帶回收的DNA序列與4號和5號條帶回收的DNA序列差異為0—1 bp, 9號與20號條帶回收的DNA序列差異為0—1 bp。根據公式(1)計算得到的不同DGGE條帶檢出相似的DNA序列的概率為10.5%。

2.4 DGGE可靠性指數

以細菌16S rDNA V3區(qū)DNA序列差異小于4 bp的序列為相似性序列標準, 使用公式(2)計算得到DGGE可靠性指數為74.8%, 表明DGGE結果能夠較好地表征草魚消化道微生物群落16S rDNA的多樣性。

3 討論

DGGE技術因其重復性高、廉價、高效而被廣泛應用于微生物群落結構分析[1—8]。但由于受 PCR引物、PCR擴增條件、凝膠的變性范圍等因素的影響, DGGE技術的可靠性也受到了質疑[14—16]。盡管如此, 目前為止并沒有一種用于評估DGGE結果可靠性的方法被提出。我們在本文中首次引入了DGGE條帶可靠性指數RI來評估DGGE結果的可靠性, 為有效評估DGGE指紋圖譜的可靠性提供了技術手段。同時, 考慮到不同DGGE條帶檢出相似的DNA序列的概率P值會受到每條DGGE條帶回收測序的 DNA序列的條數差異對結果的影響, 我們采用序列的兩兩組合數作為RI的自變量, 在一定程度上排除了每條DGGE條帶回收測序的DNA序列的條數差異對結果的影響, 從而保證不同的研究者能夠采用RI值進行橫向比較。我們通過此方法對草魚消化道微生物群落結構的DGGE結果進行的分析結果顯示, 盡管同一條DGGE條帶中可能回收得到不同的DNA序列, 同時類似的DNA序列也可能會在不同的DGGE條帶中檢出, 但DGGE結果依舊能夠較好地反映環(huán)境中微生物群落結構的多樣性。

由于DGGE是依靠DNA片段的變性條件將其分為不同的DGGE條帶, 而不同序列的DNA片段可能有相同的變性條件, 從而導致在進行DGGE分析是在凝膠的同一變性梯度上形成相同的DGGE條帶[8,14], 這將導致環(huán)境樣品中的微生物多樣性可能被低估; 而由于共遷移等因素的影響, 相同的 DNA片段也可能形成不同的DGGE條帶[14], 這將導致環(huán)境樣品中的微生物多樣性可能被高估。我們的結果顯示由于DGGE分辨率的影響, 環(huán)境樣品中的微生物多樣性被低估的概率(35.3%)高于被高估的概率(10.5%), 這也在一定程度上解釋了為什么DGGE技術檢出的微生物種類少于克隆文庫或二代測序技術檢出的微生物種類。

凝膠的變性范圍被認為是影響DGGE結果的重要因素之一[10]。Gafan & Spratt[10]通過回收較寬變性范圍的凝膠中的條帶后使用較窄變性范圍的凝膠重新分析發(fā)現, 在較寬變性范圍的凝膠中被認為是相同的DGGE條帶在較窄的變性范圍的凝膠中則被分為不同的DGGE條帶。這一結果同樣暗示使用種屬特異性引物進行DGGE分析得到的結果可能比使用細菌通用引物得到的結果要更可靠, 并且能夠同時減小環(huán)境樣品中的微生物多樣性被低估和被高估的概率。

另外, 我們針對于不同屬的細菌16S rDNA V3區(qū)的 DNA序列多樣性進行的分析結果顯示不同屬的細菌其16S rDNA V3區(qū)的保守程度不同, 這可能導致在使用細菌通用引物(如本文中使用的F357-GC/R518引物)對環(huán)境微生物群落進行 DGGE分析時, 對不同門或者綱的細菌的分辨率存在差異,從而可能導致有些細菌門的多樣性被低估。因此,為了能夠更好地反映環(huán)境微生物群落的多樣性, 我們建議在使用通用引物進行DGGE分析的同時, 應結合特定類群的特異性引物開展更進一步的 DGGE分析, 而我們引入的公式(2)則能夠為橫向比較不同的類群特異性引物得到的DGGE結果提供可靠性方面的評估。同時, 盡管本文中我們以草魚消化道微生物群落為研究對象開展的DGGE分析, 我們引入的概念及分析方法完全可以拓展至其他生境微生物群落結構的DGGE結果的評估。

綜上所述, 盡管與理論預期存在一定的差距, DGGE技術依舊能夠較好地反映環(huán)境中微生物群落結構的多樣性; 同時, DGGE條帶可靠性指數RI可以有效評估DGGE結果的可靠性。

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ASSESSING THE RELIABILITY OF DGGE BY RETRIEVING AND SEQUENCING DNA FRAGMENTS IN GEL BANDS

NI Jia-Jia1,2and YU Yu-He1
(1. Key Laboratory of Biodiversity and Conservation of Aquatic Organisms, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

To assess the reliability of DGGE, the V3 region fragments of prokaryotic 16S rDNA sequences were amplified by PCR and separated by DGGE with 40%—70% denaturing gradient in present study, and the differences of DNA sequences retrieved from DGGE bands were compared, and the concept of DGGE reliable index (RI) that was calculated by the equation RI = (Nss– Nsd+ Ndd– Nds)/Ns, was introduced. The results showed that the probability of a single band retrieving similar sequences (the sequence diversity of the V3 region of 16S rDNA is less than 4 bp) was 64.7%, and that the bands located at the same level of denaturing gradient could be considered as the same OTU. The probability that different bands retrieve similar sequences was 10.5%. The DGGE reliable index was 74.8%. Therefore, the results of DGGE still reflect the molecular diversity of environmental microbiota, although there was a disparity comparing with theoretical expectations.

DGGE reliable index; DNA fingerprinting; Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE); Microbial community structure

Q-331

A

1000-3207(2014)03-0454-05

10.7541/2014.64

2013-05-03;

2014-02-27

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(2009CB118705); 國家自然科學基金(30970358, 31071896)資助

倪加加(1986—), 男, 山東濰坊人; 博士研究生; 主要從事微生物分子生態(tài)學研究。E-mail: nijiajia2005@126.com

余育和, E-mail: yhyu@ihb.ac.cn