林永麗，李旭霞，方旭東

立克次體病屬人獸共患的自然疫源性疾病，是立克次體所致疾病的總稱。當前，國際反恐已將流行性斑疹傷寒、落磯山斑點熱和Q熱列入生物戰(zhàn)劑目錄中［1］。因此，關(guān)于立克次體病的疹斷和防治等方面的研究越來越受到關(guān)注，現(xiàn)就美國立克次體病的研究現(xiàn)狀做一概述。

1 疫苗的研究

注射疫苗是目前預(yù)防流行病的一種有效措施，因此各國都在積極地進行流行病疫苗的研究。美國海軍醫(yī)學(xué)研究中心目前已經(jīng)鑒定到2種立克次體的疫苗，即56 ku(r56)的重組體抗體和47 ku(HtrA)DNA質(zhì)粒。并已證實，這2種疫苗具有相同的預(yù)防效果，且47 ku抗體的預(yù)防范圍更為廣泛。另外，胚細胞研究發(fā)現(xiàn)，47 ku抗體的基因順序和人類的絲氨酸蛋白酶同源，這或許會給人一些啟示。

1.1 47 ku DNA

2007年，美國科學(xué)家在研究恙蟲熱斑疹傷寒疫苗的過程中，將一種 pKarp 47 DNA疫苗應(yīng)用于 cynomo1gus猴。2008年，臨床化學(xué)和血液學(xué)評價結(jié)果顯示，這種疫苗對該猴是安全的。此結(jié)果與通過肉眼觀察猴的行為和一系列活動的結(jié)果相一致。而且，通過定量的實時PCR測到的菌血癥確定了該疫苗的有效性。與對照組比，5只接種過pKarp 47 DNA疫苗的猴體內(nèi)均產(chǎn)生了一種抗原特異性抗體反應(yīng);其中，有3只患上了菌血癥，且患病的時間均有所延遲，癥狀也較輕;另有2只未患上菌血癥，這2只被免疫的猴未顯示有精神障礙，但卻患上了淋巴結(jié)病。

可以確定，pKarp 47是主要的恙蟲熱斑疹傷寒疫苗之一，它是一種DNA質(zhì)粒，可表達47 ku的抗體。由于它同人類蛋白水解酶HtrA1具有高度同源性，已引起了科學(xué)家對自身免疫反應(yīng)的極大關(guān)注。截去與蛋白水解酶同源部分的47 ku的基因片段(47c、47e、47f)被插入到一個DNA質(zhì)粒中，通過轉(zhuǎn)染和蛋白印跡分析，可以確定這些片段在哺乳動物細胞中的表達，以此可用來評價這些質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的保護效果。

1.2 r56重組體

新幾內(nèi)亞、日本、緬甸和馬來西亞的4種最主要的菌株(Karp，Kato，Gi11iam和TA763)的r56已經(jīng)有生產(chǎn)。并有研究證實，它們的重組體Karp r56對同源體的保護效果非常好，但對交叉體的保護則很弱。極有可能4種菌株的重組體包含了這4種菌株的大部分成分，故具有非常廣泛的保護作用。來自于恙蟲TA763菌株的56 ku蛋白抗體已經(jīng)被成功克隆、表達，并已純化到了95%的純度?？茖W(xué)家通過蛋白印跡實驗觀察了被感染了TA763的鼠的反應(yīng)，被感染了的大鼠抗體已被進一步通過血清進行了評價，并發(fā)現(xiàn)它與另外14種菌株存在著交叉反應(yīng)。此結(jié)果提示，TA763 r56是一種具有較廣交叉反應(yīng)的抗體，可以作為一種能夠提供較為廣泛預(yù)防保護作用的疫苗。初步的結(jié)果顯示，TA763 r56可以有效保護大鼠免被TA763感染。

美國科學(xué)家根據(jù)56 ku蛋白(來自于Karp r56和TA763菌株)抗體順序設(shè)計了幾個嵌合體抗體，這給類似的廣譜的交叉反應(yīng)提供了任一一個親本的菌株。因此，用任一一個嵌合體蛋白替代2種蛋白的結(jié)合體，也可作為疫苗的選擇。實驗顯示，嵌合體蛋白對保護Karp菌株是非常有效的，但是對保護TA763菌株的效果則較小;然而，用嵌合體蛋白保護TA763菌株則較用Karp r56效果要好，但其中原因科學(xué)家還正在研究之中。

2 診斷分析

立克次體的診斷除臨床表現(xiàn)及體征外，主要依據(jù)實驗室診斷。目前，實驗室診斷方法包括血清學(xué)、病原學(xué)和分子生物學(xué)。其中，分子生物學(xué)診斷技術(shù)已廣泛應(yīng)用于立克次體病的診斷中，如采用保守基因設(shè)計引物進行各種聚合酶鏈式反應(yīng)(po1ymerase chain reaction，PCR)、限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(restriction fragment 1ength po1ymorphism，RFLP)以及基因序列分析等。

2.1 定量聚合酶鏈式反應(yīng)和血清學(xué)診斷分析

2008年，美國創(chuàng)立了定量聚合酶鏈式反應(yīng)(qPCR)分析法來診斷4種立克次體的實驗方法，并通過2種血清學(xué)分析法進行評價。這4種立克次體分別為Rickettsia slovaca，Rickettsia africae，Rickettsia conorii和 Rickettsia raoultii。2 種抗體監(jiān)測分析包括對Rickettsia prowazekii和Rickettsia typhi的監(jiān)測。這6種分析可用于測定在人類臨床、法醫(yī)、研究樣本以及節(jié)肢動物媒介、脊椎動物宿主樣本中的立克次體。

2.2 便攜式、適用于戰(zhàn)場型診斷分析

美國立克次體的研究人員研制出一種便攜式、適用于戰(zhàn)場的診斷恙蟲熱斑疹傷寒的產(chǎn)品，這種產(chǎn)品是通過利用3種恙蟲熱立克次體蛋白重組體(Kp r56，Kt r56和Gm r56)來進行診斷的。研究人員利用這種方法進行了以下2種立克次體病的診斷:第1種是從焦痂皮膚活組織中檢測到的R．parkeri，這是一個來自維吉尼亞低洼區(qū)域的軍人不小心被感染的蜱叮咬的病例。第2種是從一個來自埃及的發(fā)熱患者身上檢測到的貓立克次體(R．Felis)。研究人員還從遠離國防部的人員及其家屬身上檢測到R．montanensis，R．a(chǎn)mblyommii和R．felis。這一報道高度警示了軍事人員被立克次體感染的風險。病毒和立克次體病部門(vira1 and rickettsia1 disease department，VRDD)的研究人員正試圖通過獲得足夠的數(shù)據(jù)來驗證可以用FDA510k試劑盒對立克次體屬和恙蟲屬進行監(jiān)測分析。

2.3 利用重組體抗原進行診斷分析

美國科研人員已經(jīng)獲得了宿主基因(被立克次體感染的人類外周血細胞和單核細胞系－THP－1)的反應(yīng)特征，并已作為快速、準確地診斷立克次體疾病和Q熱的一種方法。

R．typhi(鼠型斑疹傷寒，AN片段，Coxiella burnetii(Q熱，Com－1)，Bartonella bacilliformis(Oroya 熱，Pap31)的許多重組體抗原將被用于立克次體病特異抗體的檢測。來自斑疹傷寒立克次體的OmpB抗原的重組蛋白片段已被純化并被甲基化。斑疹熱型(SFG)立克次體(R．conorii和R．rickettsii)的OmpB和OmpA的完整的ORF已經(jīng)被克隆。重組體Pap31已被進一步純化，并被用來檢測了300多名患者的血清。已證明，該法具有極強的敏感性和特異性，很有可能會成為一種快速的分析方法。

2.4 Q熱診斷分析的重要進展

為了消除在3級生物安全實驗室純化C．burnetii的危險及增加其重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和壽命，美國科學(xué)家用適當修改過的重組體抗原替代原始的完整的細胞抗原進行Q熱的免疫檢測。研究人員用生物素化的山羊抗人體的IgG/IgM以及過氧化物酶聚合酶(streptavidine)，通過ELISA法對2位患者血清的重組體抗原Com－1進行了評估。一位是來自厄瓜多爾的發(fā)熱患者，一位是來自美國部署在伊拉克的水兵，疑似Q熱病例。在這2個病例中，Com－1的表征與C．burnetii的II期完整細胞抗原相同。另外，重組體抗原OmpA和OmpH已經(jīng)有生產(chǎn)。這些抗原同 Com－1的組合將通過ELISA法進一步評估，并將用于快速色譜診斷法的構(gòu)建。而且，這種診斷分析方法可能用于血漿、血清及未經(jīng)處理的全血中的C．burnetii特異性抗體的檢測。

3 立克次體的流行病學(xué)

美國科學(xué)家還評估了蜱在軍事人員中傳播立克次體疾病的風險。立克次體DNA在流行病學(xué)樣本中被認為出現(xiàn)在節(jié)肢動物、嚙齒動物及人類的樣本中。在泰國的一名患者體內(nèi)特有的、蜱傳播的斑疹傷寒立克次體特異的qPCR的分析檢測到了Rickettsia honei的DNA?？茖W(xué)家優(yōu)化了R．montanensis和R．a(chǎn)mblyommii-特異的qPCR，以此來確定這些因子是否存在于從軍事健康中心的患者身上收集到的蜱(Dermacentor variabilis，Ixodes scapularis和Amblyomma americanum)。這一方法成功地確定了R．montanensis和R．a(chǎn)mblyommii存在于被檢測的蜱中。

已有科學(xué)家對世界范圍內(nèi)軍事人員和地方人員患立克次體病的風險進行評估。首先是來自喬治亞州立克次體的評估。在喬治亞州收集的立克次體被作為一種標志確定下來，并被確定為陽性，為立克次體屬，科學(xué)家通過qPCR基因特異性分析確定為Rick17;另外，TBrick是一種對蜱傳播的立克次體的特殊的分析方法。美國科學(xué)家近年用此法對來自于蜱的核酸制品進行了分析鑒定，研究結(jié)果提示，美國部署在日韓兩國的軍事人員在鼠類和恙蟲熱斑疹傷寒方面的感染率低于0.1%。但令人吃驚的是，美國布署在韓國的軍事人員感染斑疹熱型立克次體的實際風險較高(2%血清轉(zhuǎn)化，濃度提高了4倍)。

4 其他

4.1 試劑儲存程序

美國海軍醫(yī)學(xué)研究中心擁有世界上最大的立克次體收集渠道之一。這里可以提供qPCR的引物、探針以及qPCR分析的標準和試劑，2個重組蛋白體(如Kp r56)和基于培養(yǎng)物的完整的細胞抗原，為全世界的實驗室、SBIR承包商以及國家安全委員會提供血清學(xué)分析和分子檢測。

4.2 基因組學(xué)

美國已在實驗室組裝了2個Orientia tsutsugamushi(Karp strain)的基因組支架。一個是2.0 Mb，另一個是0.89 Mb?；蚪M的順序有90%以上是完整的，而且顯示出O．tsutsugamushi在這一領(lǐng)域有不為科學(xué)家所知的許多特性。

4.3 蛋白組學(xué)

2D凝膠電泳和活細胞－質(zhì)譜儀/質(zhì)譜儀的聯(lián)合應(yīng)用已證實斑疹熱型立克次體(SFGRickettsiae)主要外膜蛋白的翻譯后修飾的存在，這對進一步研制出更好的診斷試劑將有所幫助。

［1］ 范明遠，欒明春.新發(fā)現(xiàn)的立克次體［J］.中華流行病學(xué)雜志，2006，27(5):445－447.

［1］ OPNAVINST 5750－12J.OPNAV Report Symbo1 5750－1［R］.Command Seria1 Number:025/1089.Date Submitted:28 February，2009:60－65.