孫 林，劉 艷,2，閔晨雨，胡亞辰，陳 祥，焦新安

牛結(jié)核病是主要由牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis，M.bovis，M.bhuo或Mb)感染引起的一種慢性消耗性人獸共患傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織列為需通報(bào)的動物疫病[1]，我國將其列為二類動物疫病，該病不僅嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的健康發(fā)展，同樣也會引起人結(jié)核病的發(fā)生，對人類健康造成重大威脅。國際上普遍采用“檢疫-撲殺”的手段來對牛結(jié)核病進(jìn)行防控，目前法定的牛結(jié)核檢疫方法是結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)(tuberculin skin test,TST)，但是結(jié)核菌素是粗提物，含有200多種組分，與環(huán)境分枝桿菌等存在交叉反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性產(chǎn)生，因此迫切需要研制特異的牛結(jié)核病診斷方法。

差異區(qū)2(region of difference 2,RD2)是BCG在1927-1931年傳代過程中丟失的基因片段[2-3]，RD2的丟失將有利于BCG進(jìn)一步的減毒，RD2共包含11個(gè)基因，這些基因在所有結(jié)核分枝桿菌毒株中保守存在。研究表明，RD2區(qū)域中的MPT64和CFP21具有較強(qiáng)的免疫原性[4]，現(xiàn)已被用于結(jié)核病疫苗和診斷試劑的開發(fā)，但是對該區(qū)域中的其它組分還知之甚少，特應(yīng)用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)RD2區(qū)域的NrdF1、PE_PGRS35、Rv1985c和Rv1986，并分別以此4種融合蛋白純化產(chǎn)物作為包被抗原進(jìn)行牛結(jié)核病血清學(xué)檢測，探討牛結(jié)核病新型診斷試劑研制。

1 材料與方法

1.1菌株和載體 大腸桿菌E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存；滅活的結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所萬康林研究員饋贈；原核表達(dá)載體pET-32a(+)由本實(shí)驗(yàn)室保存，pEASY-E1購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2試劑 限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ、Hind Ⅲ、PyrobestTMDNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、T4 DNA連接酶等購自寶生物工程(大連)有限公司，基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；DNA膠回收試劑盒購自北京百泰克公司；羊抗兔IgG-HRP購自Invitrogen公司；抗His單抗、羊抗鼠IgG-HRP購自Sigma公司；Ni-NTA His Bind?purification Kit購自Novagen公司，BOVIGAMTM牛結(jié)核病IFN-γ檢測試劑盒購自Prionics公司。

1.3牛血清來源 137份牛血清來源于中國東部某牛場，經(jīng)牛γ干擾素試驗(yàn)檢測，68份樣本為陽性，69份樣本為陰性。

1.4目的基因的擴(kuò)增 使用基因組提取試劑盒提取H37Rv基因組DNA，根據(jù)http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/index.html公布的nrdF1、pe_pgrs35、rv1985c和rv1986序列，設(shè)計(jì)引物，引物由華大基因有限公司合成，詳細(xì)序列信息見表1。以所提取的基因組DNA為模板，用高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，Tm 40 s，72 ℃ 30 s，30次循環(huán)，72 ℃延伸5 min。

表1 目的基因引物和表達(dá)載體

1.5重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 目的基因和表達(dá)載體分別進(jìn)行雙酶切，基因?qū)?yīng)的表達(dá)載體及酶切位點(diǎn)信息見表1，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后分別切膠回收目的片段，將nrdF1和pe_pgrs35基因分別與pEASY-E1載體片段連接，rv1985c和rv1986基因分別與pET-32a (+)載體片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)菌，通過Amp+抗性篩選、經(jīng)NdeⅠ/XhoⅠ或者Hind Ⅲ/XhoⅠ雙酶切鑒定，陽性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司測序，測序正確的質(zhì)粒命名為pEASY-E1-nrdF1、pEASY-E1-nrdF1、pET32a-rv1985c和pET32a-rv1986。

1.6重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌E.coliBL21(DE3)，重組菌命名為BL21(DE3)(pEASY-E1-nrdF1)、BL21(DE3) ( pEASY-E1-pe_pgrs35)、BL21(DE3)(pET32a-rv1985c)和BL21(DE3)(pET32a-rv1986)。將重組菌小量接種，過夜培養(yǎng)，過夜培養(yǎng)物1∶100擴(kuò)大培養(yǎng)，37 ℃搖床培養(yǎng)至OD600 nm為0.4～0.5，加入IPTG使其終濃度為0.5 mmol/L，30 ℃誘導(dǎo)5～6 h。4 ℃、8 000 r/min離心收集細(xì)菌，PBS充分洗滌2次后進(jìn)行超聲波裂解菌體，分別收集裂解上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，分析蛋白表達(dá)情況。融合蛋白的純化按照Novagen公司的Ni-NTA His Bind?purification Kit說明書進(jìn)行。

1.7Western-blotting分析 將純化的NrdF1、PE_PGRS35、Rv1985c和Rv1986融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，含1% BSA的PBST封閉過夜，加入抗HIS單抗，37℃孵育2 h，PBST洗滌3次，與HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 37 ℃ 作用1h，PBST洗滌3次，DAB顯色并觀察結(jié)果。

1.8融合蛋白在牛結(jié)核病ELISA檢測中的初步應(yīng)用 按照文獻(xiàn)[5]方法，利用牛γ干擾素試驗(yàn)進(jìn)行牛結(jié)核病檢測，對于檢測陽性的樣品，分別以NrdF1、PE_PGRS35、Rv1985c和Rv19864種融合蛋白純化產(chǎn)物作為包被抗原，應(yīng)用間接ELISA方法對血清中的特異抗體進(jìn)行檢測。

2 結(jié) 果

2.1目的基因的PCR 擴(kuò)增及表達(dá)載體的構(gòu)建 以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增nrdF1、pe_pgrs35、rv1985c和rv1986基因，產(chǎn)物進(jìn)行10 g/ L 瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段與預(yù)期大小相符，分別為1 028 bp、1 732 bp、954 bp和951 bp(圖1)。將PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，Amp+抗性篩選陽性克隆，經(jīng)NdeⅠ/XhoⅠ或者Hind Ⅲ/XhoⅠ雙酶切，目的片段符合預(yù)期大小，同時(shí)測序結(jié)果表明插入基因序列與發(fā)表的序列100 %一致，說明結(jié)核分枝桿菌nrdF1和pe_pgrs35基因成功克隆入pEASY-E1表達(dá)載體、rv1985c和rv1986基因成功克隆入pET-32a (+)表達(dá)載體。

2.2重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 挑取重組菌BL21(DE3)(pEASY-E1-nrdF1) 、BL21(DE3)(pEASY-E1-pe_pgrs35)、BL21(DE3)(pET32a-rv1985c)、BL21(DE3) ( pET32a-rv1986)單個(gè)克隆，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，超聲波裂解離心后的上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE 分析，結(jié)果表明nrdF1、pe_pgrs35、rv1985c和rv1986基因在大腸桿菌中都獲得了表達(dá)，對應(yīng)分子量分別為42 ku、63 ku、46 ku和41 ku，其中NrdF1、PE_PGRS35以及Rv1986以包涵體形式存在，Rv1985c以可溶和包涵體兩種方式表達(dá)(圖2)。經(jīng)過鎳柱親和純化后，均獲得了純化蛋白(圖2)，其中Rv1985c是從上清純化獲得，其余的蛋白均是由包涵體純化獲得。

圖1nrdF1和pe_pgrs35基因PCR擴(kuò)增及表達(dá)載體酶切鑒定

Fig.1PCRamplificationofnrdF1,pe_pgrs35,rv1985c,andrv1986DNAfragmentsfromMycobacteriumtuberculosisH37Rvgenomeandenzymedigestion

M1: DL2000 DNA Marker;

1:nrdF1 PCR amplification;

2: pCR2.1-nrdF1 digested byNdeⅠ andXhoⅠ;

3:pe_pgrs35 PCR amplification;

4: pCR2.1-pe_pgrs35 digested byNdeⅠ andXhoⅠ;

5:rv1985cPCR amplification;

6: pCR2.1-rv1985cdigested byHind Ⅲ andXhoⅠ;

7:rv1986 PCR amplification;

8: pCR2.1-rv1986 digested byNdeⅠ andXhoⅠ;

M2: λ-EcoT14 Ⅰdigest DNA Marker.

2.3Western-blot分析 抗HIS單抗能夠識別純化的重組蛋白NrdF1、PE_PGRS35、Rv1985c和Rv1986，說明表達(dá)的重組蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。

2.4融合蛋白在牛結(jié)核病ELISA檢測中的初步應(yīng)用 通過牛γ干擾素試驗(yàn)共檢出68頭陽性牛，以純化的重組蛋白作為包被抗原進(jìn)行牛結(jié)核病血清學(xué)檢測，結(jié)果NrdF1的陽性檢出率為7.35% (5/68)，陰性檢出率為85.51%(59/69)；PE_PGRS35的陽性檢出率為22.06%(15/68)，陰性檢出率為86.96%(60/69)；Rv1985c的陽性檢出率為16.18%(11/68)，陰性檢出率為79.71.0%(55/69)；Rv1986的陽性檢出率為16.18%(11/68)，陰性檢出率為84.06%(58/69)。

圖2重組菌誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

Fig.2SDS-PAGEanalysisoftheexpressedproductsoftherecombinantBL21(DE3)

M:Low molecular protein marker;

1: Sediments of lysate of BL21 (DE3) (pEASY-nrdF1) induced by IPTG;

2: BL21 (DE3) (pEASY) induced by IPTG;

3: sediments of lysate of BL21 (DE3) (pEASY-pe_pgrs35) induced by IPTG;

4: supernatant of lysate of BL21 (DE3) (pET32a-rv1985c) induced by IPTG;

5: BL21 (DE3) (pET32a) induced by IPTG;

6: sediments of lysate of BL21 (DE3) (pET32a-rv1986) induced by IPTG;

7: purified NrdF1; 8: purified PE_PGRS35;

9: purified Rv1985c; 10: purified Rv1986.

3 討 論

至今為止“檢疫→撲殺”是控制牛結(jié)核的有效方法，因此準(zhǔn)確而及時(shí)的診斷對該病的控制極為重要。細(xì)菌學(xué)檢查方法仍被認(rèn)為是結(jié)核病確診的金標(biāo)準(zhǔn),但是牛分枝桿菌生長緩慢，分離率低(20%左右)，需要生物安全措施，同時(shí)對于病理部分樣品的采集需要屠宰奶牛，不適用于活畜的檢疫，嚴(yán)重影響了該方法的推廣[5]。目前皮試變態(tài)反應(yīng)在牛結(jié)核病的診斷中被廣泛使用，但是特異性較差，診斷結(jié)果假陽性率較高，因此迫切需要研究開發(fā)出特異性好、便于臨床應(yīng)用的鑒定方法。

特異性的不足主要是由于使用的抗原和環(huán)境分枝桿菌存在交叉反應(yīng)，因此鑒定特異的牛分枝桿菌抗原對研發(fā)特異性診斷試劑顯得尤為必要，比較基因組學(xué)的研究提供了大量特異性抗原信息，常用于新型抗結(jié)核病候選疫苗和診斷試劑研發(fā)。Mahairas等[2]利用差減雜交技術(shù)比較了結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌毒力株與BCG基因組發(fā)現(xiàn)3個(gè)差異區(qū)，命名為RD1、RD2及RD3；后來Behr等[3]利用細(xì)菌人工染色體文庫、細(xì)菌人工染色體陣列及DNA微陣列，又鑒別出13個(gè)差異區(qū)：分別命名為RD4—RD16。

圖3融合蛋白的Westernblotting分析

Fig.3Western-blottingassayofpurifiedfusionproteins

M: Low molecular protein marker;

1: Purified NrdF1; 2: Purified Rv1985c;

3: Purified Rv1986; 4: Purified PE_PGRS35.

由RD區(qū)基因編碼的蛋白質(zhì)構(gòu)成潛在免疫診斷特異性抗原的來源[2-3,6]，尤其是對RD1區(qū)蛋白已研究得較為清楚，ESAT-6、CFP10、Rv3872和Rv3873(TB37.6)已被確定為診斷抗原[7-9]。本研究選取RD2區(qū)域中的NrdF1、PE_PGRS35，Rv1985c和Rv1986等四種蛋白進(jìn)行原核融合表達(dá)與純化，并分別以NrdF1、PE_PGRS35、Rv1985c和Rv1986四種融合蛋白純化產(chǎn)物作為包被抗原，應(yīng)用間接ELISA方法對血清中的特異抗體進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示4種蛋白的陽性檢出率分別為7.35%、22.06%、16.18%和16.18%，顯示出一定的診斷價(jià)值，在接下來的研究中，我們將結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期工作中表達(dá)純化的其他結(jié)核分枝桿菌特異的抗原，采用組合多種抗原的方法來進(jìn)一步提高特異性和靈敏度。

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