黎東明，賴天文，鄧少嫦，吳 東，張 鈺，陳 敏，呂瑩瑩，吳 斌

禽流感是由禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)引起的一類人獸共患傳染性疾病或疾病綜合征。1997年，香港首次發(fā)生了高致病性禽流感(High Pathogenic Avian Influenza,HPAI)H5N1病毒直接感染人事件。至2012年，WHO公報顯示H5N1亞型AIV在全球已造成了610人感染，其中360人死亡，確診患者的死亡率大約60%[1-2]。H5N1病毒逐漸從亞洲蔓延至歐洲大部分國家以及非洲部分國家，共計56個國家和地區(qū)，近期一些研究結果表明H5N1禽流感病毒可以通過變異、重組而能在人群中傳播，從而嚴重威脅人類的生命健康，引人關注[3]。因此，深切探討病毒的發(fā)病機制是必要的。

人感染H5N1病毒的一個主要病理特點是彌漫性肺泡損傷。嚴重的病毒性肺炎是高致病性H5N1病毒感染最常見的并發(fā)癥，也是引起死亡一個因素[4]。目前，在哺乳動物中(如小鼠，雪貂)對病毒性肺炎進行了大量的研究[5]，但這些結論不能直接外推至人類。

為此，我們用H5N1 病毒感染恒河猴，建立非致死性流感病毒性肺炎模型，從臨床癥狀、病毒復制、病理變化及免疫反應進行全面系統(tǒng)考察，為深入了解人感染H5N1病毒的發(fā)病機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動物 中國恒河猴5只，年齡2.5～3周歲，平均體重(3.4 ± 0.2)kg，由廣東省高要市康達實驗動物技術有限公司提供，隨機編為1～5號。染毒前，均用ELISA方法檢測血清中H5N1禽流感病毒特異抗體均陰性，并提前進入生物三級安全實驗室適應飼養(yǎng)5d后飼養(yǎng)于生物安全實驗室的負壓隔離器中。樣品處理均在生物安全柜中操作。

1.2病毒制備 A/Goose/Guangdong/NH/2003(H5N1)由華南農業(yè)大學禽病研究室惠贈并經中國農科院哈爾濱獸醫(yī)研究所鑒定。經多次在雞胚中傳代增殖，將血凝效價為1∶256的病毒液分裝，置-80℃貯存?zhèn)溆?，于動物實驗前測TCID50為10-4.825/mL。

1.3病毒接種 實驗前恒河猴麻醉后將體溫芯片植入其頸部后方、肩胛骨上方的背中線位置，用數(shù)據(jù)收集器掃描芯片來測量猴的體溫，觀察是否出現(xiàn)流感相關癥狀和體征，每天2次。感染前按照0.2 mL/kg氯胺酮肌肉注射麻醉恒河猴后，經鼻向1～4號恒河猴滴入H5N1病毒液2 mL。用同樣的方法給5號恒河猴注射等量的生理鹽水，作為非感染對照組。1～5號猴分別在染毒后第1 d、3 d、6 d、14 d、1 d經頸動脈插管放血的方法剖殺。

1.4血液學和流感的特異抗體檢測 在感染后第0 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、6 d、10 d、12 d和14 d，用EDTA-k2抗凝管從貴要靜脈抽取2 mL外周血標本。用細胞動力學1200分析儀 (Abbott Laboratories,IL) 進行外周血液分析。檢測流感病毒特異性抗體，用受體破壞酶進行預處理(消除紅血球凝聚抑制劑)，然后用血清凝集抑制或血清中和試驗進行鑒定。

1.5病毒分離及滴定 病毒分離：取材包括氣管支氣管淋巴結、肺、心、肝，腎，大腦及小腦。取材后，標本經焦磷酸二乙酯(DEPC)水處理的離心管分裝，于-80 ℃保存。取定量組織2 g，加入玻璃研磨器中研磨做組織勻漿，隨后加入5倍量的滅菌生理鹽水(含200 μg/mL鏈霉素、200 U青霉素)，制成乳劑后移入滅菌試管中，以5 000 r/min (離心半徑8 cm)離心10 min，取上清液接種雞胚。參照Yoshimoto[6]的方法進行病毒的雞胚接種擴增和病毒血凝效價測定。

病毒滴定：將濃度為1×105個/mL的MDCK細胞加入96孔板，每孔200 μL，細胞形成單層后，用維持液稀釋病毒，按10倍遞減，從病毒材料原液至10-9，每個濃度8個復孔，細胞對照加維持液，放入37 ℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育。倒置生物顯微鏡觀察細胞形態(tài)：正常IvlDCK細胞星多邊形，分布均勻，細胞間排列緊密：細胞病變效應(CPE)表現(xiàn)為細胞收縮、變圓，聚集成團。采用Reed-Mueneh 法[7]計算半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量(TCID50)，表示病毒的毒力。

1.6細菌分離和致病性分析 稱取肺組織0.1 g加入PBS緩沖液1 mL做細胞均質。取100 μL 接種在瓊脂平板，在37 ℃有氧條件下孵化48 h后，選擇典型的菌落并在Luria-Bertani肉湯培養(yǎng)。隨后在6 w大的 BALB/c小鼠腹腔內接種100 μL的擴增細菌。用16S rRNA 序列鑒定細菌的種類。

1.7病理及免疫組化 取材后，用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，常規(guī)HE染色。按照文獻描述的免疫組化方法對切片行病毒抗原染色[8]。第一抗體為A型流感基質蛋白特異性單克隆抗體 (Serotec Ltd.,Oxford,UK)，稀釋濃度為1∶100，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，陽性細胞染色呈棕褐色。

2 結 果

2.1臨床癥狀 感染前，恒河猴狀態(tài)良好，無禽流感相關癥狀和體征。染毒后第1 d開始出現(xiàn)發(fā)熱，食欲下降，精神狀態(tài)下降，活動度明顯減少，呼吸急促，鼻孔扇動，張口呼吸。感染后1～3 d最為嚴重，第6 d后逐漸減輕，第14 d時恢復正常。白細胞總數(shù)在感染后第1 d達到高峰，到第6 d開始下降，到14 d恢復正常。淋巴細胞數(shù)分別在感染后第1 d，6 d下降。5號猴未出現(xiàn)上述變化。在實驗期間無恒河猴死亡。觀察結果表明A/Goose/Guangdong/NH/2003(H5N1)能有效感染恒河猴并出現(xiàn)典型的臨床癥狀，感染后第14 d恢復(圖1)。

2.2禽流感病毒侵襲機體的特點 病毒分離及病毒滴定的結果分別見表1及表2。除1，2號恒河猴肺組織中分離出病毒外，其它恒河猴的肺、氣管支氣管淋巴結、心、肝、脾、腎、腦未分離出病毒。

2.3病理改變 見圖2。

2.4免疫組化 見圖3、表1。

圖1臨床癥狀及外周血白細胞、T淋巴細胞變化

從恒河猴感染前1 d到感染后第14d監(jiān)測體溫和呼吸(圖A 和B)；外周血在恒河猴感染后0 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、6 d、10 d、12 d和14 d采集 (圖C和D)。不同顏色曲線代表不同的恒河猴(見圖A表示)。

Fig.1Changesofclinicalsymptoms,peripheralwhitebloodcellandTlymphocyte

The temperature and respiration of the rhesus from -1 day to 14 day after infection (A and B).

The changes of numbers of peripheral white blood cell and T lymphocyte after infection (C and D).

Peripheral blood was collected at 0,12 hours,1,2,3,4,6,10,12 and 14 days after infection.

Different color curves represent differents rhesus (A).

表1 感染后恒河猴組織樣品的病毒分離及免疫組化

3 討 論

本研究中成功建立了實驗誘導恒河猴發(fā)生非致死的流感病毒肺炎的動物模型。研究結果發(fā)現(xiàn)恒河猴感染H5N1病毒，表現(xiàn)為急性起病，發(fā)熱，呼吸急促，活動度明顯減少，食欲下降。感染H5N1禽流感病毒的恒河猴在肺組織觀察到病理變化。H5N1禽流感病毒急性感染期，肺組織病理表現(xiàn)為滲出及壞死性間質性肺炎，彌漫性肺泡損傷。免疫組織化學、病毒分離結果表明H5N1禽流感病毒只能在下呼吸道復制，提示H5N1禽流感病毒具有致命性但可能不易發(fā)生人傳染人。

表2 呼吸道組織病毒滴定(log10 EID50/mL)

Note: / not found.

圖2病理變化

A 感染后1 d，肺組織實變嚴重，大量紅細胞和炎癥細胞侵潤及纖維素滲出 (HE,×100)；B 感染后第3 d，病變最為嚴重，肺組織實變嚴重，可見大量紅細胞和炎性細胞侵潤及纖維素滲出 (HE,×100)；C 感染后第6 d，肺泡壁增厚，II型肺泡上皮增生 (HE,×400)；D 感染后第14 d，肺組織恢復期表現(xiàn)，肺泡結構恢復，肺泡內和間質的炎癥滲出物已部分被吸收，無出血 (HE,×200)；E 細支氣管 上皮細胞壞死脫落，脫落至基底細胞層或基底膜，支氣管腔中有壞死脫落的上皮細胞 (HE,×400)；F心臟 心肌細胞間結締組織輕度淋巴細胞浸潤(HE,×200)；G腎臟 腎間質毛細血管擴張、充血，間質水腫(HE,×400)；H脾臟淋巴小結生發(fā)中心明顯，體液免疫活躍表現(xiàn)(HE,×400)；I肝臟肝竇增寬，肝細胞腫大、嗜酸性變性、空泡變性 (HE,×400)。

Fig.2Pathologicalchange

A--The 1st day after infection,pulmonary consolidation was serious,many red blood cell,inflammatory cell and cellulose effusion were observed;

B--The 3rd day after infection,pathological changes was the most serious,many red blood cell,inflammatory cell and cellulose effusion were observed (HE,×100);

C--The 6th day after infection,there were alveolar wall thickening and type Ⅱ alveolar epithelium cell proliferation;

D--The 14th day after infection,pulmonary consolidation and alveolus structures recovered,and inflammation effusion was partly absorbed and there was no hemorrhage (HE,×200).

E--Bronchioles and epithelial cells neorobiosis and desquamate to Basal cell layer or basilar membrane,neorobiosis epithelial cells in bronchial lumen were observed (HE,×400);

F--Heart,lymphocytes infiltration in connective tissue between myocardial cell were observed (HE,×200);

G--Kidney,there was telangiectasis,hyperemia and interstitial edema in renal interstitium (HE,×400);

H--Spleen,lymphatic nodule germinal center was obvious and humoral immunity was active (HE,×400);

I--Hepatic sinusoid widened and there were hepatocyte tumefaction,acidophilia degeneration and vacuolar degeneration.

圖3免疫組化

A 5號恒河猴(對照猴)的肺組織未發(fā)現(xiàn)H5N1病毒抗原；B 1號恒河猴(感染后第1 d)肺組織H5N1病毒抗原表達陽性(箭頭)；C 2號恒河猴(感染后第3 d)肺組織H5N1病毒抗原表達陽性；D 3號恒河猴(感染后第6 d)肺組織H5N1病毒抗原呈局部表達；E 4號恒河猴(感染后第14 d)肺組織未發(fā)現(xiàn)H5N1病毒抗原；F 2號恒河猴肺泡Ⅱ型細胞呈陽性染色；G 3號恒河猴肺巨噬細胞呈陽性染色。(圖A～E 免疫組化×400；圖F～G 免疫組化×200)

Fig.3Immunohistochemisty

A--H5N1 viral antigens was not found in lung tissue of rhesus no. 5;

B--Rhesus no. 1 (1st day after infection),H5N1 viral antigens was positive;

C--Rhesus no. 2 (3rd day after infection),H5N1 viral antigens was positive;

D--Rhesus no. 3 (6th day after infection),H5N1 viral antigens was positive;

E--Rhesus no. 4 (14th day after infection) ,there was no H5N1 viral antigens in lung tissue;

F--Rhesus no. 2,type Ⅱ alveolar epithelium cell was positive staining;

G--Rhesus no. 3,macrophage was positive staining;

Figures A to E (×400); Figures F,G (×200).

1997年在香港發(fā)生H5N1病毒直接感染人事件后，許多問題仍未清楚，尤其是那些有關為何這種病毒的致病性如此強。在本實驗中，免疫組化結果表明病毒沒有在肺外器官復制，這與之前在H5N1感染獼猴模型和人類研究中有限的可用數(shù)據(jù)一致。因此，結果提示病毒主要在恒河猴肺組織復制，未發(fā)生病毒血癥或侵染肺外組織，H5N1感染的患者出現(xiàn)多器官功能障礙綜合征不一定伴有肺外器官病毒復制。然而，H5N1感染的患者是否有肺外器官病毒復制的確切證據(jù)仍然很少。

識別受感染的靶細胞，對研究病毒傳播起重要作用，但在實驗感染動物模型和人類病例中產生了矛盾的結果。本實驗以免疫組化的方法，發(fā)現(xiàn)在巨噬細胞和II型肺泡細胞有病毒抗原的陽性染色，而不在氣管及支氣管的纖毛上皮。結果與以往報道的H5N1病毒能在食獼猴氣管及支氣管上皮復制的結果相反[9]。 但本實驗的數(shù)據(jù)與之前對人類病例研究的結果一致，即II型肺泡細胞是H5N1病毒復制的主要場所，而不是氣管及支氣管的纖毛上皮[10]。H5N1病毒在呼吸道復制的部位是決定病毒傳播的一個重要因素。通過病毒對唾液酸識別和結合活性的研究發(fā)現(xiàn)，禽流感病毒和人流感病毒分別識別唾液酸不同結構的糖鏈作為受體，禽流感病毒優(yōu)先結合于唾液酸2-3半乳糖(α-2,3 Gal)，人流感病毒優(yōu)先結合于唾液酸2-6 半乳糖(α-2,6 Gal)，而且這種識別的特異性非常強[11]。Shinya等[12]報道人呼吸道組織切片從鼻腔至終末呼吸細支氣管主要表達唾液酸α-2,6-Gal受體，除鼻腔黏膜個別上皮細胞偶爾表達唾液酸α-2,3-Gal受體外，其他部位缺乏唾液酸α-2,3-Gal受體，相反，下呼吸道的呼吸細支氣管與肺泡之間連接部的非纖毛立方細胞以及肺泡細胞表達唾液酸α-2,3-Gal受體為主；同時人流感和禽流感病毒結合與感染實驗支持上述流感病毒受體分布特點，表明禽流感病毒可在人下呼吸道感染、復制。

臨床資料表明[13-14]，人禽流感輕癥病例的外周血淋巴細胞無明顯降低，而嚴重病例多數(shù)出現(xiàn)血液學的改變，外周血白細胞計數(shù)及淋巴細胞降低。本實驗對恒河猴感染禽流感病毒后的外周血白細胞及淋巴細胞的動態(tài)變化分析發(fā)現(xiàn)：外周血白細胞總數(shù)及淋巴細胞出現(xiàn)短暫的下降，于第6 d后逐漸恢復到正常水平。淋巴細胞數(shù)與病情密切相關，外周血淋巴細胞數(shù)量過低或降幅過大都提示預后不良，尤其是出現(xiàn)淋巴細胞計數(shù)進行性下降時，提示病情較嚴重。

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