賈 紅，袁維峰，李 杰，侯紹華，郭曉宇，鑫 婷，馬世春，朱鴻飛

棘球蚴病(Echinococcosis granulosus)又稱包蟲病( Hydatidosis)，是由細(xì)粒棘球蚴絳蟲的中絳期幼蟲—細(xì)粒棘球蚴(Echinococcusgranulosus,Eg)寄生于哺乳動(dòng)物肝、肺等臟器所引起人類、牛羊的人畜共患寄生蟲病。免疫接種是防治該病的方法之一[1-2]，近年來, 隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,Eg95 蛋白是一種分子質(zhì)量為24.5 ku的天然六鉤蚴抗原。其編碼基因全長為715 bp, 其中462 bp基因可編碼分子質(zhì)量為16. 5 ku的含153個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)[3]。Eg95的作用為使綿羊獲得免疫保護(hù)[4-6]。本研究力圖通過探討可溶性EG95s重組蛋白的免疫原性，及比較串聯(lián)后免疫原性差異，為包蟲病疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 8w(下同)齡BALB/c購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。pET-1EG95s、pET-2EG95s和pET-3EG95s重組質(zhì)粒為本室制備和保存。弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自Sigma公司；OptEIATMSet Mouse IFN-γ試劑盒購自美國BD公司；Tween-20購自索萊寶生物公司；增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯示試劑盒和可溶性單組分TMB底物溶液購自天根公司；辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG購自中杉金橋公司；其他試劑為分析純產(chǎn)品。

1.2重組蛋白的制備與鑒定 將pET-1EG95s、pET-2EG95s、pET-3EG95s重組菌37℃搖振培養(yǎng)過夜，次d按10% 轉(zhuǎn)接40 mL，37℃搖振培養(yǎng)至OD600=2.0時(shí)，加入IPTG至終濃度0.025 mmol/L，誘導(dǎo)6 h,表達(dá)產(chǎn)物通過AKTA purifier按照His FF crude說明書進(jìn)行純化。純化蛋白分別命名為HIS-1EG95s、HIS-2EG95s、HIS-3EG95s，對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行Western-blot驗(yàn)證。

1.3免疫程序 將32只6-8周齡的BALB/c小鼠，隨機(jī)分為4組，每組8只。1組作為空白對(duì)照，另3組分別免疫HIS-1EG95、HIS-2EG95、HIS-3EG95。將純化好的蛋白分別用紫外分光光度計(jì)定量，免疫劑量為40 μg/次/只。將重組蛋白抗原加弗氏完全佐劑1∶1均勻乳化后，腹部皮下多點(diǎn)注射免疫接種小鼠，首次免疫2 w后，以相同劑量加等量弗氏不完全佐劑腹腔注射進(jìn)行第2次免疫，間隔4 w后進(jìn)行第3次免疫，方法同第2次免疫。

1.4樣品收集 分別于1免后第1 w、2w、3 w(2免后1 w)、4 w(2免后2 w)對(duì)小鼠進(jìn)行斷尾采血， 第6 w(3免后2 w)摘眼球采血。每次采血約50-100 μL，37℃靜置1 h，4 ℃過夜，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，取上清置于滅菌EP管中，于- 80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5免疫小鼠血清特異性抗體檢測(cè) 參照本實(shí)驗(yàn)室建立的羊細(xì)粒棘球蚴病抗體間接ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行[7]，具體如下：

以純化的HIS-1EG95s蛋白包被ELISA板， 100 μL /孔(1 μg)，4℃過夜，取出后PBST洗滌3次，每次3 min；再加含10%牛血清的PBST(封閉液)，200 μL/孔，于37 ℃封閉2 h，取出洗滌同前；將所有小鼠血清樣本進(jìn)行1∶200倍稀釋，加入設(shè)定的孔中，100 μL /孔，同一樣品作3個(gè)重復(fù)孔，并作1個(gè)空白對(duì)照孔，于37℃作用1 h，取出洗滌；接著加100 μL酶標(biāo)2抗(工作濃度1∶5 000)于37 ℃作用1 h，取出洗滌；繼而加入100 μL底物溶液，37 ℃避光反應(yīng)15 min；最后加入100 μL 2mol/L的H2SO4終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD450 nm值。

1.6免疫42d后免疫小鼠最終抗體滴度的檢測(cè) 將3次免疫后2 w所采的小鼠血清樣本由1∶200倍開始進(jìn)行2倍梯度稀釋，按以上ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，得到小鼠血清最終抗體滴度。

1.7免疫后IFN-γ檢測(cè) 于1免后第3 d對(duì)小鼠采血，離心分離血清，利用BD OptEIATMSet Mouse IFN-γ試劑盒(BD Biosciences, San Diego, CA)檢測(cè)小鼠血清中IFN-γ的含量。

1.8與血清反應(yīng)的差異分析 將HIS-1EG95、HIS-2EG95和HIS-3EG95按10和1 μg/mL濃度包被，用足量的羊包蟲陽性血清和陰性血清和酶標(biāo)二抗進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，分析HIS-1EG95、HIS-2EG95和HIS-3EG95反應(yīng)的差異性。

2 結(jié) 果

2.1重組蛋白的純化和檢驗(yàn) 將純化的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，確認(rèn)其純化效果(見圖1)，經(jīng)Western-blot驗(yàn)證，純化后的3種重組蛋白均能與綿羊EG95陽性血清反應(yīng)產(chǎn)生特異性條帶(見圖2)，表明重組蛋白具有反應(yīng)原性，因此，該種方法純化的重組蛋白抗原可用于免疫動(dòng)物，研究其免疫原性。

2.2免疫后小鼠抗體動(dòng)態(tài)水平監(jiān)測(cè) 將免疫后第1、2、3、4、6 w采集到的各組小鼠血清以1∶200倍稀釋，進(jìn)行ELISA檢測(cè)將采集到的各組小鼠血清以1∶200倍稀釋，進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果見表1和圖3。

結(jié)果顯示，首次免疫后，3個(gè)重組蛋白免疫組抗體水平均迅速上升，免疫后1 w即能檢測(cè)到特異性抗體，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.01)。2免和3免后抗體反應(yīng)OD450nm值與1免相比，差異顯著(P<0.05)，2免與3免后的抗體反應(yīng)OD450 nm值相比，無顯著差異(P>0.05)。1免后，HIS-1EG95s組抗體水平迅速升高，與其他兩組相比P<0.05，而1免后2 w開始，HIS-3EG95s組抗體水平逐漸超過HIS-1EG95s組。而在整個(gè)過程中，HIS-2EG95s組抗體水平均低于其他兩組，且差異明顯(P<0.05)。

圖1蛋白純化效果鑒定

M: 蛋白低分子量marker; 1: HIS-31EG95s; 2: HIS-2EG95s; 3: HIS-13EG95s.

Fig.1Resultofthepurifiedprotein

M: Low molecular weight protein marker; 1: HIS-1EG95s; 2: HIS-2EG95s; 3: HIS-3EG95s.

圖2純化蛋白的Western-blot鑒定

M: 蛋白低分子量marker; 1: HIS-31EG95s; 2: HIS-2EG95s; 3: HIS-13EG95s.

Fig.2IdentificationofpurifiedproteinbyWestern-blot

M: Low molecular weight protein marker; 1: HIS-1EG95s; 2: HIS-2EG95s; 3: HIS-3EG95s.

圖3 小鼠血清抗體動(dòng)態(tài)水平

2.3免疫42 d后小鼠最終抗體滴度的檢測(cè) 用ELISA法測(cè)定第l次免疫后第6 w(42 d)小鼠的血清抗體滴度，從1∶200開始倍比稀釋到1∶1 638 400的OD450nm值，結(jié)果見表2及圖4。

結(jié)果顯示，免疫組的抗體水平與對(duì)照組的抗體水平在所有滴度上均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，說明重組蛋白免疫確實(shí)誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了特異性的抗體。

圖4 免疫42 d后小鼠最終抗體滴度

免疫時(shí)間(w)Immune time (week)免疫后1 w1 w post-immunization免疫后2 w2 w post-immunization免疫后3 w3 w post-immunization免疫后4 w4 w post-immunization免疫后6 w6 w post-immunization對(duì)照組Control group0.019±0.0060.030±0.0140.036±0.0170.032±0.0140.057±0.060HIS-1EG95s組HIS-1EG95s group2.023±0.0572.084±0.0572.539±0.0062.868±0.0252.870±0.110HIS-2EG95s組HIS-2EG95s group1.448±0.2241.716±0.2202.436±0.1092.741±0.0312.788±0.061HIS-3EG95s組HIS-3EG95s group1.467±0.1082.099±0.1092.542±0.0182.891±0.0332.930±0.076

表2 免疫后42 d的抗體滴度

HIS-1EG95s和HIS-2EG95s兩組均為1∶819 200，HIS-3EG95s組為1∶1 638 400，提示HIS-3EG95s組與其他兩個(gè)免疫組有1個(gè)倍比稀釋的差異。在同一滴度上比較，HIS-2EG95s組低于其他兩組，在所有滴度上比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HIS-1EG95s組和HIS-3EG95s組相比，HIS-3EG95s較高，從1∶12 800-1∶819 200的同一滴度上比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示，HIS-3EG95s刺激小鼠產(chǎn)生特異性抗體的能力比其他兩組更持久。

2.4免疫后IFN-γ檢測(cè) 一免后第3d利用BD OptEIA TM Set Mouse IFN-γ試劑盒(BD Biosciences, San Diego, CA)檢測(cè)小鼠血清中IFN-γ的含量，結(jié)果顯示HIS-1EG95s、HIS-2EG95s和HIS-3EG95s免疫后均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的IFN-γ，但各組之間無顯著差異(P>0.05)，見圖5。

2.5與陽性血清反應(yīng)的差異分析將HIS-1EG95、HIS-2EG95和HIS-3EG95按10和1 μg/mL濃度包被，用足量的羊包蟲陽性血清和陰性血清和酶標(biāo)二抗進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，分析HIS-1EG95、HIS-2EG95和HIS-3EG95反應(yīng)的差異性，結(jié)果顯示10和1 μg/mL包被時(shí)，HIS-1EG95s的反應(yīng)性均顯著低于HIS-2EG95s和HIS-3EG95s，而HIS-2EG95s和HIS-3EG95s反應(yīng)性相當(dāng)，表明HIS-2EG95s和HIS-3EG95s略優(yōu)于HIS-1EG95s，結(jié)果見表3。

圖5 免疫3 d后小鼠血清IFN-γ檢測(cè)

3 討論

棘球蚴病在人和動(dòng)物之間傳播，嚴(yán)重危害人畜健康。我國是包蟲病危害嚴(yán)重的國家之一[7-8]。我國目前約有近100萬人患病，幾千萬人受到棘球蚴病的威脅[7,11-12]。據(jù)臨床病例統(tǒng)計(jì)和小樣本調(diào)查結(jié)果顯示，發(fā)病率仍呈持續(xù)上升趨勢(shì)。免疫接種是防控該病的途徑之一，尋找高效的疫苗，是羊棘球蚴(包蟲)病疫苗研究的一個(gè)重要目標(biāo)[12]。Lightowlers發(fā)現(xiàn)Eg95重組蛋白疫苗免疫綿羊，可獲得95%～100%的免疫保護(hù)作用，其中86%得到完全保護(hù)，但因其重組蛋白表達(dá)量偏低且為包涵體表達(dá)，制約了該疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用[6]。

表3 與陽性血清反應(yīng)的差異分析

用HIS-1EG95s作為包被抗原，通過已建立的間接ELISA方法對(duì)小鼠血清抗體水平進(jìn)行檢測(cè)，各組間的抗體動(dòng)態(tài)變化水平顯示，HIS-1EG95s、HIS-2EG95s和HIS-3EG95s重組蛋白均能誘導(dǎo)小鼠的體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生特異性抗體，因此均具有良好的免疫原性。在一免后1w，HIS-1EG95s組小鼠抗體水平迅速上升，明顯高于其他兩組，而在第2周時(shí)HIS-3EG95s組抗體水平超過HIS-1EG95s組，并在2次免疫及3次免疫后持續(xù)略高與HIS-1EG95s組?？赡苁且?yàn)橐淮蚊庖呤瞧は露帱c(diǎn)注射，抗原蛋白是通過微血管吸收，由于HIS-1EG95s蛋白較小，更易于吸收，因此在第1周的時(shí)候抗體水平較高。而免疫兩周后，重組蛋白已完全吸收，而后又采用腹腔注射，腹膜面積大，直接吸收，因此抗體水平的升高都沒有延緩。 2次免疫之后，抗體水平顯著上升，表明加強(qiáng)免疫可有效提高免疫效果。3次免疫之后，抗體水平相比于2免后略有上升，并穩(wěn)定在一個(gè)較高的抗體水平，HIS-2EG95s組略低，其他兩組水平差異不大，表明2次免疫足夠產(chǎn)生很好的免疫效果。對(duì)最終抗體滴度的檢測(cè)結(jié)果表明，HIS-3EG95s組要高于其他兩組。在同一抗體滴度水平上比較，HIS-2EG95s始終低于HIS-3EG95s，且差異顯著，HIS-1EG95s組也低于HIS-3EG95s組，且在1∶12 800以后差異顯著，說明HIS-3EG95s誘導(dǎo)小鼠機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體的能力和持久性要強(qiáng)于其他兩種蛋白，可能產(chǎn)生更好的保護(hù)性，表明在進(jìn)行Eg95重組表達(dá)過程中，可通過串聯(lián)表達(dá)，提高基因拷貝數(shù)的方法提高表達(dá)蛋白的免疫保護(hù)效果，從而為制造更為有效的羊棘球蚴(包蟲)病疫苗提供了參考依據(jù)。

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