常洪濤，劉慧敏，趙 軍，陳 陸，楊 霞，王新衛(wèi)，姚惠霞，王川慶

腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV)是一種重要的人畜共患疫病病原[1]，屬小RNA病毒科、心病毒屬，可以感染豬、野生動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物和靈長類動(dòng)物等[2-3]，近年來人感染發(fā)病也時(shí)有發(fā)生[4-5]。自然條件下，鼠類是EMCV的自然貯存宿主和傳播者[6-7]，但其感染最廣泛和最嚴(yán)重的動(dòng)物是豬，臨診上主要引起母豬繁殖障礙及斷奶仔豬的腦炎、心肌炎和急性死亡等[8-9]。自1958年巴拿馬豬群中首次發(fā)生疫情以來，許多國家相繼報(bào)道了該病的存在和發(fā)生。中國自2005年從疑似病死豬體內(nèi)成功分離到首株EMCV并作較多研究[10-17]。特對(duì)家養(yǎng)野豬EMCV河南株進(jìn)行分離、鑒定和全基因組測序解析，以期了解不同豬種對(duì)EMCV的易感情況。

1 材料與方法

1.1病料采集和病毒的分離鑒定 2012年5月收集河南省焦作市某養(yǎng)豬場送檢的疑似發(fā)病家養(yǎng)野豬的心臟、淋巴結(jié)和脾臟等標(biāo)本，-20 ℃凍存待用。病毒分離、電鏡觀察和初步鑒定等工作均參考蓋新娜等[10]的方法進(jìn)行。

1.2RT-PCR及測序 取分離毒的細(xì)胞培養(yǎng)液，使用TRIZOL提取總RNA。參考文獻(xiàn)[18]中的各片段特異性引物和反應(yīng)條件，分別進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增、基因克隆和序列測定。并應(yīng)用Chromas2.33軟件進(jìn)行拼接，獲得全基因組序列。

1.3同源性比較與系統(tǒng)進(jìn)化分析 運(yùn)用MegAlign程序，將分離毒全基因組序列與19株從NCBI GenBank搜集下載的EMCV參考毒株的基因序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié) 果

2.1病毒分離及鑒定 從疑似病料組織中成功分離到1株家養(yǎng)野豬EMCV，命名為JZ1202株。在透射電鏡下可以清晰觀察到數(shù)個(gè)形狀規(guī)則，直徑大小約為25～29 nm的圓形病毒粒子(圖1)。1～4代分離毒細(xì)胞培養(yǎng)物的TCID50經(jīng)測定，分別為10-6.32/0.1 mL、10-5.9/0.1 mL、10-7.42/0.1 mL和10-7.63/0.1 mL；分離毒經(jīng)終濃度為4.8%分析純氯仿處理后，其TCID50為10-5.78/0.1 mL，略低于對(duì)照組的10-7.63/0.1 mL，但仍可判定為不敏感；分離毒經(jīng)1%胰蛋白酶溶液37 ℃消化1 h后，其TCID50由10-7.63/0.1 mL降低到10-3.94/0.1 mL，說明對(duì)胰蛋白酶較為敏感；病毒液在pH3.0的酸性環(huán)境中作用1 h后，其TCID50由10-7.63/0.1 mL降低到10-3.53/0.1 mL，表明該分離毒不耐酸；將分離毒分別置于37 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃時(shí)處理1 h，發(fā)現(xiàn)37 ℃時(shí)病毒滴度并無明顯變化，50 ℃時(shí)其TCID50由10-7.18/0.1 mL降低至10-4.25/0.1 mL，60 ℃時(shí)已完全失活，失去感染力，從而表明該分離株對(duì)熱敏感；將分離株置于1.1 mol/L MgCL2溶液中50 ℃水浴1 h，測定TCID50為10-4.32/0.1 mL，與對(duì)照組的10-3.99/0.1 mL差異不明顯，說明二價(jià)陽離子對(duì)分離毒并未有保護(hù)作用。

圖1JZ1202株感染BHK-21超微形態(tài)電鏡圖

Fig.1UltrastructuralmorphologicfeaturesofJZ1202strain-infectedBHK-21cellscollectionsofpicornavirusparticles

2.2病毒基因組序列及結(jié)構(gòu)分析 通過序列拼接，JZ1202株的基因組全長為7 735 bp(GenBank：KF836387)，其中5′-UTR包含724 bp，3′-UTR包含132 bp，中間為一個(gè)大的ORF(6 879 bp)編碼的由2 292個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白，該多聚蛋白可切割成1個(gè)病毒自身編碼的前導(dǎo)蛋白(L)和11個(gè)蛋白終產(chǎn)物(1A～1D、2A～2C和3A～3D)(圖2)。

圖2 JZ1202株的全基因組結(jié)構(gòu)圖

2.3病毒全基因組及各基因片段的同源性比較 全基因組序列分析結(jié)果表明，JZ1202株與國內(nèi)外不同動(dòng)物源EMCV參考毒株的核苷酸同源性為81.2%～99.9%，其中與國內(nèi)豬源分離毒(GXLC、GX0601、BJC3、HB1、NJ08和BD2)的同源性高達(dá)99.4%以上，與韓國豬源分離毒(CBNU、K3和K11)和歐美豬源分離毒(PV21、EMC-D、D variant和EMCV-30)的同源性分別為99.4%～99.6%和83.6%～99.3%，與國內(nèi)(GX0602)、外(PEC9和Rz-pMwt)鼠源毒株的同源性分別為99.4%和81.3%～99.5%。進(jìn)而與參考毒株ORF和各基因片段的核苷酸、氨基酸序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)JZ1202株結(jié)構(gòu)蛋白中，VP1變異幅度最大，VP2最為保守；非結(jié)構(gòu)蛋白中，2A變異幅度最大，3D最為保守；非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)相比結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)較為保守。將VP1蛋白與國內(nèi)豬源EMCV比較后發(fā)現(xiàn)，氨基酸變異多發(fā)生在7～63位，7位由K→R，13位與GXLC均由A→T，63位與BD2、BJC3、HB1均為Q，不同于GX0601和GCLX的G。

2.4病毒系統(tǒng)進(jìn)化分析 基于JZ1202株全基因組、ORF和VP1基因序列繪制的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示(圖3)，可見EMCV分為 G1、G2和G3 3個(gè)群。豬源EMCV主要分布在G1群和G2群，鼠源 EMCV 在G1群和G3群中均有分布。JZ1202株與HB1親緣關(guān)系最近，并與國內(nèi)的良種豬源、鼠源和華南虎源EMCV同屬于G1群。

圖3 基于JZ1202株全基因組(A)、ORF(B)和VP1基因(C)核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討 論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前感染人的病原體中60%屬于人獸共患病，而這些病原體71%以上源于野生動(dòng)物。近年來，野豬及相關(guān)產(chǎn)品作為綠色食品的重要來源之一，因其獨(dú)特的營養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味而日益?zhèn)涫芮嗖A，國內(nèi)各地都在進(jìn)行野豬資源的開發(fā)利用，如野豬家養(yǎng)或作為父本經(jīng)濟(jì)雜交以滿足人們的消費(fèi)需求。但隨之而來的問題是，由于野生生態(tài)環(huán)境改變，接觸家豬機(jī)會(huì)頻繁以及屠宰、加工、消費(fèi)環(huán)節(jié)中存在的風(fēng)險(xiǎn)因素，都使得野豬攜帶多種病原體并感染家畜和人類變成可能。國內(nèi)已分離到多株良種豬源EMCV，但有關(guān)家養(yǎng)野豬源EMCV的研究尚未見報(bào)道，因此開展其分離、鑒定和遺傳演化工作，可為研究EMCV的分子流行病學(xué)特征、分子生態(tài)學(xué)、疫苗毒株篩選和制定綜合防控措施提供科學(xué)依據(jù)。

JZ1202株分離自家養(yǎng)野豬，通常情況下該豬種抗病力極強(qiáng)，而該毒株的成功分離證實(shí)EMCV可感染家養(yǎng)野豬并導(dǎo)致發(fā)病，但其是否來源于良種豬或是由于傳統(tǒng)飼養(yǎng)模式改變而導(dǎo)致的自身內(nèi)源感染，則有待進(jìn)一步研究。另外，EMCV在疑似病料組織中的含量很低，生產(chǎn)中也多表現(xiàn)為亞臨床感染，因此病毒的直接分離、鑒定等工作難以直接開展。筆者曾多次嘗試應(yīng)用常規(guī)RT-PCR方法從病料中直接檢測EMCV，但從未獲得成功。由于豬瘟病毒(SCFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS)、豬圓環(huán)病毒(PCV)、豬偽狂犬病毒(PRV)和豬細(xì)小病毒(PPV)等多種豬重要病毒性病原均無法在BHK-21細(xì)胞上增殖，而EMCV接種后則很快能出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變(CPE)。因此，作者先將疑似病料處理后接種BHK-21細(xì)胞，一旦出現(xiàn)CPE后再用RT-PCR方法進(jìn)行檢測，最終成功分離到國內(nèi)首株家養(yǎng)野豬源EMCV。這種改進(jìn)的“細(xì)胞接種與RT-PCR方法相結(jié)合”技術(shù)，一方面可利用細(xì)胞接種技術(shù)進(jìn)行初步鑒定，另一方面則大幅提高了病料組織中EMCV的檢出率和分離率。

開展不同豬種EMCV地方分離株的基因組序列測定與分析，對(duì)豐富病毒流行病學(xué)資料和研究病毒結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系至關(guān)重要。本研究成功獲得JZ1202株全基因組序列，分析結(jié)果表明，該病毒與國內(nèi)豬源EMCV分離毒株高度同源，說明可能彼此間交叉感染或具有共同感染來源，從而提醒我們?cè)谶M(jìn)行野生動(dòng)物養(yǎng)殖活動(dòng)中要充分考慮人獸共患疫病傳播的生態(tài)學(xué)。另外，該毒株與韓國分離株的親緣關(guān)系較近，與絕大多數(shù)歐美分離株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但與德國分離株X74312的同源性高達(dá)99.3%，從而提示EMCV存在較大的地域差異，但傳播應(yīng)有一定范圍內(nèi)的區(qū)域限制性，日益發(fā)達(dá)的國際交通和貿(mào)易可能會(huì)加速EMCV的擴(kuò)散。

現(xiàn)有研究表明，EMCV在豬只之間傳播能力有限，而鼠類等嚙齒目動(dòng)物在豬群EMCV的傳播過程中具有重要作用。在本研究中，JZ1202株與國內(nèi)鼠源毒株的同源性高達(dá)99.6%，親緣關(guān)系極近，從而提示EMCV在家養(yǎng)野豬和鼠之間可能存在著交叉感染與傳播，但要對(duì)鼠在EMCV傳播中的精確定位仍需做進(jìn)一步研究，而做好豬場內(nèi)及周邊的滅鼠工作，卻無疑會(huì)對(duì)有效防控豬EMCV感染至關(guān)重要。

VP1基因是EMCV基因組中最重要的中和性抗原表位所在區(qū)域，變異幅度最大，其氨基酸序列與致病性密切相關(guān)，因此對(duì)其開展相關(guān)研究最具價(jià)值。本研究通過對(duì)JZ1202株與國內(nèi)豬源參考毒株的全基因組、ORF和各基因片段進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)彼此間盡管同源性很高，但VP1蛋白已出現(xiàn)細(xì)微變異，提示EMCV在感染家養(yǎng)野豬時(shí)可能會(huì)發(fā)生個(gè)別氨基酸的突變，以適應(yīng)新的豬種。

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