何 軍，曾焱華，游曉星，伍紹堅(jiān)，田 巍，劉 君，吳移謀

生殖支原體(Mycoplasmagenitalium,Mg)是由Tully等從非淋菌性尿道炎患者尿道分泌物中分離出的一種支原體，可引起急慢性尿道炎、陰道炎、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、輸卵管性不孕不育等多種疾病，并且與AIDS患者的發(fā)展死亡密切相關(guān)[1-3]。由于支原體缺乏細(xì)胞壁，其膜表面存在的大量脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白((lipid-associated membrane proteins, LAMPs)是其黏附、定植、入侵宿主細(xì)胞以及引起宿主細(xì)胞炎癥反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)[4]。本研究試探討CD14在生殖支原體LAMPs激活NF-κB中的作用，從而為Mg的致病機(jī)制研究及治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和細(xì)胞 Mg-37標(biāo)準(zhǔn)株由南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所保存，人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2試劑和試劑盒 青霉素、多粘菌素B購(gòu)自Solarbio；無(wú)支原體牛血清和超級(jí)新生胎牛血清購(gòu)自四季青生物工程公司；RPMI-1640和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone；PPLO購(gòu)自BD公司；NF-κBp65 (Total) ELISA KIT購(gòu)自Life Technologies公司；細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒購(gòu)自碧云天生物；Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司；1%人血清來自正常體檢者并經(jīng)其同意使用。

1.2方法

1.2.1Mg培養(yǎng)及LAMPs的提取 將Mg菌液按1∶40比例接種于PPLO改良培養(yǎng)基中于95%CO2、37℃恒溫下培養(yǎng)3～4 d，培養(yǎng)基顏色由玫瑰紅色變?yōu)榍辶恋某壬珪r(shí)，表示Mg生長(zhǎng)已進(jìn)入對(duì)數(shù)期。Mg LAMPs的提取按照參考文獻(xiàn)進(jìn)行[5]，BCA法測(cè)定蛋白濃度后置于-80℃?zhèn)溆?。Mg LAMPs在刺激前用100 μg/mL多粘菌素B處理2 h，去除可能存在的內(nèi)毒素污染。

1.2.2THP-1細(xì)胞培養(yǎng)及LAMPs刺激 THP-1細(xì)胞在含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。①在THP-1細(xì)胞加入1%正常人血清37℃孵育2 h，再用4.0 μg/mL LAMPs刺激8 h；②在THP-1細(xì)胞與10 μg/mL CD14抗體37 ℃孵育30 min，再用4.0 μg/mL LAMPs刺激8 h。

1.2.3細(xì)胞核蛋白的提取 離心收集THP-1細(xì)胞，PBS洗滌一遍，離心后棄上清，加入含PMSF的細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A 200 μL，劇烈振蕩完全懸浮，冰浴15 min后加入細(xì)胞漿蛋白抽提試劑B 10 μL，劇烈振蕩后冰浴60 s，再振蕩懸浮，4℃、14 000 r/min離心5 min后棄上清，再加入含PMSF的細(xì)胞核蛋白抽提試劑50 μL，劇烈振蕩30 s重懸后冰浴，每隔120 s劇烈振蕩30 s，共30 min，4℃、14 000 r/min離心10 min所提取的為細(xì)胞核蛋白保存至-80℃待測(cè)。

1.2.4NF-κBp65水平的測(cè)定 提取細(xì)胞核蛋白，采用ELISA法根據(jù)NF-κBp65 ELISA試劑盒操作說明書進(jìn)行，其結(jié)果以每mg核蛋白提取物中含NF-κBp65的A450值表示，即A450/mg。

1.2.5共轉(zhuǎn)染及NF-kB活性的測(cè)定 ①以pcDNA-CD14，pFLAG-TLR2， pNF-kB-luc及pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞24 h后，再用LAMPs刺激8 h；②LAMPs用10 μg/mL sCD14 37℃共孵育30 min后，再刺激0.1 μg/mL pFLAG-TLR2，0.05 μg/mL pNF-kB-luc，0.005 μg/mL pRL-TK共轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞8 h。分別消化收集HeLa細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液200 μL，再加入100 μL螢火蟲熒光素酶檢測(cè)試劑，測(cè)定pNF-kB-luc的RLU值，再加入Renilla熒光素酶檢測(cè)工作液100 μL，測(cè)定pRL-TK的RLU值，根據(jù)pNF-kB-luc/pRL-TK比值計(jì)算NF-kB的活化程度。

2 結(jié) 果

2.1人血清上調(diào)LAMPs激活NF-κBp65 前期研究證實(shí)Mg LAMPs能誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞激活NF-κBp65[6]。在與1%人血清孵育2 h后，再以4.0 μg/mL Mg LAMPs刺激THP-1細(xì)胞8 h，ELISA結(jié)果顯示人血清組NF-κBp65水平明顯高于同濃度未加人血清組，并且隨LAMPs濃度增加而增加，結(jié)果見圖1。

圖1人血清上調(diào)LAMPs激活NF-κBp65

Fig.1ActivationofNF-κBp65weresignificantlyup-regulatedinLAMPsbyhumanserum

Compared with no serum group,P<0.05.

2.2CD14中和抗體對(duì)NF-κBp65的影響 用10 μg/mL CD14中和抗體與THP-1細(xì)胞共孵育30 min，再用4.0 μg/mL LAMPs刺激8 h后，ELISA結(jié)果顯示CD14中和抗體能明顯降低激活的NF-κBp65水平，結(jié)果見圖2。

2.3mCD14上調(diào)LAMPs激活NF-κB 以0.1～2.0 μg/mL pcDNA-CD14與0.1 μg/mL pFLAG-TLR2，0.05 μg/mL pNF-kB-luc，0.005 μg/mL pRL-TK共轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞24 h后，再用4.0 μg/mL LAMPs刺激8 h。當(dāng)pcDNA-CD14質(zhì)粒濃度為1.0 μg/mL時(shí)，結(jié)果顯示pNF-kB-luc/pRL-TK相對(duì)熒光比值最高，結(jié)果見圖3。

2.4sCD14上調(diào)LAMPs激活NF-κB 預(yù)先用10 μg/mL sCD14與4.0 μg/mL LAMPs 37℃共孵育30 min，再刺激0.1 μg/mL pFLAG-TLR2，0.05 μg/mL pNF-kB-luc，0.005 μg/mL pRL-TK共轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞，8 h后pNF-kB-luc/pRL-TK相對(duì)熒光比值顯示sCD14也能上調(diào)LAMPs激活NF-κB，結(jié)果見圖4。

圖2CD14中和抗體抑制LAMPs激活NF-κBp65

Fig.2CD14neutralizingantibodyinhibitedtheactivationofNF-κBp65inLAMPsstimulatedTHP-1cells

Compared with IgG group,P<0.05.

圖3mCD14上調(diào)LAMPs激活NF-κB

Fig.3ActivationofNF-κBweresignificantlyup-regulatedinLAMPsactivatedHelacellsbymCD14

Compared with 0.5 group,P<0.05.

圖4sCD14上調(diào)LAMPs激活NF-κB

Fig.4ActivationofNF-κBweresignificantlyup-regulatedinLAMPsactivatedHelacellsbysCD14

Compared with Mg LAMPs group,P<0.05.

3 討 論

支原體廣泛存在于自然界，是一類缺乏細(xì)胞壁、呈高度多形性、能通過濾菌器、可在無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)中繁殖的最小原核細(xì)胞型微生物。支原體的細(xì)胞膜是與宿主細(xì)胞相互作用的主要成分，而膜上豐富的LAMPs是影響機(jī)體炎癥反應(yīng)的主要蛋白。目前已證實(shí)LAMPs能誘導(dǎo)多種細(xì)胞分泌一系列炎癥因子和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、壞死[7]。由于其生物活性的發(fā)揮可能要通過LAMPs中多種蛋白的相互作用，因些對(duì)LAMPs的整體研究相對(duì)單個(gè)膜蛋白來說更有意義。我們前期研究發(fā)現(xiàn)Mg LAMPs能激活NF-κB，并且與TLR2有關(guān)[6]。NF-κB廣泛存在于各種類型的真核細(xì)胞中，當(dāng)機(jī)體在遭受外界病原感染時(shí)能通過識(shí)別相關(guān)分子模式引發(fā)機(jī)體相應(yīng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)活化的重要作用就是通過誘導(dǎo)激活下游的免疫及炎性相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[8]。我們結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人血清能明顯上調(diào)LAMPs激活NF-κB，我們推測(cè)人血清中sCD14可能在上調(diào)中發(fā)揮了一定的作用。隨后用CD14中和抗體處理THP-1細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)能顯著抑制LAMPs激活NF-κB。這些實(shí)驗(yàn)表明，CD14在LAMPs激活NF-κB過程中起著重要作用。

CD14是LPS的高親和性受體，可分為膜CD14(mCD14)和可溶性CD14(sCD14)兩種，兩者均在細(xì)菌性感染過程中具有重要的免疫介導(dǎo)作用[9]。mCD14通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定于細(xì)胞膜上，主要存在于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞等細(xì)胞表面。sCD14結(jié)構(gòu)與mCD14相似，但無(wú)GPI結(jié)構(gòu)，主要存在于血清、尿液和培養(yǎng)mCD14陽(yáng)性細(xì)胞的上清中。sCD14在血清中正常濃度為2～5 mg/mL，其來源可能是單核細(xì)胞上mCD14發(fā)生內(nèi)源性酶促反應(yīng)脫落或轉(zhuǎn)錄合成mCD14時(shí)不能PI化直接分泌入血[10]。sCD14的生物學(xué)活性與mCD14相似，也能直接與LPS結(jié)合，介導(dǎo)LPS所致的NF-κB[11]。Hela缺乏TLRs，但擁有NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑，有利于胞外各種刺激誘導(dǎo)的信號(hào)通路研究。我們通過共轉(zhuǎn)染和sCD14預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，mCD14和sCD14均上調(diào)LAMPs激活NF-κB。

最近研究證實(shí)LAMPs的生物活性主要與其脂質(zhì)成分，脂肽的、脂肪酸鏈的飽和程度、數(shù)量及?；潭扔嘘P(guān)[12]。最新研究發(fā)現(xiàn)，CD14能結(jié)合三?；慕閷?dǎo)免疫反應(yīng)，但LAMPs中是否存在三酰化蛋白仍存在爭(zhēng)議[13]。因此CD14上調(diào)LAMPs的具體機(jī)制還有待于更深一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Tully JG, Taylor-Robinson D, Cole RM, et al. A newly discoveredMycoplasmain the human urogenital tract[J]. Lancet, 1981, 1(8233): 1288-1291.

[2]Horner P, Blee KAdams E. Time to manageMycoplasmagenitaliumas an STI: but not with azithromycin 1 g![J]. Curr Opin Infect Dis, 2014, 27(1): 68-74. DOI: 10.1097/QCO.0000000000000030

[3]Cazanave C, Lawson-Ayayi S, Hessamfar M, et al. Prevalence ofMycoplasmagenitaliumamong HIV-infected women, Agence Nationale de Recherches sur le SIDA et les hepatites virales CO3 Aquitaine Cohort, France[J]. Sex Transm Dis, 2013, 40(8): 653-654. DOI: 10.1097/01.OLQ.0000431360.03712.1b

[4]Zhang WB, Baseman JB. Transcriptional regulation of MG_149, an osmoinducible lipoprotein gene fromMycoplasmagenitalium[J]. Mol Microbiol, 2011, 81(2): 327-339. DOI: 10.1111/j.1365-2958.2011.07717.x

[5]Shimizu T, Kida Y, Kuwano K. Triacylated lipoproteins derived fromMycoplasmapneumoniaeactivate nuclear factor-κB through toll-like receptors 1 and 2[J]. Immunol, 2007, 121(4): 473-483.

[6]He J, Zeng YH, You XX, et al. Lipid-associated membrane proteins ofMycoplasmagenitaliumactivate NF-kappaB via toll-like receptor 2[J]. Chin J Microbiol Immunol, 2010, 30 (12): 1137-1140. (in Chinese)

何軍，游曉星，曾焱華，等. 生殖支原體LAMPs經(jīng)TLR2激活NF-κB[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2010, 30(12):1137-1140.

[7]Wu Y, Qiu H, Zeng Y, et al.Mycoplasmagenitaliumlipoproteins induce human monocytic cell expression of proinflammatory cytokines and apoptosis by activating nuclear factor kappaB[J]. Mediators Inflamm, 2008, 195427. DOI: 10.1155/2008/195427

[8]Liang Y, Zhou Y, Shen P. NF-kappaB and its regulation on the immune system[J]. Cell Mol Immunol, 2004, 1(5): 343-350.

[9]Zanoni I, Granucci F. Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation[J]. Front Cell Infect Microbiol, 2013, 3: 32. DOI: 10.3389/fcimb.2013.00032

[10]LeBouder E, Rey-Nores JE, Rushmere NK, et al. Soluble forms of Toll-like receptor (TLR)2 capable of modulating TLR2 signaling are present in human plasma and breast milk[J]. J Immunol, 2003, 171(12): 6680-6689.

[11]Kitchens RL, Thompson PA. Modulatory effects of sCD14 and LBP on LPS-host cell interactions[J]. J Endotoxin Res, 2005, 11(4): 225-229.

[12]Shimizu T, Kida Y, Kuwano K. A triacylated lipoprotein fromMycoplasmagenitaliumactivates NF-kappaB through Toll-like receptor 1 (TLR1) and TLR2[J]. Infect Immun, 2008, 76(8): 3672-3678. DOI: 10.1128/IAI.00257-08

[13]Nakata T, Yasuda M, Fujita M, et al. CD14 directly binds to triacylated lipopeptides and facilitates recognition of the lipopeptides by the receptor complex of Toll-like receptors 2 and 1 without binding to the complex[J]. Cell Microbiol, 2006, 8(12): 1899-1909.