孫志華,劉良波,張 豫,劉 娟,韓玉霞,劉來珍,郭 乾,陳創(chuàng)夫,張 輝

布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)引起的動(dòng)物源性人獸共患傳染病[1]。屬“家畜、家禽防疫條例實(shí)施細(xì)則”中二類傳染病，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，尤其在中國，近年來，全世界范圍內(nèi)有回升的勢(shì)頭[2]。布魯氏菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，革蘭氏染色陰性，可引起天然宿主網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)持續(xù)性感染[3]。在家畜和野生動(dòng)物中，主要引起雌性的流產(chǎn)、繁殖生育能力的下降；致使雄性發(fā)生睪丸炎、附睪炎，最終發(fā)展為不育癥。人感染后出現(xiàn)“波浪熱”，心內(nèi)膜炎，腦炎以及關(guān)節(jié)和腰部脊柱疼痛等癥狀[4]。在急性感染期，布魯氏菌可侵襲胎盤絨毛膜的滋養(yǎng)層細(xì)胞，容易引起母畜流產(chǎn)，但是其分子機(jī)制目前尚不完全清楚[5]。巨噬細(xì)胞和胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞是布魯氏菌主要宿主細(xì)胞，virB區(qū)編碼的Ⅳ型分泌系統(tǒng)(T4SS)在布魯菌感染宿主過程中發(fā)揮著重要作用[6-7]。布魯氏菌T4SS由virB操縱子編碼，共12個(gè)基因(virB1-virB12)；由同一啟動(dòng)子調(diào)控，是一個(gè)多蛋白的跨膜復(fù)合物，受宿主細(xì)胞類型、生長溫度、營養(yǎng)條件、pH值等因素調(diào)控[8]。其中VirB4暴露于細(xì)胞液中，有一個(gè)完整的三磷酸核苷酸結(jié)合區(qū)，對(duì)物質(zhì)的運(yùn)輸起重要作用。進(jìn)一步的研究表明，virB4是流產(chǎn)相關(guān)基因[9]。Kim[10]等采用缺失virB4基因的牛種布魯氏菌疫苗株S19的突變株接種孕期母鼠，發(fā)現(xiàn)突變株可以在胎盤中繁殖，其侵染力和繁殖力下降，不會(huì)引起流產(chǎn)。由此可見布魯氏菌VirB4蛋白與侵染宿主引起的流產(chǎn)密切相關(guān)。因此，探索布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)的毒力因子和滋養(yǎng)層細(xì)胞靶蛋白的結(jié)合機(jī)制，為進(jìn)一步闡明布魯氏菌胞內(nèi)寄生機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1菌株 釀酒酵母菌株AH109(MATα表型)、釀酒酵母菌株Y187(GMATa表型)均購自Clontech公司，布魯氏菌RB51株和大腸桿菌E.coliDH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2試劑 膠原酶Ⅰ購自美國Gibco公司；TGS購自上海麥莎生物科技有限公司；熒光素酶標(biāo)記羊抗鼠IgG購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司；cDNA文庫構(gòu)建試劑盒、雙鏈cDNA純化試劑盒、酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備試劑盒、YPD培養(yǎng)基，SD/-Leu等營養(yǎng)選擇性培養(yǎng)均購自Clotech公司；酵母質(zhì)粒抽提試劑盒、SYBR Green熒光染料均購自北京天根生化科技有限公司；T4 DNA連接酶試劑盒，DNA Marker購自北京天為時(shí)代有限公司；限制性內(nèi)切酶NdeI/PstI購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、pMD18-T克隆載體、離心柱型質(zhì)粒小題試劑盒均購自天根生化科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1牛胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 取懷孕45～60 d母牛完整子宮，無菌條件下收集胎兒子葉，采用膠原酶消化方法分離胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)純化達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求后備用。

1.2.2布魯氏菌侵染牛胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞 cDNA文庫的構(gòu)建 布魯氏菌RB51以100∶1(細(xì)菌個(gè)數(shù)∶細(xì)胞個(gè)數(shù))的比例侵染牛胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞，提取侵染后滋養(yǎng)層細(xì)胞總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄20 μL 的cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR檢測。

1.2.3布魯氏菌virB4基因酵母表達(dá)載體的構(gòu)建

1.2.3.1目的基因的擴(kuò)增 設(shè)計(jì)并由上海生工合成virB4基因的引物，其上游：5′-CATATGGGCGCTCAATCCAAATAC-3′；下游：5′-CTGC

AGTCACCTTCCTGTTGATTTGGAC-3′。PCR

反應(yīng)體系(20 μL)：10×PCR buffer 2 μL，dNTP 0.8 μL，上、下游引物各0.2 μL，模板2 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，去離子水14.3 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 1 min，57 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min 40 s。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，回收目的片段，連接pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)，在含Amp(50 μg/mL)的 LB平板上篩選陽性菌落，經(jīng)菌液 PCR鑒定后，搖菌，進(jìn)行酶切和測序鑒定。

1.2.3.2酵母表達(dá)載體的構(gòu)建 連接目的基因virB4和pGBKT7得到誘餌質(zhì)粒 pGBKT7- virB4；將 pGBKT7-virB4重組子轉(zhuǎn)化至E.coliDE3感受態(tài)細(xì)胞，混勻、冰浴、熱擊轉(zhuǎn)化后均勻涂布于于含Kan(50 μg/mL)的LB平板上；挑取 PCR鑒定陽性的菌落于LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，-20 ℃保存，備用。

1.2.3.3pGBKT7-virB4重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 選取SD/-Leu和SD/-His陰性、SD/-Ura和YPDA陽性的釀酒酵母菌株Y187按Clontech公司的YeastmakerTMYeast Transformation System 2說明書制備感受態(tài)細(xì)胞；采用醋酸鋰法將 pGBKT7-virB4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至新制備的釀酒酵母菌Y187感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于SD/-Trp/Kan(20 μg/mL)平板上，30 ℃培養(yǎng)4 d；對(duì)長出的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠顯像系統(tǒng)中觀察。

1.2.3.4釀酒酵母菌Y187(pGBKT7-virB4)自激活檢測和毒性檢測 將釀酒酵母菌Y187(pGBKT7-virB4)涂于 SD/-Trp和 SD/-Trp-His平板上，30 ℃培養(yǎng)4～5 d，觀察 SD/-Trp和 SD/-Trp-His平板上菌落的生長情況；從SD/-Trp平板上挑選單個(gè)菌落進(jìn)行X-α-Gal分析，挑取釀酒酵母菌Y187陽性轉(zhuǎn)化子接種到80 mL SD/-Trp/Kan(20 μg/mL)液體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)20 h，檢測菌液的 OD值。

1.2.4酵母雙雜交篩選與布魯氏菌VirB4相互作用的滋養(yǎng)層細(xì)胞捕獲蛋白

1.2.4.1酵母雙雜交陰、陽性對(duì)照體系的建立 將 pGADT7-T轉(zhuǎn)化AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞作為對(duì)照prey 體系；將pGBKT7-53與pGBKT7-Lam轉(zhuǎn)化Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞作為對(duì)照bait體系。挑取攜帶有pGADT7-T質(zhì)粒的AH109菌斑與攜帶有pGBKT7-53質(zhì)粒的Y187菌斑，將兩種菌斑置于盛有500 μL 2×YPD 的1.5 mL離心管中，30 ℃，40 r/min搖菌培養(yǎng)20 h，離心棄上清，500 μL 2×YPD懸浮沉淀，取100 μL涂于SD/Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal 平板上，30 ℃ 倒置培養(yǎng)4 d。

1.2.4.2pGBKT7-virB4 與滋養(yǎng)層細(xì)胞cDNA 捕獲文庫的互作試驗(yàn) 分別挑取攜帶有 pGBKT7-virB4 的Y187菌斑接種到100 mL SD/-Trp/Kanr(50 μg/mL)液體培養(yǎng)基，30 ℃ 恒溫箱，54 r/min培養(yǎng)20 h，離心濃縮菌落，使菌落濃度≥1×109cells/mL；從-80℃冰箱中取出一管分裝的濃度大于2×107cells/mL的5 mL的凍存管的酵母菌AH109 (pGADT7-cDNA liberary)，融化后，向滅菌處理的2 L三角瓶中依次加入45 mL 2×YPD/Kanr(50 μg/mL)、2 mL酵母菌 AH109(pGADT7-cDNA liberary)、5mL Y187(pGBKT7-virB4)，無菌處理后，30 ℃ ，54 r/min搖菌培養(yǎng)20 h，離心棄上清，用50 mL 0.5×YPD/Kanr(50 μg/mL)洗滌兩次，用1 mL 0.5×YPD/Kanr(50 μg/mL)重懸沉淀，將菌懸液平均涂50個(gè)直徑為150 mm的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板，30 ℃ 倒置培養(yǎng)4 d。

1.2.4.3陽性菌落的 X-α-Gal 藍(lán)斑篩選 將在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 平板上長出的菌落轉(zhuǎn)接于的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上。置于30 ℃培養(yǎng)溫箱，觀察并記錄。

1.2.4.4陽性菌落的質(zhì)粒提取及鑒定 將SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上變藍(lán)的酵母菌分別接種到SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp液體培養(yǎng)基上，30 ℃ 培養(yǎng)，250 r/min培養(yǎng)72 h，用酵母小提質(zhì)粒試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取并用1.2 %瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.5特異結(jié)合蛋白輔酶 Q10和 SLC3A2 的 mRNA 表達(dá)檢測

1.2.5.1引物的設(shè)計(jì)和合成 依據(jù) GenBank所收錄的全序列，采用 Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)輔酶 Q10和 SLC3A2的引物序列，輔酶 Q10上游：5′-CCCGTCGATGTTTAGAGGAA-3′，下游5′-TTTGTCCAGCACACACTCGT-3′； SLC3A2上游：5′-ACCCCAGTGTTCAGCTATGG-3′，下游為：5′-ATGCTGAGGTGTTGGGAAAG-3′。

1.2.5.2目的基因 PCR 擴(kuò)增及產(chǎn)物的純化 以100∶1(細(xì)菌個(gè)數(shù)∶細(xì)胞個(gè)數(shù))的比例，用布魯氏菌RB51和S19株侵染滋養(yǎng)層細(xì)胞。用 TRIZOL試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后為模板，用PCR方法擴(kuò)增得到輔酶 Q10和 SLC3A2的基因片段。PCR擴(kuò)增體系(20.0 μL)：10×反應(yīng)緩沖液(含15.0 mmol/L MgCl2) 2.0 μL，dNTP(各2.5 mmol/L) 0.8 μL，上、下游引物各(25 μmol/L)0.2 μL，模板2 μL，Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL) 0.5 μL，補(bǔ)水至20.0 μL；PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5 %瓊脂糖凝膠電泳分析，并以瓊脂糖凝膠DNA回收純化試劑盒進(jìn)行純化，操作方法按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.2.5.3實(shí)時(shí)定量RCR檢測mRNA表達(dá)量的變化 構(gòu)建pMD18-T-Q10和pMD18-T-SLC3A2質(zhì)粒，挑選陽性克隆，進(jìn)行菌液PCR鑒定，提質(zhì)粒。經(jīng)鑒定正確后的陽性質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品備用。用微量紫外分光光度計(jì)測定 A260/280質(zhì)粒濃度，做記錄后，按公式算成拷貝數(shù)后，將其10倍系列稀釋成含有101～109的9個(gè)梯度，作為模板，在12.5 μL PCR反應(yīng)體系中加入：上，下游引物各0.5 μL，模板1 μL，SYBR 6.25 μL，補(bǔ)水至12.5 μL；按實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)3步法在 MaXro3000實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀進(jìn)行，數(shù)據(jù)被收集后，繪制擴(kuò)增曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線，利用制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較經(jīng)布魯氏菌RB51和S19侵染前后蛋白表達(dá)量的變化。

2 結(jié) 果

2.1cDNA文庫的建立

2.1.1總RNA檢測結(jié)果 1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳顯示28S、18S和5.8S rRNA條帶清晰，28S rRNA與18S rRNA的比例約為2∶1，總 RNA的完整性良好(圖1)。分光光度計(jì)檢測3.5 h提取的總RNA純度，測得A260/280值分別為1.90，表明總 RNA純度較高。LD-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可見文庫ds cDNA呈瀑布狀分布，大小在0.2～4 kb范圍，在接近1 kb左右的區(qū)域較為密集(圖2)。

圖1 總RNA凝膠電泳

圖2LD-PCR凝膠電泳

Fig.2DetectionofLD-PCRproducts

1: LD-PCR products; M: Marker IV

2.2cDNA文庫的篩選

2.2.1文庫轉(zhuǎn)化效率檢測結(jié)果 對(duì)隨機(jī)選取10個(gè)平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算出1個(gè)平板的平均菌落數(shù)為650個(gè)，共計(jì)200個(gè)平板，則cDNA文庫庫容量為1.3×106個(gè)轉(zhuǎn)化子，即在3 μg pGADT7-Rec(0.5 μg/μL)線性化載體中，有1.3×106個(gè)載體發(fā)生重組，達(dá)到了建庫的要求，即> 1×106轉(zhuǎn)化子/3 μg pGADT7-Rec。

2.2.2cDNA 文庫的污染檢測結(jié)果 將回收后的cDNA文庫的平均涂于5個(gè)直徑為150 mm SD/-Leu YPD平板 30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后，未見霉斑、絲狀物等出現(xiàn)，說明回收的文庫沒有受到污染。

2.2.3cDNA文庫插入片段長度評(píng)價(jià)結(jié)果 從平板上隨機(jī)挑取65個(gè)單克隆，提取質(zhì)粒，用文庫擴(kuò)增引物擴(kuò)增插入片段，進(jìn)行瓊脂糖電泳，圖3中是其中的23個(gè)克隆，結(jié)果表明該文庫的 cDNA插入片段在0.2～5.0 kb之間。

2．3與 virB4 互作蛋白的初步驗(yàn)證

圖3cDNA文庫插入片段的PCR鑒定

Fig.3DetectionofinsertsofcDNAlibrary

1-23: Clones of cDNA library; 24: Negative control.

2.3.1pGBKT7-virB4 的PCR和酶切鑒定結(jié)果 菌落PCR擴(kuò)增片段大小在2 000～3 000 bp之間，與預(yù)期結(jié)果2 496 bp一致。pGBKT7-virB4質(zhì)粒經(jīng)NdeI/PstI雙酶切后，電泳結(jié)果與預(yù)期(2 496 bp)相符(見圖4)。

圖4重組質(zhì)粒pGBKT7-virB4的PCR擴(kuò)增

Fig.4PCRamplificationofrecombinantplasmidpGBKT7-virB4

1-5: pGBKT7-virB4 PCR product; 6: Positive control; 7: Negative control

2.3.2轉(zhuǎn)化子Y187的鑒定 以SD/-Trp/Kan20 μg/mL固體培養(yǎng)基長出的菌落為模板進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果出現(xiàn)1條約2 596 bp的 DNA片段，大小與目標(biāo)片段一致(圖5)。

圖5Y187轉(zhuǎn)化子PCR鑒定

Fig.5Y187transformantamplifiedbyPCR

1-5: PCR product; 6: Negative control.

2.3.3自激活檢測和毒性檢測 經(jīng)過培養(yǎng)，SD/-Trp平板上長出100個(gè)左右的直徑為2～3 mm的菌落；在SD/-Trp-His平板上沒有菌落出現(xiàn)；經(jīng)X-α-Gal分析無藍(lán)色菌落出現(xiàn)，表明無自激活活性。挑取酵母菌Y187陽性轉(zhuǎn)化子接種到80 mL SD/-Trp/Kan(20 μg/mL)液體培養(yǎng)基上，30 ℃，250 r/min培養(yǎng)20 h，菌液的OD值大于0.8，表明Y187陽性轉(zhuǎn)化子無毒性。

2.3.4酵母雙雜交陰性、陽性對(duì)照結(jié)果 酵母菌株AH109 (pGADT7-T)與酵母菌株Y187 (pGBKT7-53)經(jīng)配合后，在SD/Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal的平板上長出直徑為2～3 mm的藍(lán)色菌落，而在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal未長出菌落。

2.3.5VirB4誘餌蛋白 X-α-Gal篩選 酵母菌株 AH109 (pGADT7-liberary)與酵母菌株Y187(pGBKT7-virB4)經(jīng)配合后，在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp的平板上長出直徑為2～3 mm的菌落。

再將這些菌落轉(zhuǎn)接到SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal，部分菌落變藍(lán)(圖6)。

圖6 VirB4 誘餌蛋白篩選陽性結(jié)果

2.3.6VirB4誘餌蛋白基因捕獲 prey 蛋白基因的序列分析 pGBKT7-virB4誘餌質(zhì)粒最終獲得13個(gè)陽性AD質(zhì)粒，Blastn序列分析結(jié)果(見表1)。

表1 陽性AD質(zhì)粒Blastn分析結(jié)果

2.3.7侵染前后輔酶Q10和SLC3A2基因表達(dá)量的變化 基因輔酶Q10的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=-3.52×LOG(X)+40.34，相關(guān)系數(shù)為0.998，擴(kuò)增效率為89.8%。基因SLC3A2的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=-4.147×LOG(X)+45.94，相關(guān)系數(shù)為0.993，擴(kuò)增效率為74.2%。同樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線條件下，檢測布魯氏菌S19和RB51侵染前后輔酶Q10基因和SLC3A2基因表達(dá)量的前后變化(以未侵染的cDNA為對(duì)照)，測得各自的擴(kuò)增曲線，發(fā)現(xiàn)侵染后輔酶Q10和SLC3A2的表達(dá)量均提高了(圖7)。

3 討 論

布魯氏菌是兼性胞內(nèi)寄生菌[11],胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞是布魯氏菌侵染的靶細(xì)胞。胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞受到損傷會(huì)引發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，影響胎兒向母體的植入，容易引發(fā)母畜流產(chǎn)[12]。布魯氏菌不產(chǎn)生外毒素，布魯氏菌的毒力主要表現(xiàn)在其侵襲力以及在宿主內(nèi)的生存和繁殖能力。因此，布魯氏菌的毒力因素一直是布病病原學(xué)中重要的研究問題之一，與布魯氏菌病的發(fā)病機(jī)理、免疫機(jī)制乃至臨床治療和預(yù)防等息息相關(guān)。布魯氏菌侵入細(xì)胞形成布氏小體后，能有效的阻止布氏小體和溶酶體融合，致使布魯氏菌能在細(xì)胞中寄生、繁殖。本文研究病原外膜蛋白與宿主細(xì)胞間的互作為布魯氏菌新型藥物的研發(fā)、家畜布病預(yù)防和治療提供科學(xué)依據(jù)。

圖7布魯氏菌侵染前后輔酶Q10和SLC3A2基因表達(dá)量的變化

Fig.7ExpressionofcoenzymeQ10andSLC3A2geneafterBrucellainfection

virB是布魯氏菌毒力基因，與宿主細(xì)胞胞內(nèi)生存、復(fù)制有關(guān)。1999年，T4SS首次由O’Callaghan[13]在豬布魯氏菌中發(fā)現(xiàn)，該系統(tǒng)是一個(gè)復(fù)合體，由12個(gè)跨越細(xì)菌胞壁的不同蛋白構(gòu)成，形成一個(gè)操縱子，是細(xì)菌在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和持續(xù)感染不可缺少的。VirB結(jié)構(gòu)的改變直接影響到布魯氏菌外膜的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，直至影響到布魯氏菌的胞內(nèi)適應(yīng)和存活[8]。VirB1是T4SS非必需的組件；VirB3、VirB6、VirB7、VirB8、VirB9、VirB10分布于胞膜孔道中可以傳送信號(hào)；VirB4和VirB11是兩個(gè)ATP酶分子，其中VirB4有一個(gè)完整的ATP結(jié)合區(qū)。Kim[10]等采用缺失VirB4基因的牛種布魯氏菌疫苗株S19的突變株接種孕期母鼠，發(fā)現(xiàn)突變株可以在胎盤中繁殖，其侵染力和繁殖力下降，不會(huì)引起流產(chǎn)?？梢?，布魯氏菌VirB4蛋白與侵染宿主引起流產(chǎn)密切相關(guān)，在本研究中篩選牛種布魯氏菌疫苗株VirB4蛋白在侵染牛胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞過程潛在的結(jié)合靶蛋白，為揭示牛種布魯氏菌感染與母畜流產(chǎn)之間的分子作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。另外，本實(shí)驗(yàn)中克隆的VirB4基因，與參考株基因的同源性很高，有4個(gè)突變位點(diǎn)，全部為有義突變，所以表達(dá)的蛋白也會(huì)和參考株不一樣，毒力是否受到了影響需進(jìn)行進(jìn)一步研究探討。

輔酶Q10在細(xì)胞內(nèi)與線粒體內(nèi)膜結(jié)合，參與細(xì)胞氧化磷酸化及ATP生成過程，是呼吸鏈中重要的遞氫體[14-15]，是細(xì)胞自身產(chǎn)生的天然抗氧化劑和細(xì)胞代謝的激活劑，能夠提高有機(jī)體的免疫力。Folkers K[16]報(bào)道了老鼠服用了輔酶Q10能提高機(jī)體免疫細(xì)胞殺死細(xì)菌的活力，激發(fā)免疫球蛋白和抗體數(shù)量。本研究證實(shí)布魯氏菌侵染宿主細(xì)胞后引起VirB4互作的靶蛋白輔酶Q10的表達(dá)量具有明顯升高，這可能是布魯氏菌侵染宿主細(xì)胞后的應(yīng)激反應(yīng)，促使輔酶Q10表達(dá)量提升，表明其在布魯氏菌引發(fā)的致炎過程中起重要作用。SLC3A2是一個(gè)II型跨膜蛋白，具有催化鈣：鈉逆向運(yùn)輸?shù)鞍椎墓δ?；與糖代謝、鈣離子運(yùn)輸、氨基酸運(yùn)輸、細(xì)胞生長相關(guān)[17]。Ca2+達(dá)到一定濃度后,啟動(dòng)一系列病理生理機(jī)制損傷神經(jīng)細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、甚至死亡，而SLC3A2催化Na+-Ca2+逆向運(yùn)輸?shù)鞍譡18]。本研究也證實(shí)了布魯氏菌侵染引起SLC3A2表達(dá)量升高，這可能在布魯氏菌侵染過程中抑制細(xì)胞凋亡具有重要的意義。輔酶Q10和SLC3A2與VirB4特異結(jié)合的蛋白的表達(dá)量升高說明了其在布魯氏菌侵染滋養(yǎng)層細(xì)胞的過程中發(fā)揮作用，但具體生物學(xué)功能需進(jìn)行更深入的研究。

本研究成功構(gòu)建牛種布魯氏菌疫苗株RB51侵染牛胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞cDNA文庫；篩選出布魯氏菌疫苗株RB51的VirB4蛋白在侵染牛胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞過程作用的13種蛋白，并通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測了特異結(jié)合蛋白輔酶Q10和SLC3A2的表達(dá)量在布魯氏菌侵染后都增加了；試驗(yàn)中對(duì)VirB4蛋白與宿主細(xì)胞的互作研究為進(jìn)一步闡明布魯氏菌感染宿主細(xì)胞的發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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