張志勤，趙穎潔，夏燕華，王 靜，項國仕，鄒葉青，黃孝天

柯薩奇病毒屬于小RNA 病毒科腸道病毒屬，它主要經(jīng)糞-口途徑傳播，可引起包括心肌炎、脊髓炎、胰腺炎、手足口病等一系列疾病，甚至能引起新生兒的死亡[1-2]。1995年CVB3晶體結構解析顯示，CVB3為無包膜的二十面體對稱結構，VP1、VP2、VP3和VP4組成病毒衣殼，其中，VP1、VP2和VP3在病毒表面形成獨特的峽谷樣結構，這是病毒感染宿主細胞時與相應受體(如CAR)結合的位點。而VP3是CVB3重要的結構蛋白，具有高度的保守性和十分重要的功能，不僅對維持病毒的完整形態(tài)有重要作用,而且與病毒對心臟的親和力密切相關[3]。目前對CVB3相關的研究主要集中于流行病學分析[2,4]、疫苗研究[5-7]及細胞表面受體研究[8-10]，而CVB3是如何導致細胞凋亡及持續(xù)性感染的機制尚未明確。本研究利用酵母雙雜交篩選與病毒結構蛋白VP3相互作用的人心臟蛋白，為進一步研究VP3在CVB3致病中所發(fā)揮的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1質粒和菌株 DH5α由本室保存，釀酒酵母菌株AH109、pCL1、pGBKT7-Lam、pGBKT7-53、pTD1-1，預轉化的人心臟cDNA文庫、Y187、pGBKT7質粒、均購于Clontech公司。

1.2主要試劑 HiFi DNA polymerase(TransGen，北京)，限制性內切酶EcoR I和BamH I(TAKARA)、缺陷培養(yǎng)基試劑、酸化玻璃微珠購于Sigma公司，X-α-gal、鮭精DNA購于Clontech公司。

1.3誘餌質粒pGBKT7-VP3的構建 根據(jù)GenBank中柯薩奇B3病毒VP3基因cDNA序列(GI：323432)利用Primer 5.0設計一對包含EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點的引物：

F：5′CGGAATTCgagtacaatgggttacgttt3′

R：5′CGGGATCCtggaaaaagttttgctg3′

擴增片段為CVB3基因組中1 698～2 459 bp，包含VP3全長序列，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。以病毒感染細胞逆轉錄cDNA為模板，PCR擴增VP3基因，將pGBKT7載體和PCR產物片段用EcoRⅠ和BamHⅠ進行雙酶切，然后用T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜，轉化至感受態(tài)細胞(DH5α)中，提取質粒后酶切鑒定，并對所得質粒進行DNA測序分析。

1.4BD-c-Myc-VP3融合蛋白表達檢測 將AH109 [pGBKT7-VP3]菌落及陰性對照菌AH109[pGBKT7]菌落分別接種于SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 250 r/min振蕩培養(yǎng)20 h，提取酵母蛋白，通過Western blot驗證BD-c-Myc-VP3融合蛋白的表達。

1.5人心臟cDNA文庫含量滴定 具體操作見文獻[11-12]。

1.6酵母雙雜交 將新鮮的AH109[pGBKT7-VP3]誘餌菌30 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，直至培養(yǎng)液中細胞濃度大于1.15×107cell/mL。按照Yeast protocols handbook(Clontech ，PT3024-1)中說明將誘餌菌AH109[pGBKT7-VP3]與人心臟cDNA文庫菌Y187[pGADT7-cDNA Library]配合。

1.7陽性候選克隆初步分析

1.7.1陽性候選克隆歸類與DNA序列分析 酚氯仿異戊醇法抽提陽性酵母菌中的質粒。以抽提的質粒DNA為模板，用pGADT7載體引物擴增cDNA中插入片段，并用AluI酶切PCR產物，根據(jù)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切帶型并對陽性候選克隆進行歸類，去掉重復的陽性候選克隆。將歸類后的陽性候選克隆抽提pGADT7-ADx質粒，再電擊轉化至感受態(tài)細胞(DH5α)中，采用pGADT7載體通用引物對上述菌液進行測序。使用NCBI網(wǎng)站的BLAST程序對測序結果的同源性進行分析。

1.7.2陽性候選克隆自激活檢測 乙酸鋰法將上述鑒定后的pGADT7-ADx轉入AH109感受態(tài)中，然后將候選克隆AH109[pGADT7-AD]、對照菌AH109[pGADT7](陰性對照)和AH109[pCL1](陽性對照)菌落接種至同一塊SD/-Leu/X-α-Gal平板，30 ℃倒置培養(yǎng)1 d，觀察菌落有無及顏色變化。

1.7.3回返配合 將篩選后的AD16、AD29、AD32、AD33、AD34、AD35、AD36、AD37、AD65、AD67文庫質粒從Y187[pGADT7-AD]中抽提出來電擊轉化入AH109，再與Y187[pGBKT7-VP3]進行小規(guī)模配合試驗，實驗分組：①AH109[pGADT7-AD]×Y187[pGBKT7-VP3]，②AH109[pGBKT7]×Y187[pGADT7](陰性對照)③AH109[pGBKT7-53]×Y187[pTD1-1](陽性對照)。將回返配合中①組和③組生長的酵母克隆轉種至SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal平板上；將回返配合中②組鋪于SD/-Trp/-Leu平板上培養(yǎng)3 d，再轉種至SD/-Trp/-Leu/ X-α-Gal平板上(陰性對照)將以上轉種后的菌培養(yǎng)1 d，觀察菌落顏色變化。

1.8α-半乳糖苷酶活性定量分析 每種酵母雙雜交陽性克隆均分二組配合后進行α-半乳糖苷酶定量分析:實驗組和陰性對照組AH109[pGBKT7-VP3]×Y187[pGADT7-AD]和對照AH109[pGBKT7]×Y187[pGADT7-AD]另外，設立陽性對照組AH109[pGBKT7-53]×Y187[pTD1-1]，每組設立6個復孔，獨立實驗重復3次，OD410及OD600值均取3次實驗均值。根據(jù)Lambert-Beer 定律,A=ε×b×c,制作標準曲線,求ε×b值,則ε×b 等于PNP在410 nm波長時的摩爾吸光度對濃度的標準曲線的斜率。α-半乳糖苷酶活性計算公式：α-半乳糖苷酶活性[milliunits/(mL(cell)]=OD410(Vf(1000/[(ε(b)(t(Vi(OD600]，其中，t=60 min，Vf=總體積200 μL，Vi=培養(yǎng)上清體積16 μL，OD600=菌懸液光密度值。

2 結 果

2.1pGBKT7-VP3質粒構建 PCR擴增VP3基因,對目的片段和pGBKT7同時EcoRI及BamHI酶切，經(jīng)連接轉化，挑取菌擴增后，再經(jīng)抽取質粒經(jīng)雙酶切鑒定，片段大小762 bp相符(圖1)。測序結果顯示，堿基序列未發(fā)生突變，閱讀框與載體匹配，表明質粒構建成功。

2.2BD-cMyc-VP3融合蛋白表達檢測 將提取的相應酵母蛋白通過Western Blot檢測蛋白的表達，利用c-Myc抗體檢測BD-cMyc-VP3融合蛋白，在45 kDa處可以檢測到特異性條帶，表明含誘餌質粒的酵母菌成功表達融合蛋白(圖2)。

2.3人心臟cDNA文庫含量滴定 經(jīng)滴定，人心臟cDNA文庫菌Y187 菌落數(shù)為4.3×107cfu/ mL>1×106cfu/mL。據(jù)(clontech PT3247-1)中說明文庫中獨立的克隆數(shù)至少需要1×106cfu/mL才可有效篩出陽性克隆。

2.4陽性候選克隆歸類及分析

2.4.1陽性候選克隆AluI酶切初步歸類 從人心臟cDNA文庫中篩選與VP3相互作用的基因，共獲得陽性候選克隆50個。經(jīng)過陽性酵母菌傳代培養(yǎng)3次，無作用的pGADT7-AD質粒自然丟失。對酵母菌中pGADT7-AD質粒抽提，AluI酶切PCR產物對陽性克隆進行初步歸類，分類標準是根據(jù)AluI酶切PCR產物片段帶型，帶型相同則歸為一類，結果獲得了10種不同類別的克隆(圖3)。

2.4.2DNA序列測定和同源性分析 陽性候選克隆DNA測序由華大基因完成，將測序結果與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，共獲得10個不同類別的基因：EIF4A2、HADHB、GAPDH、ASPG、ACTA1、TNNI3、CKM、LMOD3、ERGIC1、ALDH2(Table 1)，分別表達相應的蛋白。

2.4.3回返配合 將篩選出來的10種陽性克隆中pGADT7-AD質粒提出，轉化至AH109，同時將pGBKT7-VP3轉化至Y187，進行回返配合試驗，10種克隆均顯示藍斑，進一步說明所篩選出來的蛋白與VP3存在相互作用(圖4) 。

2.5α-半乳糖苷酶定量分析 如圖5所見，10種陽性克隆的α-半乳糖苷酶定量分析表明：每種陽性克隆的兩組配合試驗菌中，AH109[pGBKT7-VP3]×Y187[pGADT7-ADx]的α-半乳糖苷酶活性均數(shù)和另一陰性對照組AH109[pGBKT7]×Y187[pGADT7-ADx]相比，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.01) ，同時也進一步證明了ADx與VP3均存在相互作用。

圖1重組質粒酶切分析

Fig.1RestrictionanalysisofrecombinantplasmidpGBKT7-VP3

M1: Trans 2K DNA marker (Transgen);

M2: Trans 8K DNA marker (Transgen);

2: PCR Product of VP3;

3: Recombinant plasmids pGBKT7 digested byEcoR I andBamH I;

4: Recombinant plasmids pGBKT7-VP3 digested byEcoRI andBamHI.

圖2DNA-BD-cMycVP3融合蛋白檢測

Fig.2DetectionoffusionproteinBD-cMycVP3

Negative control: AH109 extract.

圖3AluI酶切分類

Fig.3ClassificationbyAluIdigested

M: Trans 5K DNA marker (Transgen).

圖4陽性候選克隆與CVB3VP3回返配合

Fig.4CandidatepositiveclonesinteractingwithCVB3VP3byre-hybrid

A: Experimental group colonies were significantly blue and positive control group colonies were light blue;

B: Negative control group was not displayed in blue.

1: AH109[pGADT7-AD16] ×Y187[pGBKT7-VP3];

2: AH109[pGADT7-AD29] ×Y187[pGBKT7-VP3];

3: AH109[pGADT7-AD32]×Y187[pGBKT7-VP3];

4: AH109[pGADT7-AD33]×Y187[pGBKT7-VP3];

5: AH109[pGADT7-AD34]×Y187[pGBKT7-VP3];

6: AH109[pGADT7-AD35]×Y187[pGBKT7-VP3];

7: AH109[pGADT7-AD36]×Y187[pGBKT7-VP3];

8: AH109[pGADT7-AD37]×Y187[pGBKT7-VP3];

9: AH109[pGADT7-AD65]×Y187[pGBKT7-VP3];

10: AH109[pGADT7-AD67]×Y187[pGBKT7-VP3];

+: AH109[pGBKT7-53]× Y187[pTD1-1] (positive control).

圖5 10種陽性克隆的α-半乳糖苷酶定量分析

3 討 論

隨著酵母雙雜交技術的普及，利用其研究蛋白與蛋白之間相互作用的報道也越來越多，Henke A等利用酵母雙雜交篩選出與CVB3 VP2相互作用作用的前凋亡蛋白Siva后，Ulrike Martin等具體研究了CVB3 VP2是如何與siva作用從而導致細胞凋亡[13-14]。而關于CVB3 VP3蛋白相互作用的文獻未見報道，本研究成功構建pGBKT7-VP3誘餌重組質粒，并證明了誘餌蛋白VP3對報告基因無激活作用且能夠在酵母菌AH109中表達。經(jīng)酵母雙雜交大規(guī)模配合實驗，從人心臟cDNA文庫中篩選到10個與CVB3 VP3相互作用蛋白：真核翻譯起始因子4A2(EIF4A2)、羥酰輔酶A脫氫酶三官能蛋白轉錄變體3(HADHB)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、門冬酰胺酶同系物(ASPG)、肌鈣蛋白I3型(TNNI3)、骨骼肌α1肌動蛋白(ACTA1)、肌肉型肌酸激酶(CKM)、平滑肌蛋白3(LMOD3)、線粒體乙醛脫氫酶2(ALDH2)、內質網(wǎng)-高爾基體中間室蛋白1(ERGIC1)。

EIF4A2作為一個高度保守的蛋白質合成的起始因子，與真核翻譯起始因子4A1， EIF4A1)形成真核翻譯起始因子4A(EIF4A)，EIF4A是一個RNA依賴的ATP酶/解旋酶，屬于DEA(D/H)box蛋白超家族，參與mRNA結合到核糖體,同時也參與哺乳動物肌肉發(fā)育過程中的翻譯調控[15-16]，有報道[17]稱，在口蹄疫病毒感染的細胞中檢測到EIF4A被病毒3C蛋白酶剪切，而這一現(xiàn)象對病毒來說是不利的，因為病毒的翻譯也需要EIF4A，但他們觀察到的僅僅是病毒3C蛋白酶剪切了一部分的EIF4A，可能對細胞整體的翻譯機制影響不大。而CVB3感染細胞后如何與EIF4A或者其亞類EIF4A2作用的，是促進其病毒翻譯還是抑制了病毒翻譯還有待進一步的研究。

HADHB是線粒體三功能蛋白酶復合體的組成部分, 它與線粒體三功能蛋白酶復合體的另一個亞基HADHA 共同參與脂肪酸的氧化,催化線粒體β-氧化的長鏈脂肪酸的最后三個步驟，HADHB的缺陷，可進一步引起急性心衰[18-20]，這可能與少數(shù)病毒性心肌炎的患者進展為心衰存在一定的聯(lián)系。

TNNI3屬于肌鈣蛋白家族，肌鈣蛋白在肌肉伸縮裝置中的細肌絲上與肌動蛋白和原肌球蛋白形成復合體，參與橫紋肌功能，通過抑制肌球蛋白ATP酶活化[21]，從而抑制收縮。TNNI3在心肌細胞中特異表達，僅8%游離于細胞漿，在新生兒出生時表達上調，由于心臟收縮機制的重要性及TNNI3涉及心臟疾病，且其作為心臟主要的磷酸化蛋白，作用已被廣泛研究，在臨床上也被作為病毒性心肌炎診斷指標[22],同時也與家族性擴張型心肌病密切相關，具體為TNNI3基因的錯義突變使得最大ATP酶效率降低，并且抑制Ca2+親和性，從而引起擴張型心肌病的發(fā)生[23]。在CVB3感染引起的擴張型心肌病的過程中，會引起心肌細胞內Ca2 +改變從而引起細胞凋亡的發(fā)生[24]，那么，CVB3與TNNI3的相互作用是否使心肌炎進展呢？

表1 與CVB3 VP3相互作用的酵母雙雜交陽性候選克隆分類

平滑肌蛋白3(LMOD3)屬于LMOD，后者起到成核蛋白的作用，在心肌細胞中觸發(fā)肌絲的形成。LMOD也能指導肌絲形成肌節(jié)，肌節(jié)在心臟中控制心肌的收縮。David Chereau等用RNAi技術來敲除心肌細胞LMOD之后，將導致心肌無法收縮[25-26]，這表明LMOD可能參與心肌疾病的進程。

線粒體乙醛脫氫酶2(ALDH2)是存在于線粒體內的一種氧化乙醛的酶，能有效地應對內質網(wǎng)應激誘導的心肌超微結構、收縮及細胞內Ca2 +的異常改變，同時也能緩解細胞凋亡和自噬誘導[27]，而CVB3感染心肌細胞后會觸發(fā)鈣蛋白酶激活阻礙細胞的凋亡和自噬，從而促進子代病毒的復制[28]，這與ALDH2心肌保護的作用相同，CVB3是否通過ALDH2來作用于心肌細胞還有待考證。我們篩出的10個蛋白中有與心臟疾病的發(fā)生或發(fā)展有關，同時也有心肌保護蛋白，而在CVB3介導的心臟疾病過程中，這些蛋白到底承擔著什么樣的角色及具體的機制還未明確 ，這些蛋白的篩出給了我們進一步研究CVB3所致心肌炎機制一些提示，拓寬了我們的研究思路。

綜上所述，本研究成功構建誘餌質粒pGBKT7-VP3,并從人心臟cDNA文庫中獲得的與CVB3 VP3相互作用的10個蛋白：EIF4A2、HADHB、GAPDH、ASPG、TNNI3、ACTA1、CKM、LMOD3、ALDH2、ERGIC1，并初步驗證了他們與VP3的相互作用。此研究結果對于進一步深入研究CVB3 VP3功能具有重要的理論和指導意義，同時這也將為研究CVB3引起心肌炎和心肌疾病的分子致病機制提供了一些的新線索，但酵母雙雜交可能出現(xiàn)假陽性，我們將使用免疫共沉淀及激光共聚焦等方法進行進一步確證CVB3 VP3與這些蛋白的相互作用。

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