黃經(jīng)緯,鄭予桐，李家璜,華子春

血吸蟲病是一種分布廣泛，危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病，該病在全球74個國家呈地方性流行，每年約有2億人受到感染。寄生人體的血吸蟲主要有5種：日本血吸蟲(Schistosomajaponicum)、曼氏血吸蟲(Schistosomamansoni)、埃及血吸蟲(Schistosomahaematobium)、間插血吸蟲(Schistosomaintercalatum)和湄公血吸蟲(Schistosomamekongi)。其中日本血吸蟲、曼氏血吸蟲和埃及血吸蟲是人體主要的寄生蟲。我國是日本血吸蟲病的主要流行區(qū)之一, 每年受感染的人數(shù)接近3千萬[1-2]。迄今為止，化學(xué)藥物治療仍然是血吸蟲病最有效的治療方法。對血吸蟲最有效的化學(xué)藥物是吡喹酮 (praziquantel)，它于20世紀(jì)70年代后期發(fā)現(xiàn)的，是5種人體血吸蟲病唯一的治療藥物。但是隨著吡喹酮的廣泛使用，曼氏血吸蟲和埃及血吸蟲對吡喹酮的敏感性有所下降, 亦有研究表明，吡喹酮對日本血吸蟲的療效也發(fā)生了變化。因此，開發(fā)新的血吸蟲病治療藥物十分緊迫[3-5]。

硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶(thioredoxin glutathione reductase, TGR)是血吸蟲生理代謝過程中關(guān)鍵的酶，在血吸蟲體內(nèi)氧化還原平衡中發(fā)揮重要作用[6]。血吸蟲通常寄生在宿主循環(huán)系統(tǒng)，在這種富含氧的環(huán)境下，易受宿主體內(nèi)活性氧的進(jìn)攻。為了對抗活性氧的氧化損傷，大部分動物體內(nèi)有兩套氧化還原系統(tǒng)——硫氧還蛋白系統(tǒng)和谷胱甘肽系統(tǒng)，將氧化型的硫氧還蛋白和谷胱甘肽還原為還原形式，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)的傷害性氧化的修復(fù)。哺乳動物中行使這一功能的酶為硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase, TrxR)和谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GR)，但是血吸蟲體內(nèi)并沒有單獨(dú)的TrxR或GR[7]，而是被一種多功能酶所替代，這種酶兼具TrxR和GR的雙重活性，被稱為硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，針對血吸蟲TGR的RNAi實(shí)驗(yàn)可以使曼氏血吸蟲死亡[8]；亦有實(shí)驗(yàn)表明，抑制該酶的活性可以導(dǎo)致日本血吸蟲死亡，但對宿主的不良反應(yīng)較小[9]。這些事實(shí)都說明該TGR是血吸蟲病治療新藥開發(fā)的潛在靶分子。

目前曼氏血吸蟲TGR(SmTGR)的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到測定[10-11]，該結(jié)構(gòu)的解析對了解TGR結(jié)構(gòu)與功能，進(jìn)而篩選或設(shè)計(jì)有效的抗曼氏血吸蟲藥物具有重要的價(jià)值。

日本血吸蟲TGR (SjTGR) 結(jié)構(gòu)至今還未被解析，本文以SmTGR為模板，對日本血吸蟲SjTGR進(jìn)行同源建模，分析其結(jié)構(gòu)與功能，為進(jìn)一步研究設(shè)計(jì)抗日本血吸蟲藥物奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1日本血吸蟲同源建模 以SjTGR(Swiss-Prot：B5THG7)為查詢序列，通過Swiss-Pdbviewer 4.10軟件[12]的子程序Blast對三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PDB(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)進(jìn)行同源搜索，選取分?jǐn)?shù)高(Score=1045)、E值為0、且分辨率為1.9埃的smTGR的晶體結(jié)構(gòu) (Swiss-Prot序列：Q962Y6，結(jié)構(gòu)PDB ID: 2X8H[10]) 作為建模的模板。

整個單體蛋白的前期比對在Swiss-Pdbviewer中進(jìn)行，比對結(jié)果遞交到Swiss-Model在線服務(wù)器的工程模塊(Project mode)進(jìn)行同源建模，對于Swiss-Model給出的SjTGR結(jié)構(gòu)，再用Swiss-Pdbviewer對其側(cè)鏈進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，并進(jìn)行全局能量最小化計(jì)算，得到SjTGR亞基的結(jié)構(gòu)模型，最后我們采用PISA(http://www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/pistart.html)[13]，將該單亞基裝配成為二聚體形式——即SjTGR的天然結(jié)構(gòu)形式。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析和圖形顯示采自于Discovery studio View 3.5圖形可視軟件(Accelrys Software Inc. USA )。

1.2TGR結(jié)構(gòu)評估與分析 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的評估采用在線的軟件PROCHECK(http：//www.ebi.ac.uc/thrnton-srv/databases/pdbsum/Generate.html)。

1.3序列比對 多序列比對采用軟件Genedoc(http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/)。

2 結(jié)果與討論

2.1結(jié)構(gòu)模型與評估 因?yàn)槿毡狙xTGR(SjTGR)與曼氏血吸蟲TGR (SmTGR)蛋白序列相似性為90% (圖1A)，所以SmTGR是SjTGR可靠的結(jié)構(gòu)模板。我們以SmTGR(PDB ID：2X8H，分辨率1.9埃)作為模板，得到了SjTRG的結(jié)構(gòu)模型(圖1B)。TGR亞基結(jié)構(gòu)比較表明SmTGR與SjTGR骨架原子間的RMSD為0.31(圖1C)。用PROCHECK檢測模型的立體化學(xué)合理性，圖2顯示了日本血吸蟲TGR二聚體的ramachandran圖，除去112個Gly和44個Pro外，有879個氨基酸(85.3%)在主要允許區(qū)，143個氨基酸(13.9%)在額外允許區(qū)，所有二面角的估測值G因子值都在-0.5之上，該結(jié)果表明了我們構(gòu)建的蛋白質(zhì)SjTGR結(jié)構(gòu)的可靠性。

2.2SjTGR重要的活性位點(diǎn) 與曼氏血吸蟲smTGR相同，日本血吸蟲SjTGR同樣具有NADPH和FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域，吡啶核苷酸二硫化物氧化活性中心(-CVNVGC-)，在N-端有Grx活位基序(-CPFC-)[11,14-15]。現(xiàn)有的研究認(rèn)為，NADPH作為電子供體起始了TGR的氧化還原電子通路；FAD接受來自NADPH的電子，然后進(jìn)一步將電子傳遞給以C154-C159為中心的活性口袋而完成電子的初步流動。參考SmTGR-配體復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)中(PDB ID：2X99)NADPH的結(jié)合模式，我們也將NADPH接入SjTGR中，SjTGR中參與NADPH結(jié)合的氨基酸殘基包括：Lys162、 Gly293-Val297、Lys300、Arg317、Ser318、Arg322、Ala390-Arg393、Gln440、 Leu441、Thr472和Phe474(圖3A)，這些氨基酸在不同來源的TGR蛋白中(日本血吸蟲(Swiss-Prot序列：B5THG7)、曼氏血吸蟲(Q963Y6)、肝吸蟲(A8E0R8)、細(xì)粒棘球絳蟲(Q869D6)、鼠(Q99MD6)和人(Q86VQ6))極為保守(圖3B，紅框標(biāo)記)，預(yù)示與該位點(diǎn)結(jié)合的抑制劑有可能抑制多種TGR蛋白。

圖1SjTGR結(jié)構(gòu)模型

Fig.1HomologystructureofSjTGR

A: Sequence alignment betweenSjTGR and smTGR proteins; B: Homodimer structure model ofSjTGR;

C: Subunit structure alignment betweenSjTGR (violet) and the templateSmTGR (blue)

圖2SjTRG結(jié)構(gòu)評估ramachandran圖

Fig.2RamachandranplotofSjTGRmodelbyPROCHECK

我們同時分析了谷胱甘肽(GSH)的結(jié)合位點(diǎn)，以smTGR-GSH復(fù)合物結(jié)構(gòu)(PDB ID：2X8H)為參考，我們將GSH放入SjTGR的Grx結(jié)構(gòu)域 (圖3A)，SjTGR上與結(jié)合GSH的氨基酸殘基主要有：Lys25、Cys28和Phe30(屬于Grx活位基序-CPFC-)、Thr71、Val72、Pro73、Asp84、Ser85和Lys86，這些殘基在血吸蟲和肝吸蟲TGR中極為保守，但哺乳動物TGR在Phe30和Asp84-Ser85-Lys86位點(diǎn)上有較大的差異，分別被His和Gly-Cys-Asp所取代(圖3B，藍(lán)框標(biāo)記)，這暗示著以Grx結(jié)構(gòu)域的GSH結(jié)合位點(diǎn)作為藥物靶點(diǎn)，有助于設(shè)計(jì)寄生蟲特異性的抑制劑。

圖 3 SjTGR底物結(jié)合的位點(diǎn)

TGR蛋白同時具有GR和TrxR活性，我們分析了GR的底物——氧化型GSH(GDS/GSSG)的結(jié)合位點(diǎn)。盡管血吸蟲的TGR的GDS復(fù)合物沒有解析，人類的GR蛋白-GDS復(fù)合物結(jié)構(gòu)(PDB ID：1GRA)已經(jīng)得到測定，參考該蛋白的GDS結(jié)合區(qū)域特性，我們將GDS放入SjTGR蛋白的GR的活性口袋，并進(jìn)行能量優(yōu)化。GDS的結(jié)合位點(diǎn)位于SjTGR二聚體的界面附近，同時與兩個亞基相互作用，SjTGR中參與GDS底物結(jié)合的殘基主要有第一個亞基上的Ser117、Ala121、Lys124、Val55、Leu208、Tyr212、Ile446和Arg450，以及另一個亞基上的Lys506、Leu508、His571-Thr573，以及Val593 (圖3A)。序列比較表明，GDS結(jié)合位點(diǎn)有著高度保守性(圖3B，紫紅框標(biāo)記)，而Ala121和Val593在寄生蟲TGR都為Ala和Val，但是在人或鼠中分別為Ser和Gln，這有可能作為寄生蟲TGR的GDS抑制劑特異性的篩選位點(diǎn)。

2.3SjTGR C末端的重要作用SjTGR在C-末端也具有Sec(硒代半胱氨酸)[16]。雖然PDB ID為2X8C的SmTGR擁有完整的C末端氨基酸，但其分辨率只為3.1埃，結(jié)構(gòu)可靠性較差，因此本文選擇PDB ID為2X8H(分辨率1.9埃，缺少了Tyr594之后的氨基酸殘基)的SmTGR結(jié)構(gòu)為模板，以確保構(gòu)建出的SjTGR構(gòu)象更加可靠。但C-末端對TGR的生物學(xué)功能極為重要，已經(jīng)有學(xué)者對TRG的含Sec的C末端的作用進(jìn)行了研究。 Angelucci 與Sharma等發(fā)現(xiàn)，除了TrxR的活性喪失外，截去C-末端的smTGR僅擁有約0.8%的GR活性和40%的Grx活性[7, 11]，表明C-末端的存在是TGR高效地行使功能的重要保證。Prast-Nielsen 等報(bào)道Sec597的SmTGR突變體也能快速被金諾芬抑制，但他們認(rèn)為Sec可能不是抑制劑的結(jié)合位點(diǎn)，Sec的存在僅僅加速該抑制過程[15]。在生理pH情況下，硒原子親核性比硫原子強(qiáng)。所以Sec的存在可以使得含硒蛋白與底物速率更快，并且在與底物反應(yīng)后，生成物可以高效地接收來自其他激活的Cys對的電子。除了電子對接受與釋放，C末端可能還具備電子轉(zhuǎn)移的功能。Angelucci等認(rèn)為C末端可擺動到Grx結(jié)構(gòu)域，與GSH相互作用的Cys發(fā)生電子傳遞[10]。我們的分析顯示Val593能與GDS的形成相互作用(圖3A)，推測C-末端的氨基酸也可能參與GDS在GR酶活性位點(diǎn)的結(jié)合作用，這可部分解釋為何截去C-末端，TGR的GR活性會受到重要影響。序列比對表明不同的TGR的C-末端具有一定特異性(圖3B)，因此針對SjTGR的C-末端設(shè)計(jì)抑制劑，限制C-末端的柔性和擺動，將有可能特異性地抑制SjTGR內(nèi)的電子傳遞，從而影響日本血吸蟲體內(nèi)的氧化還原平衡。

3 結(jié) 論

本文以SmTGR為模板構(gòu)建了日本血吸蟲SjTGR的同源結(jié)構(gòu)，PROCHECK的分析表明所構(gòu)建的模型具有較高可靠度。通過結(jié)構(gòu)和序列的比較，分析了SjTGR的NADPH、GSH以及GDS的結(jié)合位點(diǎn)。比較這些位點(diǎn)在不同血吸蟲間的差異，表明TGR中NADPH與GDS的結(jié)合位點(diǎn)極為保守，因此其他來源TGR的NADPH或GDS的競爭抑制劑可能對日本血吸蟲也會有抑制作用。而TGR的GSH的結(jié)合位點(diǎn)有著相對明顯的寄生蟲特異性，表明這個位點(diǎn)有可能作為寄生蟲TGR藥物的特異性結(jié)合位點(diǎn)。TGR的C末端氨基酸鏈對血吸蟲TGR電子傳遞起著重要作用，因而阻斷C末端擺動的抑制劑將可能有效地抑制TGR活性。

參考文獻(xiàn)：

[1]Shadan S. Drug discovery: schistosome treatment[J]. Nature, 2008, 452(7185): 296. DOI: 10.1038/452296b

[2]Lin DD, Wu XH, Jiang QW, et al. Strategic emphasis for research development of schistosomiasis control in China[J]. Chin J Schist Ctrl, 2009, 21(1): 1-5. (in Chinese)

林丹丹，吳曉華，姜慶五,等. 我國血吸蟲防治研究的戰(zhàn)略重點(diǎn)思考 [J]. 中國血吸蟲病防治雜志, 2009, 21(1): 1-5

[3]Xiao SH. Progress in development of new antischistosomal drugs in recent years[J]. Chin J Parasitol Parasit Dis, 2010, 28(3): 218-225. (in Chinese)

肖樹華. 近年來發(fā)展抗血吸蟲新藥的進(jìn)展 [J]. 中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志. 2010, 28(3): 218-225

[4]Melman SD, Steinauer ML, Cunningham C, et al. Reduced susceptibility to praziquantel among naturally occurring Kenyan isolates ofSchistosomamonsoni[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2009, 3(8): e504. DOI: 10.1371/journal.pntd.0000504

[5]Wang W, Dai JR, Li HJ, et al．Is there reduced susceptibility to prsziquantel inSchistosomajaponicumevidence from China[J]. Parssitology, 2010, 137(13): 1905-1912. DOI: 10.1017/S0031182010001204

[6]Huang HH, Day L, Cass CL, et al. Investigations of the catalytic mechanism of thioredoxin glutathione reductase fromSchistosomamansoni[J]. Biochemistry, 2011, 50(26): 5870-5882. DOI: 10.1021/bi200107n

[7]Sharma M, Khanna S, Bulusu G, et al. Comparative modeling of thioredoxin glutathione reductase fromSchistosomamansoni: A multifunctional target for antischistosomal therapy[J]. J Mol Graphics Modeling, 2009, 27(6): 665-675. DOI: 10.1016/j.jmgm.2008.10.009

[8]Kuntz AN, Davioud-Charvet E, Sayed AA, et al. Thioredoxin glutathione reductase fromSchistosomamansoni: an essential parasite enzyme and a key drug target[J]. PLoS Med, 2007, 4(6): e206. DOI: 10.1371/journal.pmed.0040206

[9]Song LJ, Li JH, Xie SY, et al. Thioredoxin glutathione reductase as a novel drug target: evidence fromSchistosomajaponicum[J]. PLoS One, 2012, 7(2): 1-11. DOI: 10.1371/journal.pone.0031456

[10]Angelucci F, Dimastrogiovanni D, Boumis G, et al. Mapping the catalytic cycle ofSchistosomamansonithioredoxin glutathione reductase by X-ray crystallography[J]. J Biol Chem, 2010, 285(42): 32557-32567. DOI: 10.1074/jbc.M110.141960

[11]Angelucci F, Miele AE, Boumis G, et al. Glutathione reductase and thioredoxin reductase at the crossroad: The structure ofSchistosomamansonithioredoxin glutathione reductase[J]. Proteins: Struct Funct Bioinform, 2008, 72(3): 936-945. DOI: 10.1002/prot.21986

[12]Guex N, Peitsch MC. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modeling[J]. Electrophoresis, 1997, 18: 2714-2723. DOI: 10.1002/elps.1150181505

[13]Krissinel E, Henrick K. Inference of macromolecular assemblies from crystalline state[J]. J Mol Biol, 2007, 372: 774-797. DOI: 10.1016/j.jmb.2007.05.022

[14]Han Y, Zhang M, Hong Y, et al. Characterization of thioredoxin glutathione reductase inSchistosomajaponicum[J]. Parasitol Int, 2012, 61(3): 475-480. DOI: 10.1016/j.parint.2012.03.005

[15]Prast-Nielsen S, Huang HH, William DL. Thioredoxin glutathione reductase: Its role in redox biology and potential as a target for drugs against neglected diseases[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects, 2011, 1810(12): 1262-1271. DOI: 10.1016/j.bbagen.2011.06.024

[16]Song LJ, Yu CX, Xie SY, et al. Expression and characterization of thioredoxin glutathione reductase ofSchistosomajaponicum[J]. Chin J Schist Ctrl, 2011, 23(4): 412-418. (in Chinese)

宋麗君，余傳信，謝曙英,等.日本血吸蟲硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶的表達(dá)及特性分析[J]. 中國血吸蟲病防治雜志. 2011. 23 (4): 412-418.