李 輝，竇 爽，張 波，卜祥龍，鐘正偉，宋有濤

細(xì)胞內(nèi)正常的朊蛋白發(fā)生錯誤折疊后形成朊病毒，在人和其他哺乳動物體內(nèi)引起多種致死性的傳染性海綿狀腦病(TSE)，包括瘋牛病、羊瘙癢癥(Scrapic)、人庫魯病(kuru)和人克雅氏病(CJD)等。神經(jīng)元的廣泛丟失以及腦切片呈現(xiàn)海綿狀表型是這些疾病具有的共同特點(diǎn)[1]。朊病毒疾病因其高度傳染性和致死性對整個社會造成了極大的危害[2]。由于朊病毒的分子致病機(jī)理的復(fù)雜性，迄今為止對朊病毒引起的疾病仍缺乏有效的治療藥物[3]。近年來研究者在動物、細(xì)胞和分子水平建立了一系列藥物篩選模型來篩選治療朊病毒疾病的候選藥物，并研究發(fā)現(xiàn)了一些多糖類化合物、雜環(huán)化合物、抗生素類化合物和抗體等具有一定的抗朊病毒作用[4-5]。這些候選藥物一般是成分明確的化合物或者是朊病毒抗體，而關(guān)于傳統(tǒng)中藥的抗朊病毒作用研究卻鮮有報道。近年來研究顯示在綠茶和姜黃提取物中存在具有抗朊病毒活性的成分，而且一些中藥配方有治療與朊病毒發(fā)病機(jī)制相似的帕金森和阿爾茨海默癥的臨床效果，這些都積極的暗示著在中藥領(lǐng)域存在有抗朊病毒活性的物質(zhì)[6-7]。

由于動物朊病毒細(xì)胞模型不具備明顯的細(xì)胞表型，并且存在著與哺乳類動物內(nèi)朊病毒交叉?zhèn)魅镜奈ｋU性，使得實(shí)驗(yàn)成本昂貴、操作繁雜，嚴(yán)重限制了該領(lǐng)域的研究進(jìn)展。研究證實(shí)，釀酒酵母中存在大約19種與朊病毒具有相似性質(zhì)的蛋白類物質(zhì)。這些朊病毒能夠在體內(nèi)和體外形成一些類淀粉性的纖維，在結(jié)構(gòu)上與動物朊病毒的結(jié)構(gòu)存在較大的相似性，能夠發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變[8-11]。同時酵母朊病毒有易檢測的表型([PSI+]為白色，[psi-]為紅色)。因此本文利用實(shí)驗(yàn)室改良的ΔERG6酵母朊病毒[PSI+]細(xì)胞模型，選取對帕金森病有一定療效的菊科中藥白術(shù)作為研究材料。

本研究使用的酵母細(xì)胞是一種ADE1基因由于位點(diǎn)特異性突變?yōu)榉钦＝K止密碼子而導(dǎo)致腺嘌呤生物合成被阻斷的酵母細(xì)胞。一般情況下，酵母朊病毒[PSI+]是翻譯終止因子Sup35p的淀粉樣聚集形式。[PSI+]細(xì)胞中，Sup35p主要以聚集狀態(tài)出現(xiàn)，使得ADE1基因進(jìn)行正常翻譯，無義突變抑制ade2-1突變株產(chǎn)生終止密碼子通讀現(xiàn)象，合成腺嘌呤，使[PSI+]細(xì)胞在腺嘌呤缺乏的SD培養(yǎng)基上生長為白色菌落；[psi-]細(xì)胞中的Sup35p呈單體狀態(tài)，非無義抑制的ade2-1突變菌株需要在含有腺嘌呤的培養(yǎng)基上生長，細(xì)胞由于腺嘌呤代謝途徑副產(chǎn)物累積，在培養(yǎng)基上生長菌落呈紅色，不能在缺乏腺嘌呤的SD培養(yǎng)基上生長，這個顏色指示系統(tǒng)可以初步分析酵母朊病毒的存在狀態(tài)[12]?；陬伾卸貌《緺顟B(tài)的方法雖然直觀、準(zhǔn)確，仍然不能排除假陰性和假陽性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的出現(xiàn)。因此我們引入半變性瓊脂糖凝膠電泳(Semi Denaturing Deter gent Agarose Gel Electrophoresis，SDD-AGE)結(jié)合蛋白免疫技術(shù)在蛋白水平進(jìn)一步驗(yàn)證[13-14]。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂粉均購自上海奧博星生物科技有限公司；尿嘧啶、色氨酸、亮氨酸均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；腺嘌呤購自美國Solarbio公司；鹽酸胍(GuHCl)購自Sigma-Aldrich公司，ECL試劑購自碧云天生物有限公司。羊抗-Sup35抗體及驢抗羊二抗均購自上海西寶生物有限公司。

1.1.2菌株 釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae:MATαkar1SUQ5ade2-1his3Δ202leu2Δ1trp1Δ63ura3-52erg6::KanMX，[PSI+]。將[PSI+]細(xì)胞劃線于含有5 mmol/L鹽酸胍的1 /2YPD固體平板上培養(yǎng)5 d后，分離紅色單菌落得到[psi-]細(xì)胞。

1.1.3培養(yǎng)基 1/2YPD培養(yǎng)基：酵母浸粉0.5%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，固體平板加入2%瓊脂。YPAD培養(yǎng)基：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，腺嘌呤0.04%，固體平板加入2%瓊脂。SD固體培養(yǎng)基：0.7%YNB-AA，2%葡萄糖，2%的瓊脂粉(pH天然)。Ade：20 mg/L，Ura：20 mg/L，Trp：20 mg/L，Leu：60 mg/L。

1.1.4中藥 白術(shù)購于沈陽東北大藥房。

1.2方法

1.2.1白術(shù)水提物培養(yǎng)基的制備及酵母朊病毒[PSI+]遺傳表型實(shí)驗(yàn) 將白術(shù)烘干后粉碎。稱取10 g白術(shù)粉末，加入100 mL蒸餾水，95 ℃回流提取3 h，抽濾并回收濾液。用濾液配制1/2YPD液體培養(yǎng)基，滅菌后備用。[PSI+]酵母細(xì)胞在24 ℃過夜活化培養(yǎng)后，調(diào)整菌液光密度OD600為0.2左右，按10%接種量分別接種到含有白術(shù)水提物的1/2YPD液體培養(yǎng)體系，所有體系于24 ℃震蕩培養(yǎng)5 d，每間隔24 h更換含有白術(shù)水提物的1/2YPD培養(yǎng)基。分別在1、3、5 d后取培養(yǎng)液稀釋后涂布于1/ 2YPD 固體平板，平板于24 ℃ 培養(yǎng)7 d，觀察菌落顏色變化，照相并統(tǒng)計陽性菌落(紅色表型) 的比例。

1.2.2酵母菌落影印實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)挑取白術(shù)水提物治愈酵母朊病毒[PSI+]后的紅色單菌落，分別影印到Y(jié)PAD、SD-Ade和1/2YPD平板上。放置于24 ℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)5 d后對平板進(jìn)行記錄。

1.2.3半變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合蛋白免疫技術(shù) 隨機(jī)挑取白術(shù)水提物治愈酵母朊病毒[PSI+]后的紅色單菌落活化，然后接種到Y(jié)PD 液體培養(yǎng)基于30 ℃下培養(yǎng)約14～16 h ，測菌液OD600=1.5左右時停止培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，用珠磨儀裂解細(xì)胞，離心收集上清得到蛋白樣品；然后采用SDD-AGE/Western blotting，首先進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后在0 ℃、恒壓0.35A 條件下轉(zhuǎn)膜1 h，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，一抗孵育1 h，4 ℃過夜后洗膜，二抗孵育1 h，洗膜后，采用ECL 發(fā)光試劑盒對其進(jìn)行放射自顯影檢測，獲得圖像信息，記錄并保存。

2 結(jié) 果

2.1白術(shù)水提物對酵母朊病毒[PSI+]的治愈作用 在含有白術(shù)水提物的1/2YPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d，每間隔24 h更換含有白術(shù)水提物的1/2YPD培養(yǎng)基，涂板培養(yǎng)7 d后，可以明顯看出白術(shù)水提物對酵母朊病毒[PSI+]有一定的治愈效果，治愈率為6%。從表型上看，白術(shù)水提物作用后的紅色菌落初步被認(rèn)為是治愈的[psi-]，白色菌落為未治愈的[PSI+]。

圖1白術(shù)水提物對酵母朊病毒[PSI+]的治愈效果

Fig.1Effectsofaqueousextractsofrhizomaatractylodismacrocephalaeonyeast[PSI+]prion

Positive control of 5 mmol/L GuHCl cured [PSI+]cells; Negative control of [PSI+]cells.

圖2 重復(fù)實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計結(jié)果

2.2酵母菌落影印實(shí)驗(yàn)結(jié)果 挑取白術(shù)水提物作用酵母朊病毒[PSI+]5 d后出現(xiàn)的紅色單菌落分別影印到含有腺嘌呤的培養(yǎng)基YPAD和缺乏腺嘌呤的培養(yǎng)基SD，如圖所示，白色菌落和紅色的菌落在YPAD生長的菌落顏色均為白色；只有白色菌落能在SD-Ade培養(yǎng)基上生長，而紅色的菌落在SD-Ade培養(yǎng)基上基本不能生長，這是因?yàn)橹斡蟮腫psi-]細(xì)胞不能合成腺嘌呤。

2.3半變性凝膠電泳結(jié)合蛋白免疫技術(shù)結(jié)果 酵母朊病毒[PSI+]和[psi-]的細(xì)胞中Sup35p以不同的結(jié)構(gòu)狀態(tài)存在。經(jīng)過研究表明，在酵母朊病毒[PSI+]中Sup35p主要以聚集體形式存在，而在酵母朊病毒[psi-]中Sup35p以可溶性的單體形式存在。當(dāng)Sup35p蛋白聚集后，會對于SDS產(chǎn)生一定的抗性，不可溶解，進(jìn)而形成較大分子量的聚集體，反之，則為小分子量的單體。針對聚集體的分子量大小是反映酵母朊病毒[PSI+]聚集程度的重要指標(biāo)，因此SDD-AGE/Western Blot技術(shù)，可以在蛋白水平檢測細(xì)胞內(nèi)朊病毒聚集體分子量的大小，進(jìn)一步分析蛋白質(zhì)水平內(nèi)細(xì)胞內(nèi)的具體形態(tài)，彌補(bǔ)顏色系統(tǒng)所帶來的假陽性和假陰性的干擾，同時得出更加準(zhǔn)確的結(jié)果。

圖3影印培養(yǎng)法檢測白術(shù)水提物作用效果

Fig.3Evaluationofthecuringeffectsofrhizomaatractylodismacrocephalaebyreplicaplating

結(jié)果顯示，白術(shù)水提物作用酵母朊病毒[PSI+]后，細(xì)胞內(nèi)Sup35p蛋白出現(xiàn)了聚集體、單體。且聚集體大小比[psi-]細(xì)胞內(nèi)單體略大，但比[PSI+]細(xì)胞內(nèi)的大聚集體略小。經(jīng)過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，這種大小比[psi-]細(xì)胞內(nèi)單體略大，但比[PSI+]細(xì)胞內(nèi)的大聚集體略小的聚集體出現(xiàn)比例較高，由此可知，白術(shù)水提物對酵母朊病毒[PSI+]有一定的治愈作用。

圖4半變性凝膠電泳結(jié)合蛋白免疫技術(shù)檢測白術(shù)水提物作用效果

Fig.4EvaluationofthecuringeffectsofrhizomaatractylodismacrocephalaebySemiDenaturingDetergentAgaroseGelElectrophoresiscombinedwithwesternblot

3 結(jié) 論

白術(shù)是一種菊科多年生草本植物，以根莖入藥，有效成分有揮發(fā)性成分、內(nèi)酯類成分、糖苷、多糖類成分以及氨基酸等。本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建獨(dú)有的抗酵母朊病毒藥物篩選平臺，已篩選出具有抗朊病毒活性的兩面針、紅花、枳實(shí)、煙草等中藥。本文主要研究白術(shù)水提物對酵母朊病毒[PSI+]的治愈作用。結(jié)果表明，白術(shù)水提物對酵母朊病毒[PSI+]有一定的治愈作用，治愈率為6%。為了進(jìn)一步驗(yàn)證其治愈效果，采用影印培養(yǎng)法和半變性凝膠電泳結(jié)合蛋白免疫技術(shù)在細(xì)胞和蛋白水平研究白術(shù)水提物對酵母朊病毒的治愈作用，結(jié)果表明，白術(shù)水提物作用酵母朊病毒[PSI+]細(xì)胞5 d 后出現(xiàn)的紅色菌落中朊病毒的聚集狀態(tài)有一些與[psi-]相同，另一些聚集體大小比[psi-]細(xì)胞內(nèi)單體略大，但比[PSI+]細(xì)胞內(nèi)的大聚集體略小，且這種聚集體所占比例較高。由此可知，白術(shù)水提物對酵母朊病毒[PSI+]有一定的治愈作用，這表明在中藥領(lǐng)域存在著具有抗朊病毒活性的物質(zhì)存在，同時對于研究和開發(fā)中藥材抗哺乳動物朊病毒具有重要的意義。此外，本研究結(jié)果也顯示蛋白水平采用的SDD-AGE/ Western blotting 技術(shù)和細(xì)胞水平采用的影印培養(yǎng)法在定量研究抗朊病毒候選藥物的作用效果的重要性和可行性，豐富了Bach 等提出基于酵母細(xì)胞的抗朊病毒藥物篩選模型的次級篩選分析方法，同時也為研究白術(shù)對酵母朊病毒[PSI+]治愈作用有效成分的分離純化提供了科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Song YT, Wu XY, He XR. Development of the models for antiprion drug screening[J]. J Liaoning Univ, 2010, 37(4): 289-293. DOI: 10.3969/j.issn.1000-5846.2010.04.001 (in Chinese)

宋有濤,吳憲遠(yuǎn),何星蓉.抗朊病毒藥物篩選模型的研究進(jìn)展[J].遼寧大學(xué)學(xué)報,2010,37(4):289-293.DOI:10.3969/j.issn.1000-5846.2010.04.001

[2]Song YT, Song XZ. Bovine spongiform encephalopathy studies about Japan and east Asia[J]. Japan Studies, 2012, (2): 113-117. DOI: 10.3969/j.issn.1003-4048.2012.02.015 (in Chinese)

宋有濤,宋效中.日本及東亞地區(qū)瘋牛病問題研究[J].日本研究,2012, (2):113-117. DOI: 10.3969/j.issn.1003-4048.2012.02.015

[3]Yuan FZ, Yang LF, Zhang ZM, et al. Cellular Prion Protein (PrPC) of the neuron cell transformed to a PK-resistant protein under oxidative stress, comprising main mitochondrial damage in prion diseases[J]. J Mol Neurosci, 2013, 51(1): 219-224. DOI: 10.1007/s12031-013-0008-6

[4]Sim VL, Caughey B. Recent advances in prion chemotherapeutics[J]. Infect Disord Drug Targets, 2009, 9(1): 81-91. DOI: 10.2174/1871526510909010081

[5]Zhong ZW, Song YT. The research progress of prions treatment drug candidates[J]. Chin J Zoonoses, 2011, 27(9): 828-835. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2011.09.015 (in Chinese)

鐘正偉,宋有濤.朊病毒治療候選藥物的研究進(jìn)展[J].中國人獸共患病學(xué)報,2011,27 (9) :828-835.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2011.09.015

[6]He JS, Zhang Y, Hong T. Progress in the developmeng of therapeutic antibodies targeting Prion proteins and β-amyloid peptide[J]. Scientia Sinica Vitae, 2010, 40(8): 679-684. DOI: 10.1007/s11427.010.4043.z (in Chinese)

何金生,張瑩,洪濤.靶向PrP及Aβ的治療性抗體研究進(jìn)展[J]．中國科學(xué),2010, 40(8) :679-684.DOI:10.1007/s11427.010.4043.z

[7]Zhao JK,Wang DS. Progress of study on treatment of alzheimer’s disease with actibe ingredients of Chinese herbal medicines[J]. Chin J Integrated Traditional Western Med, 2008, 28(1): 177-182. DOI: 10.332/j.issn:1003-5370.2008.02.026 (in Chinese)

趙敬堃,王德生．中藥與中藥有效成分治療阿爾茨海默病的研究進(jìn)展[J]．中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2008,28(1):177-182.DOI:10.332/j.issn:1003-5370.2008.02.026

[8]Bach S, Talarek N, Andrieu T, et al. Isolation of drugs active against mammalian prions using a yeast-based screening assay[J]. Nat Biotechnol, 2003, 21(9): 1075-1081. DOI: 10.1038/nbt855

[9]Tribouillard-Tanvier D, Beringue V, Desban N, et al. Antihypertensive drug guanabenz is activeinvivoagainst both yeast and mammalian prions[J]. PLoS One, 2008, 3(4): 1981. DOI: 10.1371/journal.pone.0001981

[10]Liu SJ, Li J, Chen FC, et al. Studies on the antimicrobial activities of aqueous from Inula cappa DCinvitro[J]. Lishizhen Med Materia Medica Res, 2009, 20(12): 3072-3074. DOI: 10.3969/j.issn.1008-0805.2009.12.082 (in Chinese)

劉勝貴,李軍,陳富成,等.羊耳菊水提取物體外抑菌活性研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2009,20(12):3072-3074.DOI:10.3969/j.issn.1008-0805.2009.12.082

[11]Song Y, Lan W, Wu X, et al. Quantitative effects of Magnesium Chloride stress on aggregation of Sup35p in [psi-]yeast cells[J]. Protein Pept Lett, 2010, 17(12): 1489-1494. DOI:10.2174/0929866511009011489

[12]Song YT, Wu YX, Jung GM, et al. Role for Hsp70 chaperone inSaccharomycescerevisiaeprion seed replication[J]. Eukaryot Cell, 2005, 4(2): 289-297. DOI: 10.1128/ec.4.2.289279.2005

[13]Halfmann R, Lindquist S. Screening for amyloid aggregation by semi-denaturing detergent-agarose gel electrophoresis[J]. J Visualized Exp, 2008, (17): 1-3. DOI: 10.3791/838

[14]Zhong ZW. An improved semi-denaturin detergent agrose gel electrophoresis technique[J]. Guangzhou Chem Indust, 2012, 40(12): 77-79. DOI: 10.3969/j.issn.1001-9677.2012.12.029 (in Chinese)

鐘正偉.一種半變性瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)的改良[J].廣州化工,2012,40 (12):77-79. DOI:10.3969/j.issn.1001-9677.2012.12.029