左懷雨，王茂淋，邵宗澤，李光玉，徐　柳，喻子牛，張吉斌

(1.華中農業(yè)大學生命科學技術學院 農業(yè)微生物學國家重點實驗室 微生物農藥國家工程研究中心，湖北 武漢430070；2.國家海洋局第三海洋研究所 海洋生物遺傳資源重點實驗室，福建 廈門 361005)

β-1,3-1,4-葡聚糖是禾本科植物細胞壁的重要組成部分。β-1,3-1,4-葡聚糖酶(EC3.2.1.73)是解聚β-1,3-1,4-D-葡聚糖的活性最高的內切酶，屬于糖基水解酶16家族(GHF16)，可以精確水解和裂解地衣多糖或β-D-葡聚糖中位于β-1,3-糖苷鍵后的β-1,4-糖苷鍵。在啤酒發(fā)酵中，高分子量β-葡聚糖的殘留會導致啤酒原液黏度和濁度的增大[1]，黏度的增大會降低麥芽汁的過濾速率，而β-1,3-1,4-葡聚糖酶減小降低麥芽汁黏度。β-1,3-1,4-葡聚糖酶還被廣泛用作飼料添加劑，以大麥為主的飼料中添加β-1,3-1,4-葡聚糖酶，飼料的能量利用率可提高13%，蛋白質利用率提高21%[2]，顯著提高了飼料利用率。

β-1,3-1,4-葡聚糖酶主要存在于一些植物組織中，如大麥、稻米等[3]；另外，也來源于許多芽胞桿菌[3]，如Bacillussubtilis、Bacillusamyloliquefaciens、Bacilluslicheniformis、Bacilluscirculans等，以及一些瘤胃細菌[4]，如Ruminococcusflavofaciens、Bacteroidessuccinogenes、StreptococcusbovisJB1[5]等；最近，在一些真菌、高等植物中也有發(fā)現(xiàn)。

細菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶在不同的宿主細胞中的表達均有報道，如Escherichiacoli、Bacillusspp.、Saccharomycescerevisiae、Pichiapastoris以及轉基因大麥和煙草植物等。E.coli作為常規(guī)的原核表達宿主，常用于細菌基因的克隆和表達。Bacillusmojavensis1A00437是一株分離自太平洋的芽胞桿菌，其生長環(huán)境的特殊性使其具有特殊的研究價值。作者克隆了Bacillusmojavensis1A00437β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因并在大腸桿菌中進行表達，研究其酶學特點，以期獲得具有工業(yè)生產應用價值的葡聚糖酶。

1　實驗

1.1　材料與試劑

Bacillusmojavensis1A00437由國家海洋局第三海洋研究所提供；E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)、小麥紋枯病菌(RhizoctoniasolaniAG8)及水稻紋枯病菌(RhizoctoniasolaniKühn)，自行保存。

AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit、AxyPrepTMPCR Cleanup Kit，美國Axygen公司；Plasmid Midiprep Kit，北京莊盟國際生物基因科技有限公司；T4 DNA Ligase、Ex TaqTMPolymerase、RNase A、EcoRⅠ、NotⅠ，大連寶生物工程有限公司；pMD18-T、pET-28a，Takara公司；Yeast extract、Typtone，Oxiod公司；Agarose，Biowest公司；β-葡聚糖，Sigma公司；其它試劑均為國產分析純。

1.2　方法

1.2.1引物設計與合成

通過在NCBI數(shù)據(jù)庫上進行序列搜索及相似性比對，依據(jù)已登錄的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因序列設計兼并引物并委托Invitrogen公司合成。引物序列如下：

bgl1：5′-ATGTCTTATCGTATGAAACGAGT-3′；

bgl2：5′-TTATTTTTTTGTATARCGYA-3′；

R=A/G，Y=C/T。

1.2.2基因組DNA 的制備及基因克隆

Bacillusmojavensis1A00437基因組DNA 制備參照細菌DNA抽提試劑盒說明書進行。以基因組DNA 為模板進行PCR 擴增。程序如下：94 ℃預變性5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s；30 個循環(huán)后72 ℃延伸10 min。PCR 產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后回收并純化(按照AxyPrepTMPCR Cleanup Kit試劑盒說明書進行)?；厥债a物與pMD18-T 載體連接過夜，連接產物轉化Ca2+法制備的感受態(tài)細胞，37 ℃培養(yǎng)后菌落PCR 鑒定，陽性克隆質粒由上海英俊生物技術有限公司進行測序。

1.2.3序列分析

將測序得到的Bacillusmojavensis1A00437β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因序列用softberry、ORF finder等軟件分析其開放閱讀框，用BLASTEN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTEN)進行序列相似性比對，Moe軟件進行酶的結構模擬和關鍵作用位點的分析。

1.2.4原核表達

根據(jù)陽性克隆測序結果，設計β-1,3-1,4-葡聚糖酶成熟表達引物。在引物5′端加入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點，并委托Invitrogen公司合成。引物序列如下：

Fbgl1:5′-CCGGAATTCATGAGTTTGTCTGCAGTCACTTCTA-3′；

Rbgl2:5′-AATGCGGCCGCTTTTTTTGTATAGCGCACCCAG-3′。

以帶有目的基因的重組質粒為模板進行PCR 擴增。程序如下：94 ℃預變性5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s；30 個循環(huán)后72 ℃延伸10 min。PCR產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收純化，同時與載體pET-28a進行EcoRⅠ及NotⅠ雙酶切處理后于16 ℃連接過夜。轉化E.coliDH5α感受態(tài)細胞及BL21感受態(tài)細胞。選取陽性克隆，經(jīng)菌液PCR鑒定及雙酶切鑒定正確無誤后，以IPTG為誘導劑進行誘導表達，25 ℃誘導3 h。表達產物用SDS-PAGE檢測。

1.2.5表達產物的分離純化

大量誘導表達目的蛋白，4 ℃、5 000 r·min-1離心3 min收集菌體，去上清后加入1/10原培養(yǎng)液體積的Binding buffer懸浮細胞，超聲破碎。收集粗蛋白液，4 ℃、12 000 r·min-1離心30 min，吸取上清液于干凈的離心管中，用濾紙過濾后置于4 ℃?zhèn)溆?。蛋白純化按照GE公司的金屬鎳螯合瓊脂糖凝膠6FF操作手冊進行，SDS-PAGE 檢測各段收集樣品。對目的蛋白進行透析復性，用于后續(xù)實驗。

1.2.6β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力測定

酶活力單位定義：在40 ℃、pH值5.5條件下，每分鐘從濃度為5 mg·mL-1的β-葡聚糖溶液中釋放1 μmol還原糖所需的酶量定義為一個酶活力單位(1 U)。

將1 mL稀釋后的酶液和1 mL 8.0 g·L-1β-葡聚糖放入40 ℃水浴鍋平衡30 min。采用DNS法測定還原糖含量。

1.2.7β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶學性質

通過pH值為4.0～8.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液稀釋酶液測定最適pH值；pH值穩(wěn)定性通過β-1,3-1,4-葡聚糖酶在pH值5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的緩沖溶液中平衡不同時間(0 min,5 min,10 min,15 min,20 min,25 min,30 min)后測定，以0 min時的酶活為100% 酶活。稀釋酶液與8.0 g·L-1β-葡聚糖底物混勻，50 ℃反應30 min，用DNS法測定并計算相對酶活。

將稀釋酶液分別在20～100 ℃平衡30 min測定最適溫度；將稀釋酶液在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃中分別保溫0 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min后測定熱穩(wěn)定性，以0 min時的酶活為100% 酶活；將稀釋酶液與底物混合，50 ℃反應30 min，用DNS法測定并計算相對酶活。

金屬離子與化學試劑的影響測定：在酶促反應體系中分別加入終濃度為1 mmol·L-1的金屬離子(Zn2+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、K+、Ni2+、Mn2+、Fe2+、Li+、Na+)和化學試劑(EDTA、SDS)，以未加金屬離子和化學試劑的酶活為100% 酶活，用DNS法測定并計算相對酶活。

底物專一性測定：選取β-葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖、幾丁質作為底物并配制成濃度為8.0 g·L-1的溶液，用DNS法測定并計算各底物反應條件下的相對酶活。

1.2.8β-1,3-1,4-葡聚糖酶抗真菌活性測定

采用打孔對峙法，將病原真菌菌塊置于新鮮的固體培養(yǎng)基中央，并在培養(yǎng)基上用5 mm直徑打孔器均勻打孔6個，挑出瓊脂塊備用。待真菌菌絲生長至6個孔約1 cm處，吸取一定量的不同蛋白液和無菌水，分別加入到瓊脂平板已經(jīng)制備好的孔中。培養(yǎng)48 h，觀察抑制效果。

1.2.9β-1,3-1,4-葡聚糖酶對飼料消化率的影響

將麩皮、稻糠、玉米粉分別過100目篩，將稀釋后的酶液和相應的飼料底物混勻放入50 ℃水浴鍋平衡5 h。分別設置空白對照。通過DNS法測定還原糖含量，以確定β-1,3-1,4-葡聚糖酶對飼料消化率的影響。

2　結果與討論

2.1　bgl基因克隆

以Bacillusmojavensis1A00437的總DNA為模板，經(jīng)PCR擴增得到目的片段，約為700 bp(圖1)，與預測的大小相符。擴增后得到的PCR產物經(jīng)過純化后與pMD-18T載體連接，轉化E.coliDH5α，菌落生長后經(jīng)菌落PCR驗證(圖2)，結果正確。

2.2　bgl序列分析

將測序得到的基因序列用softberry(http://linux1.softberry.com/berry.phtml)、ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)等軟件分析其開放閱讀框，最后確定該酶基因的ORF為681 bp；NCBI序列比對后構建進化樹(圖3)，分析Bacillusmojavensis來源的bgl基因的同源性。

M.DL 20001,2.target gene

圖1Bacillusmojavensis1A00437中bgl基因的克隆

Fig.1bglGeneclonedinBacillusmojavensis1A00437

M.DL 2000 1～6.different colonies verified by colony PCR

圖3　β-1,3-1,4-葡聚糖酶的序列進化樹

由圖3可以看出，Bacillusmojavensis來源的bgl基因與Bacilluslicheniformis來源的bgl基因具有高度的相似性，可達99%。

通過對氨基酸序列的分析，確定該酶屬于糖基水解酶16家族成員，理論pH值為6.05，蛋白大小為25.3 kDa，β-1,3-1,4-葡聚糖酶的保守區(qū)域為E-[LIV]-D-[LIVF]-x(0,1)-E-x(2)-[GQ]-[KRNF]-x-[PSTA],其中2個E是關鍵作用位點，本研究中酶的保守區(qū)域為EIDIEFLGKDT，2個通過粗體標明的E為該酶的活性位點氨基酸。該酶的保守區(qū)域和活性位點氨基酸如圖4所示。其中，保守區(qū)域以灰色表示，活性位點為Glu 133和Glu 137。

A.the front of substrate binding pocket

2.3　目的基因亞克隆

分別使用限制性內切酶EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切pMD18-T-bgl(E,N)和表達載體pET28a，然后將含有酶切位點的目的基因bgl和載體片段進行連接，得到重組質粒pET28a-bgl(E,N)。構建好的載體圖譜如圖5所示。

圖5　重組質粒pET28a-bgl(E,N)的構建

將構建好的pET28a-bgl(E,N)用EcoRⅠ和NotⅠ進行雙酶切驗證，結果見圖6。

由圖6可知，pET28a-bgl(E,N)經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后得到大小約為681 bp的bgl基因片段和大小約為5.3 kb的載體片段。載體測序結果表明，所有的目的基因在重組質粒中的克隆方向、插入位點和閱讀框架正確。

M.DL20001,2.double-digest of pET28a-bgl(E,N)

圖6重組質粒pET28a-bgl(E,N)雙酶切

Fig.6DoubledigestionofrecombinantexpressionvectorpET28a-bgl(E,N)

2.4　β-1,3-1,4-葡聚糖酶分離純化(圖7)

M.DL2000　1.the whole proteins of Bgl not-induced by IPTG

2.the whole proteins of Bgl induced by IPTG at 25 ℃3.purity protein

圖7SDS-PAGE分析Bgl蛋白的表達

Fig.7AnalysisofBglproteinexpressionbySDS-PAGE

由圖7可知，經(jīng)IPTG誘導表達后，利用His標簽分離純化后得到目的蛋白，融合表達的目的蛋白的大小與預測大小相近。

2.5　β-1,3-1,4-葡聚糖酶的生物學特性

2.5.1pH值對β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力和穩(wěn)定性的影響(圖8)

由圖8a可知，β-1,3-1,4-葡聚糖酶在pH值6.5的反應體系中具有最高的酶活力。

由圖8b可知，β-1,3-1,4-葡聚糖酶在pH值5.0～7.0 的反應體系中保持70% 以上的酶活力，并且在pH值5.5的反應體系中相對酶活最高達到100%以上。

2.5.2溫度對β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力和穩(wěn)定性的影響(圖9)

圖8pH值對β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力(a)和穩(wěn)定性(b)的影響

Fig.8EffectofpHvalueonactivity(a)andstability(b)ofβ-1,3-1,4-glucanase

由圖9a可知，β-1,3-1,4-葡聚糖酶在60 ℃時具有最高的酶活力。

由圖9b可知，β-1,3-1,4-葡聚糖酶在40～50 ℃區(qū)域內保溫60 min后酶活力保持在80%以上；但當溫度提高到60 ℃時，隨著保溫時間的延長酶活力發(fā)生波動，60 min后酶活力下降到30%以下。表明該酶在40～50 ℃時比較穩(wěn)定，而在70～80 ℃時，酶活力在10 min內迅速下降到30%以下，極不穩(wěn)定。

2.5.3金屬離子及化學試劑對β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力的影響(圖10)

圖10　金屬離子和化學試劑對β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力的影響

由圖10可知，Ni2+和Fe2+顯著增強酶活力，Cu2+、Ca2+、Mn2+對酶活力有明顯的抑制作用，其余金屬離子和化學試劑對酶活力無顯著影響。

2.5.4β-1,3-1,4-葡聚糖酶底物專一性測定(表1)

表1不同底物的酶活力/(U·mL-1)

Tab.1Theenzymeactivityofdifferentsubstrates/(U·mL-1)

底物名稱β?葡聚糖木聚糖甘露聚糖幾丁質酶活力16400001700200021

由表1可知，木聚糖、甘露聚糖、幾丁質與β-葡聚糖相比，酶解效率極低，表明β-1，3-1，4-葡聚糖酶具有嚴格的底物專一性。

2.6　β-1,3-1,4-葡聚糖酶的功能研究

2.6.1β-1,3-1,4-葡聚糖酶抗真菌活性測定(圖11)

由圖11可知，β-1,3-1,4-葡聚糖酶對小麥紋枯病菌及水稻紋枯病菌菌絲的生長有顯著的抑制作用。

2.6.2β-1,3-1,4-葡聚糖酶對飼料消化率的影響(表2)

由表2可知，β-1,3-1,4-葡聚糖酶對稻糠、玉米粉具有一定的降解作用，能夠分解其細胞壁結構，利于飼料釋放其內容物，以提高飼料的能量利用率。該實驗為β-1,3-1,4-葡聚糖酶用作飼料添加劑提供了理論基礎。

A.水稻紋枯病菌　B.小麥紋枯病菌

表2β-1,3-1,4-葡聚糖酶降解飼料效果

Tab.2Feeddigestionresultsofrecombinantβ-1,3-1,4-glucanase

飼料稻糠玉米粉麩皮還原糖得率/%12716304

2.7　討論

邱思鑫等[6]研究發(fā)現(xiàn)，0.1～0.5 mmol·L-1的Ca2+對β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力有顯著促進作用，0.2～0.4 mmol·L-1Fe2+可提高該酶的酶活力。謝焱等[7]研究發(fā)現(xiàn)，10 mmol·L-1的 Ca2+對β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力無顯著影響，10 mmol·L-1的Fe2+對該酶的酶活力有顯著的抑制作用。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，1 mmol·L-1Ca2+對酶活力有明顯的抑制作用，1 mmol·L-1Fe2+對酶活力有顯著促進作用。另外，Ni2+也可顯著增強酶活力。造成這些差異的原因可能與菌株的生長環(huán)境相關，較特殊的海洋環(huán)境影響了菌株的某些遺傳特性，在實際應用中可通過調節(jié)金屬離子濃度提高酶活力。

姚烏蘭等[8]從多粘類芽孢桿菌WY110(Paenibacilluspolymyxastrain WY110)菌株中分離純化出一種β-1,3-1,4-葡聚糖酶P2蛋白，該酶具有抗稻瘟病菌的活性，而重組酶對稻瘟病菌無抗性，但對小麥紋枯病菌及水稻紋枯病菌具有明顯抑制作用。P2蛋白與本研究中的重組酶相似性為77%，保守區(qū)域序列相同，不同之處應為蛋白結構序列。另有文獻報道[9]，重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶對尖孢鐮刀菌、香蕉炭疽病菌、荔枝炭疽病菌以及出芽短梗霉的菌絲生長具有明顯的抑制活性。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，多數(shù)β-1,3-1,4-葡聚糖酶具有相同的保守區(qū)域及活性氨基酸，其功能不同可能是其蛋白結構不同造成的。造成該重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶具有不同抗真菌活性的原因可能為酶的結構、底物專一性不同。另外，該重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶對稻糠、玉米粉飼料具有一定的降解效果。

3　結論

參考文獻：

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[6]邱思鑫，范曉靜，胡方平，等.內生解淀粉芽胞桿菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bglS)的克隆與表達及酶學特性分析[J].農業(yè)生物技術學報,2010，18(6):1173-1181.

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[8]姚烏蘭，王云山，韓繼剛，等.水稻生防菌株多粘類芽孢桿菌WY110抗菌蛋白的純化及其基因克隆[J].遺傳學報，2004，(9):878-887.

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