■劉少文 柏 凡 郭春華 柏 雪 張正帆 彭忠利 方思敏

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041；2.農(nóng)業(yè)部飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（成都），四川成都610041）

霉菌毒素是霉菌在生長繁殖過程中產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物，毒性極強(qiáng)，能抑制機(jī)體免疫、抑制造血，對肝臟和腎臟造成較大危害[1]。全球每年因霉菌毒素造成的損失達(dá)數(shù)百萬美元[2]。因此，如何消除霉菌毒素的潛在威脅成為當(dāng)前飼料研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。自20世紀(jì)90年代，畜牧業(yè)開始利用飼料霉菌毒素吸附劑如硅鋁酸鹽類、酯化甘露聚糖等去除霉菌毒素，取得了一定的效果。但這類吸附劑容易吸附其他營養(yǎng)元素并造成環(huán)境蓄積性污染。本世紀(jì)初，利用微生物及產(chǎn)物酶來降解飼料霉菌毒素引起廣泛關(guān)注，但這類解毒劑也存在一系列問題尚未解決。如一些次級代謝產(chǎn)物可能有毒害作用，絕大多數(shù)微生物解毒機(jī)理尚不明確。目前市場上這兩類產(chǎn)品都存在良莠不齊的問題，原因之一就是沒有相關(guān)的國家標(biāo)準(zhǔn)來對其進(jìn)行評價(jià)。因此，建立霉菌毒素解毒劑和吸附劑的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)迫在眉睫，這對規(guī)范市場和指導(dǎo)用戶消費(fèi)十分重要。

1 霉菌毒素吸附劑

1.1 硅鋁酸鹽類(HSCAS)吸附劑

HSCAS類吸附劑主要有：黏土、膨潤土、蒙脫石、沸石、水合硅鋁酸鹽等。它是利用強(qiáng)大的比表面積與靜電吸引力吸附有離子極性的霉菌毒素，具有一定的選擇性。研究發(fā)現(xiàn)，HSCAS對黃曲霉毒素（Aflatoxin，AF）有較好的吸附能力[3]。Shebl等[4]在1日齡羅斯雞日糧中同時(shí)添加0.2%的HSCAS和211.88 μg/kg的AF，結(jié)果檢測到AF殘留顯著減少，且肝臟中不正常染色體數(shù)目比不添加HSCAS的AF飼料下降20%。Nuryono等[5]在體外試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，膨潤土和沸石可以吸附99%AFB1。但HSCAS類吸附劑對玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)、赭曲霉毒素A（Ochratoxin，OTA）、單端孢類毒素(Trichothecenes)等吸附效果不理想，同時(shí)也會(huì)吸附飼料中其他營養(yǎng)物質(zhì)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，對此類產(chǎn)品進(jìn)行改性，可以提高其毒素吸附力，減少對營養(yǎng)素的吸附。

1.2 酵母提取物

酵母提取物主要是指酵母細(xì)胞壁的提取物，包含β-葡聚糖、甘露寡糖、糖蛋白、脂類等。酵母細(xì)胞壁中的這些功能性碳水化合物可以通過氫鍵、離子鍵等結(jié)合多種霉菌毒素。Girgis等[7]發(fā)現(xiàn)，高分子葡甘聚糖作為霉菌毒素吸附劑時(shí)，不僅對嘔吐毒素(Deoxynivalenol,DON)和ZEN有一定吸附作用，而且對肉雞免疫功能有一定調(diào)節(jié)作用；Diaz-Llano等[8]證明葡甘聚糖吸附劑對采食了鐮刀霉菌毒素（Fusarium）污染飼糧的妊娠母豬有一定解毒作用，但Leung[9]在獵犬上和Chowdhury等[10]在蛋雞上得到的結(jié)果卻相反。Faixová等[11]利用改性葡甘聚糖作肉雞霉菌毒素吸附劑，發(fā)現(xiàn)它對ZEN有很大的清除作用，但在斷奶仔豬上效果可能不太明顯[12]。

1.3 活性炭

活性炭是一種多孔不溶性粉末狀物質(zhì)，含有大量微孔，比表面積可達(dá)500～3 500 m2/g[13]。活性炭在體外試驗(yàn)中對霉菌毒素具有較好的吸附解毒作用。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2%活性炭可將腸道內(nèi)DON的吸收率從51%降低到28%，對瓜蔞鐮菌醇(NIV)吸收率從21%降低到12%[14]。但在體內(nèi)試驗(yàn)中卻得到不同的結(jié)論，這可能是由于活性炭不是選擇性吸附，易造成吸附飽和的原因[15]。在利用活性炭作霉菌毒素吸附劑時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎使用。例如，添加活性炭會(huì)不同程度地使飼料變黑，影響商業(yè)價(jià)值，同時(shí)飼料中維生素、礦物元素等也會(huì)被一定程度的吸附。

1.4 其他吸附劑

除上述幾種常見的吸附劑外，一些新的霉菌毒素吸附劑不斷被發(fā)現(xiàn)，如消膽胺(Cholestyramine)、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)和酯化萄甘露聚糖(EGM)等[16]。這類新型飼料霉菌毒素吸附劑可緩解霉菌毒素對動(dòng)物機(jī)體造成的不良反應(yīng)，并提高動(dòng)物生長性能，能夠?qū)暳现袪I養(yǎng)成分和藥物的吸附降到最低。

2 霉菌毒素吸附劑的評價(jià)

市場上的霉菌毒素吸附劑形式多樣。然而，至今還未發(fā)現(xiàn)某一種吸附劑對所有霉菌毒素都有較好的吸附效果。另外，霉菌毒素吸附劑還存在一系列問題尚未解決。如動(dòng)物將吸附劑吸附的毒素排出體外會(huì)污染環(huán)境，吸附劑過量添加會(huì)影響生產(chǎn)性能。因此，我們迫切需要一種合理的霉菌毒素脫毒劑評價(jià)方案。

2.1 方法選擇

霉菌毒素吸附劑的評價(jià)應(yīng)包括體外試驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)。

2.1.1 體外試驗(yàn)

體外試驗(yàn)可以作為評價(jià)霉菌毒素吸附劑的第一步，通常按照下列步驟進(jìn)行：A、吸附試驗(yàn)：①配制霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)液并加入一定量的待測吸附劑。②尋求最適反應(yīng)pH值和溫度。pH值范圍較廣，一般在3～8之間，其中pH值為7時(shí)應(yīng)用較多；溫度為20～(37±1)℃，國內(nèi)研究者大多將溫度設(shè)置在(37±1)℃，而國外學(xué)者大多設(shè)置溫度為室溫；振蕩反應(yīng)1 h后2 000～1 000 r/min下離心10 min。③測定上清液中霉菌毒素的含量。測定方法有薄層層析法（TLC）、色譜法、免疫化學(xué)檢測法（主要是ELISA法）以及高效液相色譜法(HPLC)等。根據(jù)吸附前后的霉菌毒素濃度差可以計(jì)算出該吸附劑的吸附率。B、解吸試驗(yàn)：待吸附反應(yīng)結(jié)束后，傾去離心管上清液，沉淀中加入一定量的水溶液，pH值約為6.8，搖床振蕩解吸1 h，然后在一定轉(zhuǎn)速下離心，測定上清液中霉菌毒素的含量，計(jì)算出解吸率[17]。然而，體外實(shí)驗(yàn)并不能代表動(dòng)物體內(nèi)復(fù)雜的理化環(huán)境，因此在體外實(shí)驗(yàn)后還應(yīng)該進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)對其研究評價(jià)。

2.1.2 體內(nèi)試驗(yàn)

進(jìn)行動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)。在動(dòng)物霉變?nèi)占Z中添加吸附劑飼喂動(dòng)物一段時(shí)間，考察生產(chǎn)性能，如死亡率、采食量、體增重和飼料轉(zhuǎn)化效率等，再進(jìn)一步檢測吸附劑對霉菌毒素造成的組織損失的改善效果，如反映免疫功能的血清總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLOB），反映肝臟功能和蛋白質(zhì)代謝的尿酸（UA）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、淀粉酶(AMY)、堿性磷酸酶(ALP)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)酶活和反應(yīng)應(yīng)激氧化功能的NO含量、超氧化物歧化酶(SOD)酶活等血液生化指標(biāo)；組織病理切片；淋巴細(xì)胞凋亡情況等。同時(shí)還應(yīng)對畜產(chǎn)品中霉菌毒素的殘留量和糞便中霉菌毒素的排出量進(jìn)行檢測，以此來整體評價(jià)霉菌毒素的吸附效果。如Raymond等[18]分別用自然霉變?nèi)占Z和添加0.2%酵母細(xì)胞壁的霉變飼糧飼喂母馬，3周后發(fā)現(xiàn)添加0.2%酵母細(xì)胞壁組較霉變?nèi)占Z組母馬采食量和日增重極顯著提高(P=0.004)，血清中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活性極顯著下降(P＜0.01)，IgG、IgA和IgM無顯著差異。

2.2 評價(jià)指標(biāo)

評價(jià)指標(biāo)包括吸附的廣譜性與專一性、穩(wěn)定性、耐受性和安全性等。①廣譜性與專一性。理想的吸附劑具有廣譜的霉菌毒素吸附特性，現(xiàn)有的吸附劑一般只針對某一類霉菌毒素，如HSCAS類吸附劑對AFT吸附能力最強(qiáng)，而對ZEN、OTA吸附較弱。理想的吸附劑同時(shí)不能吸附飼料中任何營養(yǎng)成分，如維生素、氨基酸等[19]。②穩(wěn)定性。理想吸附劑具備熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、耐儲(chǔ)藏的特點(diǎn)，某些改性后的吸附劑要保證自身物理性質(zhì)穩(wěn)定，不隨環(huán)境改變而大幅度破壞自身結(jié)構(gòu)，否則失去改性意義。③耐受性。過去認(rèn)為吸附劑一般對動(dòng)物沒有明顯毒性，但最近研究表明，動(dòng)物對于吸附劑仍有一定耐受劑量，超過劑量則有負(fù)面影響。如雜交鱘對蒙脫石的耐受劑量一般為2.5%，超出此范圍，將會(huì)導(dǎo)致肝血竇腔隙明顯增大，肝臟實(shí)質(zhì)組織溶解[20]；奶牛日糧中蒙脫石的推薦添加量為0.5%，超出安全限量，則會(huì)降低生產(chǎn)性能[21]；羊日糧中HSCAS超過2%會(huì)降低飼料中鎂、錳和鋅的生物利用率[22]。④安全性。安全性評價(jià)應(yīng)該滿足兩點(diǎn)：吸附劑自身安全性和對環(huán)境的安全性。吸附劑在生產(chǎn)過程中要減少和避免重金屬的污染，動(dòng)物排泄出來的吸附劑-霉菌毒素復(fù)合物能快速被微生物降解，且不產(chǎn)生有毒產(chǎn)物。

以上研究方法表明，可以通過體外試驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)以及動(dòng)物的生理指標(biāo)來評價(jià)霉菌毒素吸附劑，為了對其作出更深入的評價(jià)，還應(yīng)測定吸附劑的各類特性，如果吸附劑對霉菌毒素的吸附效果良好，那么這類特性應(yīng)符合上述指標(biāo)。

3 霉菌毒素生物解毒劑

霉菌毒素生物解毒劑是指可以降解霉菌毒素的微生物、中草藥或酶制劑，它能將霉菌毒素徹底分解成無毒物質(zhì)，不會(huì)對環(huán)境造成負(fù)面影響。目前，國內(nèi)外報(bào)道已有上千種微生物可以降解飼料中的霉菌毒素，市面上也出現(xiàn)了各類商品化的解毒產(chǎn)品。

3.1 真菌解毒劑類

早在20世紀(jì)80年代，人們就發(fā)現(xiàn)了真菌可以去除霉菌毒素。如部分霉菌和部分食用真菌能降解黃曲霉毒素（Aflatoxin,AFT）。釀酒酵母經(jīng)熱處理后對赭曲霉毒素（Ochratoxin,OTA）的解毒能力會(huì)優(yōu)于活細(xì)胞，是一類應(yīng)用價(jià)值較大的生物脫毒劑之一[23]。Molnar O等[24]從白蟻腸道中分離到毛孢子菌屬（Trichosporon）中的一個(gè)成員，該菌株可在24 h內(nèi)將玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)降解成CO2或者其他無毒代謝物。此外能夠降解霉菌毒素的真菌類微生物（包括產(chǎn)物酶）還包括：膠紅類酵母菌（Rhodotoruia glutinis），曲霉菌屬（Aspergillus sp.）中的黃曲霉、寄生曲霉、少根曲霉等，莖點(diǎn)霉菌屬（Phoma sp.）和孢霉（Dactyliumdendroide），食用真菌糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）和假密環(huán)菌（Armillariella tabescens）[25-26]。

3.2 細(xì)菌解毒劑類

許多益生菌或其代謝產(chǎn)物能抑制霉菌生長，解除毒素或使毒素合成量顯著減少。Sezer[27]將乳酸菌（Lactobacillus）和乳酸菌素與AFB1混合后培養(yǎng)，通過PCR方法確認(rèn)細(xì)菌與細(xì)菌素的存在，經(jīng)ELISA試劑盒檢測AFB1的濃度，發(fā)現(xiàn)AFB1下降90%。然而，目前國內(nèi)外對細(xì)菌生物降解AFT的報(bào)道并不多見，主要有橙色黃桿菌(Flavobacterium aurantiacum)、分支桿菌(Mycobacterium fluoranthenivorans)和紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)[28]。Bakutis B 等[29]分離出的膠紅類酵母菌（Rhodotorula glutinis）可將玉米飼料中的ZEN毒素在10 d內(nèi)從2.20 mg/kg降至0.30 mg/kg。此外，能夠生物降解霉菌毒素的細(xì)菌[30]（包括產(chǎn)物酶）還有：橙紅色黏球菌（Myxococcus fulvus）、嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）、炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis）、纖維菌（Cellulosimicrobiumsp.）、短波單胞菌（Brevundimonas sp.）、小諾卡氏菌(Nocardiaasteroides)等。

3.3 解毒酶

某些微生物代謝產(chǎn)生的酶能有效分解霉菌毒素。但由于微生物降解酶的分離純化過程復(fù)雜、機(jī)理不明確、酶的活性不穩(wěn)定、酶作用條件苛刻等原因，這類脫毒劑還較難應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。目前，主要的高效解毒酶類型有蛋白水解酶、內(nèi)酯水解酶和氧化酶等[31]。不同來源的解毒酶降解效率不相同，例如，來源于白腐真菌的真菌漆酶和來源于真菌假密環(huán)菌的AFT解毒酶（ADTZ），能夠降解AFT，降解率分別為55%[32]和22.52%[33]。近年來解毒酶是較為熱門的研究領(lǐng)域，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)解毒酶將是未來發(fā)展方向之一。

3.4 植物提取物

植物及其提取物對霉菌生長也具有抑制作用，如菊花腦揮發(fā)油對霉菌菌絲生長有抑制作用，菌株培養(yǎng)前2 d幾乎沒有生長，此后生長緩慢[34]；嚴(yán)贊開分別用濃度為0.062 5%、0.125%、0.25%、0.50%、1.0%、2.0%和4.0%的生姜提取物對霉菌生長進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度為3.0%時(shí),生姜提取物對所有菌株的生長抑制作用最強(qiáng)，說明其具有廣譜抑菌性[35]；同時(shí)有研究表明，金銀花對飼料中霉菌也有一定抑制效果[36]。

4 霉菌毒素解毒劑的評價(jià)

霉菌毒素解毒劑同霉菌毒素吸附劑一樣，也應(yīng)同時(shí)進(jìn)行體外和體內(nèi)試驗(yàn)，方法與吸附劑相同。

4.1 解毒微生物的評價(jià)

近年來，越來越多的微生物被發(fā)現(xiàn)可以降解飼料中的霉菌毒素，這些微生物的安全高效性可從以下幾方面進(jìn)行合理評價(jià)：①菌株的安全性。這是至關(guān)重要的評價(jià)指標(biāo)，雖然任何菌株的安全性都是相對的，但作為霉菌毒素解毒劑時(shí)，不應(yīng)該產(chǎn)生任何有毒代謝產(chǎn)物[37]。②菌株的高效性。理想的霉菌毒素降解菌株是高效、環(huán)保和易保存的。趙麗紅等從健康魚腸道中分離篩選到1株黃曲霉毒素降解菌（霉立解菌，MLJ060菌），其發(fā)酵液對AFB1降解率達(dá) 81%，每升MLJ060菌發(fā)酵液干燥后可得到0.9 g干物質(zhì)，其中活菌含量約為1×109CFU/g[38]。③生物工程菌的安全性?；蛐揎椙昂蟮纳锕こ叹诓±韺W(xué)、毒理學(xué)或致敏性方面都應(yīng)該是安全的，這是必要的評價(jià)指標(biāo)。必須考慮基因工程改造可能給原有菌株的內(nèi)源基因表達(dá)造成影響，基因組的變化可能導(dǎo)致包含產(chǎn)生毒素信息的基因表達(dá)的增強(qiáng),或者改變某些生物分子合成或代謝酶的基因表達(dá)[39]。

4.2 解毒酶的評價(jià)

解毒酶的酶活不穩(wěn)定、酶作用條件苛刻限制了其應(yīng)用范圍。因此，研究者需從多方位評估霉菌毒素解毒劑。以下幾點(diǎn)是評估方案中不可缺少的：①解毒酶的安全性。理想的解毒酶是安全、高效,對飼料無污染、有高度的選擇性。英國化學(xué)毒性委員會(huì)(COT)建議微生物解毒酶至少要做90 d的老鼠喂養(yǎng)試驗(yàn)，并以高標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行生物分析。COT認(rèn)為菌種改良是必要的，但每次改良后應(yīng)作生物安全檢測[40]。②產(chǎn)物的安全性。毒素降解后應(yīng)該被破壞或轉(zhuǎn)化成無毒化合物，且這種改變是永久性的[41]；同時(shí)產(chǎn)生的這些無毒化合物不可以影響飼料的營養(yǎng)價(jià)值和適口性。③降解酶的廣譜性、高效性、專一性、穩(wěn)定性以及酶活的寬適應(yīng)性也是必要的評價(jià)指標(biāo)。

5 小結(jié)

飼料受霉菌毒素的污染越來越嚴(yán)重，尋找合適有效的控制方法是畜牧業(yè)發(fā)展的當(dāng)務(wù)之急。在飼料中添加霉菌毒素脫毒劑能有效減輕這種污染。然而，遺憾的是目前市場上還沒有出現(xiàn)一種理想的脫毒劑符合生產(chǎn)要求。因此，除了對霉菌毒素脫毒劑進(jìn)行研究外，建立一種快速、簡便、有效、可行的霉菌毒素脫毒劑評價(jià)方案也是很有必要的。