厲吉霞，王延桂，夏西燕，李曙晨，吳海霞，莊學(xué)偉

(1煙臺(tái)市煙臺(tái)山醫(yī)院，山東煙臺(tái)264001;2濟(jì)南護(hù)理職業(yè)學(xué)院; 3山東大學(xué)齊魯醫(yī)院)

自然流產(chǎn)為常見(jiàn)疾病，發(fā)病原因較多，其中染色體異常尤其是數(shù)目異常引起者占50%以上［1］。熒光原位雜交(FISH)技術(shù)是一種具有高度靈敏性和特異性的染色體和基因分析技術(shù)，可選擇的標(biāo)本范圍廣泛(包括胎盤絨毛、羊水、臍血、孕婦外周血及宮頸沖洗液)，目前廣泛用于染色體異常的產(chǎn)前診斷，并逐步發(fā)展到植入前遺傳學(xué)診斷。2011年8月～2014年1月，我們應(yīng)用FISH技術(shù)對(duì)45例不明原因流產(chǎn)患者進(jìn)行了13/16/18/21/22/X/Y染色體數(shù)目異常檢測(cè)，旨在為分析自然流產(chǎn)原因提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 同期收治的不明原因自然流產(chǎn)者42例，年齡23～37歲(平均28歲)，妊娠時(shí)間6～20+6周。其中首次流產(chǎn)29例、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)13例(2次流產(chǎn)9例、3次以上流產(chǎn)4例)。42例均留取胎盤絨毛組織待檢。

1.2 染色體數(shù)目檢測(cè) 采用13/16/18/21/22/X/Y染色體數(shù)目檢測(cè)試劑盒 GLP13/GLP21、GLP16/ GLP22、CSP18/CSPX/CSPY。具體步驟:①玻片制備:檢測(cè)標(biāo)本以生理鹽水洗凈后剪碎，置于5 mL濃度為0.075 mmol/L的KCl低滲溶液中，37℃水浴20 min;緩慢加入固定液2 mL，吹打混勻后1 500 r/ min離心10 min，去上清后再重復(fù)2次，離心后去上清，于沉淀物中加1～2 mL冰醋酸，消化1 min后制備成細(xì)胞懸液滴片，于56℃老化玻片2 h以上。②玻片預(yù)處理及變性雜交:室溫下，將玻片于2×SSC溶液中漂洗5 min，37℃下于0.08 mg/mL胃蛋白酶中消化5 min，再于2×SSC溶液中漂洗5 min，依次在70%、85%、100%的梯度乙醇中脫水各3 min，干燥;探針在雜交儀共變性(75℃，5 min)，雜交(42℃，16 h)。③玻片洗滌:2×SSC溶液中洗滌10 min，轉(zhuǎn)入0.1%的NP-40洗滌5 min，用70%乙醇洗滌3 min。④復(fù)染:用聯(lián)咪二苯吲哚(DAPI)復(fù)染。⑤結(jié)果判讀:每組探針計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，正常細(xì)胞＞90%提示指標(biāo)正常、異常細(xì)胞＞60%提示指標(biāo)異常，介于兩者之間者加大計(jì)數(shù)再判定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用簡(jiǎn)明統(tǒng)計(jì)(CS14.0)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。率的比較行χ2檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

42例中18例(42.85%)檢測(cè)出染色體數(shù)目異常，其中三體型異常8例(19.04%)，包括13三體1例(2.38%)、16三體5例(11.90%)、22三體2例(4.76%)，未見(jiàn)18三體及21三體;三倍體異常3例(7.14%);四倍體異常2例(4.76%);單倍體異常5例(11.91%)，其中X單體4例、21單體1例。首次流產(chǎn)和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)者中分別有11例(37.93%)、7例(53.85%)檢測(cè)出染色體數(shù)目異常，兩者比較，P＜0.05(χ2=5.153)。

3 討論

FISH技術(shù)為新興的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，其原理是利用熒光標(biāo)記的DNA探針與被檢測(cè)樣本中DNA堿基對(duì)的互補(bǔ)性，在探針與樣本DNA雜交后，通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)熒光信號(hào)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞、組織樣本中的染色體或基因異常。FISH技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是可在獲得羊水24 h內(nèi)(無(wú)需培養(yǎng))得到關(guān)于13、18、21、X、Y的染色體數(shù)目信息。此外，該技術(shù)對(duì)于樣本的要求比較低，對(duì)羊水量少、羊水活細(xì)胞數(shù)目少、孕周偏大、細(xì)胞培養(yǎng)失敗、核型結(jié)果難以判讀等各種原因?qū)е潞诵头治鍪≌呔蛇M(jìn)行針對(duì)性彌補(bǔ)檢測(cè)。因此，F(xiàn)ISH技術(shù)拓展了細(xì)胞遺傳學(xué)的檢測(cè)范圍、提高了細(xì)胞遺傳學(xué)識(shí)別異常的能力，可彌補(bǔ)核型檢測(cè)失敗的缺陷。

懷孕早期自然流產(chǎn)者中有50%～60%存在染色體異常［1～5］，主要是染色體數(shù)目異常(染色體結(jié)構(gòu)異常者＜5%)，其中16三體是最為常見(jiàn)的染色體數(shù)目異常類型［6，9］，13、14、15、18、21、22三體較少，1、5、9三體僅有個(gè)例報(bào)道［6～8］。本研究顯示，42例中染色體數(shù)目異常者占42.85%，與文獻(xiàn)［2，5］報(bào)道的43.33%～44.40%基本相符;國(guó)外也有報(bào)道在53%～54%，考慮與樣本取材及樣本量有關(guān)。在人類常染色體中，除13號(hào)染色體外，其他染色體均存在三體型病例;染色體多態(tài)性研究表明，約75%的常染色體三體源于女性第一次減數(shù)分裂不分離的染色體，而三體型異常最多見(jiàn)的是16三體，其次是22、21、15、14三體。本研究顯示，染色體數(shù)目異常以三體型最多(占19.04%)，其中16三體比例最高，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。說(shuō)明染色體非整倍體畸變是導(dǎo)致胚胎流產(chǎn)的主要原因之一。三倍體的每號(hào)染色體均為3條，約80%為雙精子受精，少數(shù)是二倍體卵子或二倍體精子受精，其胚胎有69XXX、69XXY、69XYY三種核型，大多數(shù)生長(zhǎng)緩慢，一般在孕15周前流產(chǎn)，本組發(fā)生率為7.14%。單倍體異常指細(xì)胞染色體總數(shù)為45，缺少的染色體主要見(jiàn)于性染色體，目前所知的惟一常染色體單體是21單體;45，X核型是自然流產(chǎn)中較常見(jiàn)的染色體異常(10%～20%)，本組占8.89%;四倍體一般少見(jiàn)，由合子早期有絲分裂失敗所致，胚胎常在早期流產(chǎn)，本組發(fā)生率為4.76%，比例最低。此與文獻(xiàn)［5］報(bào)道相符。

有關(guān)流產(chǎn)次數(shù)與胚胎染色體異常發(fā)生率關(guān)系的研究［9～11］結(jié)論不一。本研究顯示，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)者染色體數(shù)目異常率顯著高于首次流產(chǎn)者。提示自然流產(chǎn)的次數(shù)與胚胎染色體數(shù)目異?？赡苡嘘P(guān)。染色體結(jié)構(gòu)異常是染色體斷裂和重排的結(jié)果，一般比例＜5%［1，3］。本研究所使用的探針不具有基因定位功能，但如選擇合適的探針可實(shí)現(xiàn)對(duì)染色體結(jié)構(gòu)異常的診斷。因此。FISH技術(shù)雖是常規(guī)核型分析技術(shù)的必要補(bǔ)充，但不可能完全代替常規(guī)染色體核型分析，其還有待于進(jìn)一步發(fā)展和完善。

綜上所述，自然流產(chǎn)者胎盤絨毛染色體數(shù)目異常率較高(尤以復(fù)發(fā)性流產(chǎn)者為著)，F(xiàn)ISH技術(shù)檢測(cè)染色體數(shù)目有助于某些疾病的產(chǎn)前診斷。

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